Name: Visualização de Pseudomonas aeruginosa no Escarro de Pacientes com Fibrose Cística (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprenda a visualizar Pseudomonas aeruginosa e o polissacarídeo Psl no escarro de pacientes com fibrose cística. Este protocolo utiliza hibridização in situ e microscopia confocal para estudar a organização espacial bacteriana.

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Os autores gostariam de agradecer à Cystic Fibrosis Foundation que forneceu financiamento para esta pesquisa e à MedImmune por sua generosa doação de anticorpos anti-Psl0096. Para este estudo, as imagens foram realizadas no centro de imagens CAMiLoD da Universidade de Toronto.

A aprovação do Conselho de Ética em Pesquisa (CEP) é necessária para coletar e armazenar amostras de escarro de seres humanos. Os estudos aqui apresentados foram aprovados pelo Hospital for Sick Children REB#1000058579.
1. Coleta de Escarro
<ol><li>Armazenar o escarro expectorado em um copo de coleta estéril e armazenar imediatamente a 4 °C por um máximo de 24 h antes da fixação. NOTA: Deixar o escarro demasiado tempo a 4 °C sem fixação pode levar à degradação celular, particularmente degradação dos glóbulos brancos. A fixação o mais rápido possível é preferível.</li>
	<li>Transferir as amostras de escarro para um tubo estéril de 15 mL.</li>
	<li>Adicionar um volume igual de paraformaldeído (PFA) a 4% às amostras de escarro. Por exemplo, se a amostra de escarro for de 0,5 mL, adicionar 0,5 mL de PFA a 4%. Misture por inversão suave.</li>
	<li>Incubar o escarro durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Lavar a amostra adicionando 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a cada 2 mL de escarro fixo. NOTA: Não é necessária centrifugação para esta etapa de lavagem.</li>
	<li>Retire cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta. NOTA: Evite sugar o escarro com a pipeta, apontando a ponta para longe do escarro e aspirar muito lentamente o líquido da superfície. A etapa de lavagem não envolve centrifugação para não perturbar a integridade estrutural dos tampões de escarro.</li>
	<li>Repita as etapas 1.6-1.7 mais duas vezes.</li>
	<li>Ressuspender o pellet em 2x o volume de PBS com azida sódica a 0,01 % (p/v).</li>
	<li>Conservar o escarro a 4 °C.</li>
</ol>2. MiPACT (técnica de limpeza de tecidos) processamento de escarro
<ol><li>Desgaseifique os componentes do hidrogel (30% 29:1 acrilamida:bis-acrilamida, hardner e PBS) em um recipiente selado contendo uma embalagem anaeróbia antes por 72 h. NOTA: A embalagem anaeróbia e o recipiente selado são necessários porque o oxigênio inibe a polimerização da acrilamida. Alternativamente, o oxigênio pode ser removido realizando esta etapa em um exaustor anaeróbico, aplicando um vácuo em um recipiente selado ou borbulhando gás N2 através da mistura de acrilamida.<ol><li>Adicionar 2 ml de uma solução de acrilamida:bis-acrilamida a 30% 29:1 a um tubo de 15 ml com a tampa desligada no interior do recipiente anaeróbio selado.</li>
		<li>Faça um estoque concentrado de 10% (p/v) de endurecedor adicionando 0,5 g de endurecedor a 5 mL de PBS em um tubo de 15 mL. Deixe a tampa fora do tubo e guarde no recipiente anaeróbio selado.</li>
		<li>Deixe alguns mL de PBS estéril em um tubo, com a tampa desligada, dentro do recipiente anaeróbio.</li>
	</ol></li>
	<li>Completar 5 mL de solução de hidrogel com concentração final de endurecedor a 0,2% e acrilamida:bis-acrilamida a 29:1 a 4% em PBS em tubo de 15 mL. Misture por inversão e filtre esterilizar.</li>
	<li>Retire as amostras de escarro do frigorífico e, em seguida, corte em pequenas secções (cerca de 5 mm de diâmetro) em condições estéreis com um bisturi. NOTA: Se o escarro é bastante fluido, então esta etapa ainda pode ser realizada, no entanto, é preciso mais paciência e prática para remover o escarro da solução de armazenamento com pinça antes de usar o bisturi para separar as frações desejadas.</li>
	<li>Coloque as amostras de escarro cortadas dentro de um poço de uma lâmina de vidro de cobertura de 8 câmaras.</li>
	<li>Adicionar 300 μL de solução de hidrogel esterilizada por filtro a partir do passo 2.2 a cada um dos orifícios que contêm escarro.</li>
	<li>Colocar o vidro de cobertura de 8 câmaras dentro de um recipiente selado contendo uma embalagem anaeróbia durante 3 h a 37 °C. OBS: Uma vez polimerizado o hidrogel com escarro embutido deve ser a consistência de gel firme.</li>
	<li>Transferir as amostras de escarro de hidrogel solidificado para um tubo de cultura de 15 mL contendo 5 mL de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 8%, pH 8, e deixar as amostras limparem por 3-14 dias a 37 °C (com ou sem agitação), até que o escarro fique transparente. NOTA: Os tempos de clareamento dependem da composição do escarro e geralmente podem ser diminuídos com a agitação. No entanto, tome cuidado para não aumentar a velocidade de agitação a ponto de interromper a integridade da amostra. Mais amostras ricas em DNA levam mais tempo para limpar em comparação com amostras ricas em muco.</li>
	<li>Decantar a solução de SDS a 8% para um recipiente de recolha de resíduos. Usando pinças estéreis, transfira cada amostra embebida em hidrogel para um tubo cônico estéril de 50 mL. Adicionar 10 mL de PBS a cada um dos tubos cônicos de 50 mL para lavar os hidrogéis e deixar a solução descansar por 30 min a 1 h antes da decantação. Repita isso 2x mais vezes. NOTA: Esta etapa de lavagem não envolve centrifugação. O excesso de líquido e sobrenadante são cuidadosamente removidos com uma pipeta.</li>
	<li>Armazenar as amostras lavadas em PBS com azida sódica a 0,01% (p/v) e inibidor de RNase 1x a 4 °C.</li>
</ol>3. Protocolo de hibridização in situ fluorescente de hidrogel (FISH)
<ol><li>Retire as amostras de hidrogel de sua solução de armazenamento usando pinças estéreis e coloque as amostras em uma superfície estéril (como uma lâmina de vidro ou placa de Petri).</li>
	<li>Usando um bisturi estéril corte os hidrogéis em fatias de ~ 1 mm de espessura.</li>
	<li>Coloque as secções de 1 mm de hidrogel dentro de tubos estéreis de 1,5 ml.</li>
	<li>Preparar 1 mL de tampão de hibridização (formamida 25%, NaCl 0,9M, Tris-HCl 20 mM [pH 7,6], SDS 0,01%, H2Opurificado e deionizado) em tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicione a sonda PseaerA fluorescentemente marcada (150,7 nM12) ao tampão de hibridização e misture por inversão. NOTA: A solução de formalina deve ser mantida longe de uma chama aberta. O tampão de hibridização pode ser preparado em avançado e armazenado em alíquotas a -20 °C13.</li>
	<li>Adicione 200-500 μL de tampão de hibridização a cada seção de ~1 mm de hidrogel e certifique-se de que toda a amostra de hidrogel esteja submersa.</li>
	<li>Permitir que a sonda PseaerA hibridize com as amostras de hidrogel, colocando-as no escuro por ~ 18-24 h, a 46 °C, sem agitar.</li>
	<li>Decantar o tampão de hibridização em um recipiente de coleta de resíduos.</li>
	<li>Enxaguar as amostras uma vez com tampão de lavagem esterilizado por filtro (NaCl 337,5 mM, Tris-HCl 20 mM, EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) 5 mM [pH 7,2], SDS 0,01% e H2O purificado e deionizado) adicionando 1 mL de tampão de lavagem a cada um dos tubos de 1,5 mL e, em seguida, removê-lo. NOTA: O tampão de lavagem pode ser feito com antecedência e armazenado à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Adicionar 1 ml de tampão de lavagem fresco aos tubos e, em seguida, incubar as amostras no escuro durante 6 h a 48 °C, sem agitar.</li>
</ol>4. Ligação de anticorpos Hydrogel e Psl0096
<ol><li>Remova estérilmente o tampão de lavagem usando um pipetador de 1 mL.</li>
	<li>Enxaguar as amostras com uma solução de BSA a 2% (p/v) em PBS, adicionando e removendo 1 ml da solução de BSA a 2%.</li>
	<li>Adicionar 500 μL da solução de BSA/PBS a 2% às amostras de hidrogel para bloquear a ligação proteica não específica. Em seguida, incube as amostras durante a noite, no escuro, em RT, sem agitar.</li>
	<li>Remover estérilmente a solução de bloqueio utilizando uma pipeta de 1 ml.</li>
	<li>Preparar a solução de anticorpos Psl0096-Texas Red diluindo o anticorpo para uma concentração final de 0,112 μg/mL em 500 μL de BSA/PBS fresco a 2%.</li>
	<li>Adicionar a solução de 500 μL de anticorpos às amostras de hidrogel e incubá-las em RT por 6 h, protegidas da luz, sem agitar.</li>
</ol>5. Coloração DAPI (4′,6′-diamidino-2-fenilindol)
<ol><li>Preparar a solução de correspondência do índice de refração (RIMS) adicionando 40 g de meio de gradiente de densidade não iónico, 30 μL de Tween20, 3 μg de azida sódica e 30 ml de PBS a um balão contendo uma barra de agitação magnética. Agite a solução durante 15 minutos num agitador magnético ou até dissolver completamente.</li>
	<li>Filtrar esterilizar a solução num tubo cónico de 50 ml utilizando uma seringa de 10 ml e um filtro estéril de 0,2 μm. NOTA: A solução pode ser armazenada a 4 °C durante vários meses.</li>
	<li>Remova a solução de anticorpos Psl0096-Texas Red com uma pipeta estéril de 1 mL.</li>
	<li>Enxaguar as amostras de hidrogel adicionando e removendo 1 mL de PBS.</li>
	<li>Incubar as amostras de hidrogel com 250 μL de solução de RIMS e 10 μg/mL de DAPI em TR com agitação suave, no escuro, durante a noite.</li>
	<li>Antes da aquisição de imagens confocais, monte as amostras em câmaras de perfusão de 0,9 mm ou 1,7 mm e sele com uma lamínula de vidro. OBS: Após FISH e/ou imunohistoquímica e antes da imersão em RIMS, a coloração fluorescente de lectinas pode ser aplicada se a visualização da mucosa do escarro for desejada12.</li>
</ol>6. Exames por imagem
<ol><li>Realize imagens confocais de microscopia de varredura a laser usando técnicas padrão em aumentos de 25x, 40x, 63x ou 100x.</li>
</ol>

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</ol>

O objetivo deste protocolo é permitir vislumbrar a organização in situ das células de P. aeruginosa no escarro de pacientes com FC. As amostras de escarro devem ser armazenadas a 4 °C até serem processadas, se não puderem ser imediatamente fixadas. Foi demonstrado que o número de células de P. aeruginosa no escarro não muda significativamente se processado em 1 h, 24 h ou 48 h, quando armazenado a 4 °C, embora se deixado a 25 °C por 24 ou 48 h, a contagem de células bacterianas aumentará significativame...

Neste estudo, experimentos foram delineados para visualizar a estrutura in vivo de Pseudomonas aeruginosa no escarro de pacientes pediátricos com fibrose cística (FC). As infecções por P. aeruginosa tornam-se crônicas em 30-40% da população pediátrica com FC; Uma vez estabelecidas, as infecções crônicas são quase impossíveis de serem eliminadas1. Isolados de P. aeruginosa de pacientes com infecção precoce são geralmente mais suscetíveis aos antimicrobianos, portanto, estes são tratados com antibióticos anti-pseudomonas para prevenir o estabelecimento de infecção crônica2. Infelizmente, nem todos os isolados de P. aeruginosa são efetivamente eliminados do pulmão após a antibioticoterapia. Os mecanismos precisos associados à falha antibiótica ainda não foram totalmente elucidados. Estudos prévios demonstraram que variações na densidade celular, agregação e produção de polissacarídeos podem afetar a eficácia dos antibióticos3. P. aeruginosa produz três polissacarídeos extracelulares: Pel, Psl ealginato 4. A maioria das cepas de P. aeruginosa tem a capacidade genética de expressar cada um dos exopolissacarídeos, embora frequentemente um tipo de polissacarídeo seja expresso predominantemente5. O alginato de exopolissacarídeo está associado a infecções crônicas no pulmão da FC, resultando em um fenótipo mucoide 6,7. Os polissacarídeos Pel e Psl têm múltiplas funções, incluindo auxiliar a fixação inicial e a manutenção da estrutura do biofilme, conferindo resistência aos antibióticos8.
Métodos com o objetivo de visualizar in vivo estruturas de tecidos têm sido desenvolvidos para uma variedade de tipos de amostras9,10,11. Mais recentemente, eles foram adaptados para visualizar comunidades microbianas in vivo dentro do escarro de pacientes com FC12. A otimização de um protocolo de limpeza tecidual específico para a identificação de comunidades microbianas dentro do escarro foi desenvolvida por DePas et al., 201612. O termo MiPACT, que significa microbial identification after Passive CLARITY technique foi cunhado para a depuração do escarro de FC11,12. Para as técnicas de limpeza de tecidos, os espécimes são primeiramente fixados, depois tornados transparentes, deixando intacta sua arquitetura inerente para coloração e visualização microscópica11. A fixação e a limpeza de amostras de escarro de FC permitem que os pesquisadores respondam a perguntas relacionadas à estrutura do biofilme, densidade celular bacteriana, associações polimicrobianas e associações entre patógenos e células hospedeiras. A vantagem de examinar diretamente as bactérias que foram preservadas no escarro é que elas podem ser analisadas e visualizadas em um contexto específico do hospedeiro. Embora o crescimento in vitro de isolados clínicos em laboratório para experimentação possa ser muito informativo, tais métodos são incapazes de recriar completamente o ambiente pulmonar da FC, resultando em uma desconexão entre os resultados laboratoriais e os desfechos dos pacientes.
Os métodos aqui apresentados podem ser usados para fixar e limpar o escarro para visualizar bactérias, seja de pacientes com FC ou de pacientes com outras infecções respiratórias. O tipo específico de coloração e análise microscópica aqui descrita é a hibridização in situ fluorescente (FISH), seguida pela ligação de anticorpos anti-PSL dentro do hidrogel e subsequente análise via microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). Após a limpeza tecidual, outros métodos de imunohistoquímica e microscopia também podem ser aplicados.

<table><tbody><tr><td>29:1 acrilamida bisacrilamida, solução a 30%</td><td>BioRad</td><td>161-0146</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de vidro com 8 câmaras Nunc Lab-Tek</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Anaerogen2.5L</td><td>Oxid Inc.</td><td>35108</td><td></td></tr><tr><td>Câmaras de perfusão</td><td>Coverwell Electron Microscopry Sciences</td><td>70326 -12/-14</td><td></td></tr><tr><td>HistoDenz</td><td>Sigma</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>Protect RNA Rnase Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>R7387</td><td></td></tr><tr><td>PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC</td><td>Eurofins</td><td></td><td>Detalhes do pedido: Produto: DNA Oligo modificado; Nome: PseaerA; Sequência: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Síntese: 50 nmol; Purificação: HPLC; Estado do navio: Rendimento total (seco)</td></tr><tr><td>Psl0096-Texas Red</td><td>Medimmune</td><td></td><td>Os anticorpos vermelhos Psl0096-Texas foram um presente gentilmente fornecido pela Medimmune e a empresa deve ser contatada para consultas de pedidos.</td></tr><tr><td>VA-044 Endurecedor</td><td>Wako</td><td>27776-21-21</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização de pseudomonas aeruginosa no escarro de pacientes com fibrose cística

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

A detecção precoce e a erradicação de Pseudomonas aeruginosa nos pulmões de pacientes com fibrose cística podem reduzir a chance de desenvolver infecção crônica. O desenvolvimento de infecções crônicas por P. aeruginosa está associado a um declínio na função pulmonar e aumento da morbidade. Portanto, há um grande interesse em elucidar as razões para a falha na erradicação da P. aeruginosa com antibioticoterapia, que ocorre em aproximadamente 10-40% dos pacientes pediátricos. Um dos muitos fatores que podem afetar a depuração de P. aeruginosa e a suscetibilidade a antibióticos pelo hospedeiro são variações na organização espacial (como agregação ou formação de biofilme) e produção de polissacarídeos. Portanto, estávamos interessados em visualizar as características in situ da P. aeruginosa no escarro de pacientes com FC. Uma técnica de limpeza tecidual foi aplicada às amostras de escarro após a incorporação das amostras em uma matriz de hidrogel para reter as estruturas 3D em relação às células hospedeiras. Após a limpeza do tecido, etiquetas fluorescentes e corantes foram adicionados para permitir a visualização. Hibridização in situ fluorescente foi realizada para a visualização das células bacterianas, ligação de anticorpos anti-Psl marcados fluorescentemente para a visualização do exopolissacarídeo e coloração DAPI para corar células hospedeiras para obter insight estrutural. Esses métodos permitiram a obtenção de imagens de alta resolução da P. aeruginosa no escarro de pacientes com FC por meio de microscopia confocal de varredura a laser.

O planejamento geral do experimento está resumido na Figura 1 e na Figura 2. A Figura 1 apresenta um resumo dos protocolos de processamento e desobstrução de escarro. O processamento e a depuração do escarro podem levar até 17 dias. No entanto, o protocolo pode ser interrompido, e as amostras podem ser armazenadas após a fixação com PFA (dia 2) ou após a limpeza do tecido (dias 5-17, dependendo do tempo de clareamento). Na <strong c...

Este protocolo fornece métodos para visualização de células bacterianas e polissacarídeos do lócus de síntese de polissacarídeos (Psl) no escarro de pacientes com fibrose cística.

Visualização de Pseudomonas aeruginosa no Escarro de Pacientes com Fibrose Cística

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

Este protocolo é significativo porque permite a visualização direta de Pseudomonas aeruginosa e do exopolissacarídeo Psl dentro do escarro de fibrose cística. Esta técnica ajuda a responder a perguntas sobre como a organização espacial de P. aeruginosa, como agregação ou biofilmes, afeta a depuração do hospedeiro e a suscetibilidade antimicrobiana. Armazene o escarro expectorado em um copo de coleta estéril a quatro graus Celsius por no máximo 24 horas antes da fixação.Quando estiver pronto para fixar as amostras, transfira-as para um tubo estéril de 15 mililitros e adicione um volume igual de 4% de PFA e, em seguida, incube o escarro durante a noite a quatro graus Celsius. Lave as amostras adicionando cinco mililitros de PBS para cada dois mililitros de escarro fixo. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e repita a lavagem mais duas vezes.Ressuspenda o pellet com o dobro do volume de PBS com 0,01% de azida de sódio e armazene-o a quatro graus Celsius. Adicione dois mililitros de uma solução de acrilamida / bisacrilamida a 30%29 a um tubo de três mililitros com a tampa fora de um recipiente anaeróbico selado e, em seguida, adicione 0,5 gramas de endurecedor a dois mililitros de PBS em um tubo de três mililitros. Deixe a tampa fora do tubo e guarde-a no recipiente anaeróbico lacrado.Deixe alguns mililitros de PBS estéril no tubo com a tampa fora dentro do recipiente anaeróbico. Desgaseifique os componentes do hidrogel no recipiente selado com uma embalagem anaeróbica por 72 horas. Faça uma solução de 2,5 mililitros de hidrogel com uma concentração final de 0,2% de endurecedor e 4% de acrilamida / bisacrilamida em PBS em um tubo de 15 mililitros e misture o hidrogel por inversão e, em seguida, esterilize a solução por filtro.Corte as amostras de escarro em duas pequenas seções com um bisturi e, em seguida, coloque cada amostra em um poço de uma lâmina de vidro coberta com oito câmaras. Adicione 300 microlitros da solução de hidrogel esterilizada por filtro a cada poço que contenha escarro e coloque-o dentro de um recipiente lacrado com um pacote anaeróbico por três horas a 37 graus Celsius. Transfira as amostras de escarro de hidrogel solidificado para um tubo de cultura de 15 mililitros com cinco mililitros de 8% SDS a pH oito e deixe as amostras limparem por três a 14 dias a 37 graus Celsius até que o escarro se torne transparente.Use uma pinça estéril para transferir cada amostra embebida em hidrogel para um tubo cônico de 50 mililitros e adicione 10 mililitros de PBS para lavar o hidrogel. Deixe a solução agir por 30 a 60 minutos antes de decantar e repita a lavagem mais duas vezes. Armazene as amostras lavadas em PBS com 0,01% de azida de sódio e inibidor de RNase a quatro graus Celsius.Remova as amostras de hidrogel de sua solução de armazenamento e coloque-as em uma superfície estéril. Use um bisturi estéril para cortar os hidrogéis em fatias de aproximadamente um milímetro de espessura e coloque as seções em tubos de 1,5 mililitro. Prepare um mililitro de tampão de hibridização em um tubo de 1,5 mililitro, adicione a sonda Seer A marcada com fluorescência e misture por inversão.Adicione 200 a 500 microlitros de tampão de hibridização a cada seção, certificando-se de que toda a amostra de hidrogel esteja submersa. Permita que a sonda A Seer hibridize com as amostras de hidrogel, colocando-as no escuro por aproximadamente 18 a 24 horas a 46 graus Celsius sem agitar, depois adicione um mililitro de tampão de lavagem fresco aos tubos e incube-os no escuro por seis horas a 48 graus Celsius. Adicione 500 microlitros de 2% BSA e PBS às amostras de hidrogel para bloquear a ligação de proteínas não específicas e, em seguida, incube as amostras durante a noite no escuro.No dia seguinte, prepare a solução de anticorpo Psl0096-Texas Red diluindo o anticorpo até uma concentração final de 0,112 microgramas por mililitro em 500 microlitros de 2% BSA fresco em PBS. Adicione a solução de anticorpos às amostras de hidrogel e incube-as no escuro por seis horas. Em seguida, core as amostras de hidrogel com DAPI, incubando-as com 250 microlitros de solução de RIMs e 10 microgramas por mililitro de DAPI durante a noite no escuro com uma agitação suave.Após a coloração, monte as amostras em câmaras de perfusão de 0,9 ou 1,7 milímetros e sele-as com uma lamínula de vidro. Realize microscopia confocal de varredura a laser com ampliações de 25, 40, 63 ou 100 vezes. Este protocolo foi utilizado para obter as imagens 3D de alta resolução das células de P. aeruginosa e sua estrutura NC2 no escarro.Um agregado de células dentro de uma amostra de escarro é mostrado aqui. Formas individuais de bastonetes foram vistas em verde a partir da ligação específica da espécie da sonda Seer A-488 às células de P. aeruginosa. O anticorpo Psl0096-Texas Red mostra que o exopolissacarídeo pseudomonal dentro do escarro estava principalmente sobreposto às células de P.aeruginosa.Este método também foi usado para a visualização de células pseudomonais dentro do escarro em relação a outras células bacterianas e estruturas hospedeiras. Um aglomerado de células de P. aeruginosa foi visto fagocitando dentro de uma célula eucariótica, enquanto outros pequenos aglomerados de células cócicas foram observados nas proximidades. Também foi demonstrado que o anticorpo PSL 0096 pode se ligar ao PSL produzido a partir de P.aeruginosa planctônica.A principal vantagem dessa técnica é que ela implementa uma abordagem de limpeza de tecido seguida de hibridização in situ fluorescente, coloração de anticorpos e microscopia confocal. Isso permite que os pesquisadores visualizem e usem técnicas de processamento de imagem para medir quantitativamente as diferenças nas estruturas de colonização de P. aeruginosa no escarro da FC em relação aos resultados de saúde do paciente.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Testes de susceptibilidade antimicrobiana Atualmente, o diagnóstico baseia-se no crescimento planctônico dos isolados em ricas em nutrientes, condições aeróbicas. Aqui, nós utilizamos um meio de escarro alternativa artificial para estudar susceptibilidade antimicrobiana de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa em ambas as condições de aerobiose e microaerofilia mais representativas do pulmão da fibrose cística.

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

Fonte: Beaudoin, T., et al. Visualizando os efeitos do escarro no desenvolvimento de biofilme usando um modelo de vidro coberto com câmara. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra um método in vitro para avaliar como a fibrose cística derivada do paciente influencia a formação de biofilmes bacterianos. Utilizando lâminas de câmara, coloração fluorescente e microscopia confocal, revela espessura aumentada, arquitetura alterada e maior biomassa viável em biofilmes cultivados com escarro,...

Imagem Confocal de Biofilmes Bacterianos Induzidos por Filtrados de Escarro em Pacientes com Fibrose Cística

Source: Jackson, L., et al. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in situ visualization of Pseudomonas aeruginosa within chemically cleared cystic fibrosis sputum using fluorescent labeling and confocal microscopy to reveal bacterial localization and biofilm structure.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa in Sputum Samples from Cystic Fibrosis Patients

Descreve-se o método de ágar-esferas de estabelecer infecção das vias aéreas persistente a longo prazo crônica Pseudomonas aeruginosa no modelo de mouse.

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

Este protocolo descreve a visualização do desenvolvimento do biofilme após a exposição a fatores do hospedeiro usando um modelo de câmara de lâminas. Este modelo permite a visualização direta do desenvolvimento do biofilme, bem como a análise dos parâmetros do biofilme usando programas de software de computador.

Visualizando os Efeitos de escarro no desenvolvimento de biofilmes usando um modelo Chambered lamela

Descrevemos um protocolo para um modelo tridimensional de co-cultura de vias aéreas infectadas, usando CFBE41o- células, macrófagos THP-1 e Pseudomonas aeruginosa, estabelecido na interface ar-líquido. Este modelo fornece uma nova plataforma para testar simultaneamente a eficácia dos antibióticos, a função da barreira epitelial e marcadores inflamatórios.

P. aeruginosa Co-Cultura 3D infectada de células epiteliais e macrófagos bronquiais na interface ar-líquida para avaliação pré-clínico de anti-infecciosos

Este fluxo de trabalho pode ser usado para realizar testes de suscetibilidade a antibióticos usando um modelo ex vivo estabelecido de biofilme bacteriano nos pulmões de indivíduos com fibrose cística. O uso deste modelo poderia aumentar a validade clínica dos ensaios de IMC (concentração mínima de erradicação de biofilmes).

Teste de Eficácia de Antibióticos em um Modelo Ex vivo de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus Biofilms no Pulmão da Fibrose Cística

O meio de escarro de fibrose cística sintética (SCFM2) pode ser utilizado em combinação com microscopia de varredura a laser confocal e classificação celular ativada por fluorescência para observar agregados bacterianos em alta resolução. Este artigo detalha métodos para avaliar populações agregadas durante o tratamento antimicrobiano como uma plataforma para estudos futuros.

Ferramentas para a avaliação em tempo real de um modelo de infecção por pseudomonas aeruginosa

O protocolo aqui demonstra um fluxo de trabalho rápido de avaliação microbiológica rápida no local (M-ROSE) rápido e padronizado, incluindo três etapas: confecção de lâminas, coloração e interpretação. Este protocolo ajudará os médicos a tomar decisões clínicas rápidas.

Avaliação microbiológica rápida no local para doenças infecciosas pulmonares

Este protocolo descreve um modelo de biofilme polimicrobiano de quatro espécies relevante para o pulmão de fibrose cística (FC) que pode ser usado para explorar o impacto das interações bacterianas entre espécies.

Cultivo de um biofilme polimicrobiano relevante para fibrose cística para sondar fenótipos da comunidade

Essa metodologia permite o estabelecimento de um modelo de biofilme polimicrobiano na fibrose cística para testes de sensibilidade antimicrobiana em pesquisa e laboratórios clínicos. Este modelo fornece resultados precisos e confiáveis em uma variedade de saídas.

Desenvolvimento de um modelo de biofilme de colônia polimicrobiana para testar antimicrobianos na fibrose cística

Aprenda a visualizar Pseudomonas aeruginosa e o polissacarídeo Psl no escarro de pacientes com fibrose cística. Este protocolo utiliza hibridização in situ e microscopia confocal para estudar a organização espacial bacteriana.

Visualização de Pseudomonas aeruginosa no Escarro de Pacientes com Fibrose Cística

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