Name: Geração livre de células neuronais derivadas do sangue (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Aprenda a gerar células neuronais derivadas do sangue sem modificação genética para medicina regenerativa usando células mononucleares de sangue periférico. Este método seguro permite obtenção de células autólogas não teratogênicas.

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Dedicado à memória do Dr. Rainer Saffrich.
Os autores são especialmente gratos a José Manuel García-Verdugo e Vicente Herranz-Pérez por realizarem experimentos e análises em EM no Laboratório de Neurobiologia Comparada, Instituto Cavanilles de Biodiversidade e Biologia Evolutiva, Universidade de Valência, CIBERNED, Valência, Espanha, que foi apoiado por financiamento de pesquisa do Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. O resto deste trabalho foi apoiado pela ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Alemanha.

As aprovações éticas foram obtidas na realização dos experimentos.
1. Isolamento das células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMNCs)
<ol><li>Certifique-se de que todos os doadores assinaram consentimento informado antes da retirada de sangue em conformidade com as diretrizes institucionais.</li>
	<li>Tome 30 mL de sangue de doadores saudáveis por pessoal médico treinado de acordo com o protocolo padrão.</li>
	<li>Isole pbmncs por mídia gradiente de densidade. Use 10 mL de mídia com 25 mL de 1:1 sangue diluído com soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) e centrífuga a 300 x g por 30 min.</li>
	<li>Isole a camada interfase entre o plasma e a mídia gradiente de densidade por pipetação. Lave as células isoladas com 5 mL de PBS estéril e centrífuga a 300 x g por 10 minutos. Repita duas vezes.</li>
	<li>Conte o número de células por métodos padrão usando uma câmara de contagem.</li>
</ol>2. Ativação da glicoproteína ancorada em GPI humano por anticorpos interligados na superfície dos PBMNCs
<ol><li>Coloque as células mononucleares 6 x10 6 (MNCs) em tubos de 15 mL e realize a interligação de anticorpos incubando as células com anticorpo específico de proteína de membrana ligada ao GPI humano (30 μg/mL) por 30 minutos em PBS com 1% de albumina de soro bovino (BSA) a 37 °C.</li>
	<li>Substitua o meio de incubação pelo meio modificado de Dulbecco da Iscove, suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS).</li>
	<li>Cultivar células em tubos de poliestireno de 15 mL, colocar os tubos em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 por 8-10 dias (sem tremer). Em D5, adicione um adicional de 1-2 mL do meio da Iscove complementado com 10% de FBS a cada tubo de 15 mL.</li>
</ol>3. Classificação de células dediferentes recém-geradas
<ol><li>Conte células com um contador celular automatizado (suspensão celular de 18 μL + corante de fluorescência de 2 μL) ou em uma câmara de contagem.</li>
	<li>Suspensão de célula cultivada centrífuga (5-7 x 106) a 300 x g por 10 min e aspirar o supernante resultante com uma pipeta Pasteur estéril.</li>
	<li>Suspenda a pelota celular em 90 μL de PBS pH pré-resfriado 7,2, 0,5% BSA e 2 mM EDTA.</li>
	<li>Adicione contas magnéticas de nano-tamanho positivo CD45 (80 μL) à suspensão celular e incubar no gelo por 15 minutos.</li>
	<li>Lave as células adicionando 2 mL de tampão PBS e centrífuga a 300 x g por 10 min.</li>
	<li>Suspenda as células em 500 μL de buffer PBS.</li>
	<li>Lave a coluna com 500 μL de tampão PBS pré-resfriado e coloque-a no campo magnético.</li>
	<li>Coloque a suspensão celular na coluna e lave-a com 500 μL de tampão PBS (duas vezes) e o fluxo de centrífuga contendo células CD45 negativas. Recolhê-los no meio de Iscove complementado com 1% de BSA.</li>
	<li>Conte as células na câmara de contagem.</li>
</ol>4. Preparar pratos de cultura celular para diferenciação neuronal de células-tronco recém-geradas
<ol><li>Cubra os vasos de cultura com poli-L-ornithine e laminina para o crescimento de células neuronais.</li>
	<li>Coloque as tampas de vidro em placas de 4 poços e cubra-as com 1:5 poli-L-ornithine diluída (0,1 mg/mL em ddH2O) em ddH2O. Coloque as tampas em uma incubadora de 37 °C por 1 h. Em seguida, lave com ddH2O.</li>
	<li>Descongele lentamente laminina (0,5-2,0 mg/mL) e adicione ao topo das tampas. Incubar a 37 °C por 2 h.</li>
	<li>Prepare o meio de indução neural N2 composto por 49 mL de D-MEM/F12, 500 μL de suplemento N2, 400 μL de aminoácidos não essenciais (NEAA), solução básica de FGF a 20 ng/mL de concentração final (preparada a partir de 100 μg/mL solução de estoque) e heparina em 2 ng/mL de concentração final.</li>
	<li>Remova o excesso de laminina por pipetação e adicione n2 médio neuronal aos pratos de cultura.</li>
</ol>5. Cultivo de células sanguíneas dediferentes neuronais
<ol><li>Cultura CD45 células negativas derivadas de BD em tampas de vidro revestidas de laminina/ornitina por 2 dias em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 no meio N2 para iniciar uma diferenciação neuronal de células recém-geradas por BD.</li>
	<li>Células de cultura ainda em meio de diferenciação neuronal consistindo de 48 mL de meio neurobásal, 500 μL de L-glutamina, 1 mL de Suplemento B27, 500 μL de NEAA, 50 μL de fator neurotrófico recombinante derivado do glial humano (GDNF) a 5 μg/250 μL em PBS/0,1% BSA, e 50 μL de cérebro humano recombinante fator neurotrófico derivado (BDNF) a 5 μg/200 μL em PBS/0,1% BSA e 50 μL de solução de ácido ascórbico 2,9 g/50 mL em PBS. Coloque as placas em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2.</li>
</ol>6. Análise de microscopia de imunofluorescência de células neurais derivadas do sangue
<ol><li>Cultue as células como descrito acima por 16 dias e remova a mídia.<ol>
<li>Incubar com fixação pré-aquecida composta por 75 mL de água estéril, 4 g de paraformaldeído. Adicione 10 N NaOH conforme necessário e mexa até que a solução se limpe. Em seguida, adicione 10 mL de PBS 10x, 0,5 mL de MgCl2, 2 mL de 0,5 M EGTA e 4 g de sacarose. Titrate para pH 7.4 com 6 N HCl, e leve a 100 mL de água estéril por 15 min, de acordo com Marchenko et al.7.</li>
		<li>Descarte o fixador e lave as células 3 vezes por 5 minutos cada vez. Adicione imediatamente uma solução Triton X de 0,3% recém-feita e permeabilize as células por 5 minutos. Lave 3 vezes com PBS e adicione uma solução de bloqueio feita pela PBS e 5% BSA.</li>
		<li>Bloqueie as células à temperatura ambiente em uma placa de roqueiro por 1 hora.</li>
		<li>Prepare a diluição apropriada dos anticorpos em 1% BSA/PBS e incuba as células com diluições de anticorpos na placa de roqueiro por 1,5 h à temperatura ambiente. Lave as células 3 vezes com PBS por 5 minutos cada, incuba as células com DAPI e monte as tampas com mídia de montagem para visualização em um microscópio. NOTA: Os anticorpos diretamente rotulados utilizados neste experimento estão listados na Tabela de Materiais.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Análise de microscopia eletrônica de transmissão de células recém-geradas
<ol><li>Seme as células para TEM em lâminas de câmara de 8 poços.</li>
	<li>Fixar as células em 3,5% glutaraldeído por 1 h a 37 °C, pós-fixação em 2% OsO4 por uma hora adicional à temperatura ambiente e manchar em acetato de uranyl de 2% no escuro a 4 °C por 2 h 30 min.</li>
	<li>Finalmente, enxágüe as células em água destilada, desidrate-a em etanol e incorpore resina epóxi durante a noite. No dia seguinte, transfira as amostras para um forno de 70 °C por 72 h para endurecimento de resina.</li>
	<li>Retire as culturas celulares incorporadas do deslizamento de câmara e cola para blocos de araldito.</li>
	<li>Corte seções semifinais em série (1,5 μm) com uma máquina, monte em lâminas de vidro e manche levemente com 1% de azul toluidina.</li>
	<li>Cole seções semifinas selecionadas para blocos de araldito e desvinculá-las do deslizamento de vidro por congelamento repetido (em nitrogênio líquido) e descongelamento.</li>
	<li>Prepare seções ultrathinas (0,06-0,08 μm) com uma máquina e contraste ainda maior com citrato de chumbo.</li>
	<li>Obtenha micrografias usando microscópio de varredura eletrônica com câmera digital.</li>
</ol>

<ol><li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine%3A+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32(2011).</li>
<li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neural+stem+cells%3A+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Technologies+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry%3A+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267(2007).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Technologies+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glial%22%5BJournal%5D)">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li>
<li>Melková, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c%3A+Similarities+and+Differences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105(2019).</li>
<li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li>
<li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nestin-expressing+progenitor+cells%3A+function%2C+identity+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li>
</ol>

A autora correspondente declara que é detentora de patentes relacionadas à Nova Proteína Ligada ao GPI Humano, bem como co-fundou e trabalha para a ACA CELL Biotech. Os outros autores declaram que não têm conflito de interesses.

O método não-GM de reprogramação de células humanas descrito neste trabalho baseia-se na ativação da membrana ao núcleo de máquinas de sinalização por trás da glicoproteína de membrana humana ligada ao GPI que inicia o processo de desdiferenciação levando à geração ex vivo e à expansão de PSCs auto-renovados obtidos a partir de sangue periférico humano não manipulado. Essas células quando cultivadas em meios apropriados são capazes de se diferenciar em células pertencentes a diferentes camadas germinativas<sup c...

O desenvolvimento de métodos básicos e pré-clínicos de pesquisa de células-tronco incentiva a aplicação clínica de terapias baseadas em células-tronco para doenças neurológicas. Tal terapia potencial depende criticamente do método de geração de células neurais humanas que leve à recuperação funcional1.
As células-tronco neurais (NSCs) se auto-renovam e se diferenciam em novos neurônios ao longo da vida em um processo chamado neurogênese adulta. Apenas áreas cerebrais muito restritas abrigam NSCs competentes para gerar neurônios recém-nascidos na idade adulta. Tais NSCs podem dar origem a neurônios maduros, que estão envolvidos no aprendizado e na memória, substituindo assim neurônios perdidos ou danificados. Infelizmente, essas NSCs estão presentes em quantidades restritas e essa neurogênese limitada diminui rapidamente durante o desenvolvimento juvenil2. Portanto, outras fontes de células neurais devem ser consideradas em um objetivo de terapia celular.
Doenças neurológicas degenerativas são difíceis de curar usando abordagens farmacológicas padrão. Novas estratégias terapêuticas para abraçar muitas doenças neurológicas imensuráveis são baseadas em terapias de substituição celular de tecido doente e ferido. O transplante de NSC pode substituir células danificadas e fornecer efeitos benéficos. Outras fontes para a substituição de células neurais incluem células-tronco embrionárias humanas (ESC), que são derivadas da massa celular interna dos blastocistos3,bem como iPSCs4,que têm ampla capacidade de auto-renovação como eSCs e são capazes de se diferenciar em várias linhagens celulares. Os NSCs também podem ser gerados pela reprogramação direta de fibroblastos humanos evitando o estado pluripotente5.
A terapia de reposição celular ainda é uma questão desafiadora. Embora a ESC, fetal ou iPS possa ser uma fonte para a geração de células neuronais para o tratamento de muitas doenças neurológicas incuráveis, a substituição celular de SCs adultos autólogos de tecidos danificados é uma alternativa melhor que contorna preocupações imunológicas, éticas e de segurança.
Ativação da proteína ligada ao GPI humano por ligação de anticorpos via fosforilação de PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN inicia uma dediferenciação de células progenitoras sanguíneas e geração de células-tronco pluripotentes derivadas do sangue (BD-PSCs)6. Essas células se diferenciam in vitro em relação às células neuronais, como confirmado por meio de análise de campo brilhante, imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão (TEM).
Neste trabalho descrevemos a geração livre de BD-PSCs e sua diferenciação bem sucedida em células com fenótipo neuronal.

<table><tbody><tr><td>Albumina Fração V</td><td>Roth</td><td>T8444.4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFAP Cy3 conjugado</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB3402C3</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB3418A5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB5326A4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td><td>BD Pharmingen</td><td>560381</td><td></td></tr><tr><td>Kit de viabilidade celular AO/PI</td><td>Biozym</td><td>872045</td><td>Biozym descontinuado. O produto produzido pela Logos Biosystems.</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico 2-fosfato sequimagnes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 Soro livre 50x</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11530536</td><td></td></tr><tr><td>Solução básica de FGF</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10647225</td><td></td></tr><tr><td>Biocoll</td><td>Merck Millipore</td><td>L6115-BC</td><td>mídia de gradiente de densidade</td></tr><tr><td>BSA Frac V 7,5%</td> <td>Gibco</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-045-801</td><td>contas magnéticas de tamanho nanométrico</td></tr><tr><td>Lâminas de contagem de células Luna</td><td>Biozym</td><td>872010</td><td>Biozym descontinuado. O produto produzido pela Logos Biosystems.</td></tr><tr><td>Corrediças de Câmara Lab-Tek</td><td>Fisher Scientific</td><td>10234121</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F12</td><td>Merck Millipore</td><td>FG4815-BC</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44610</td><td>resina epóxi</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1030B</td><td>Descontinuado. Disponível em: TMS-013-B</td></tr><tr><td>GDNF humano recombinante</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10679963</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>L-glutamina</td></tr><tr><td>Glutaraldeído grau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Célula de heparina sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>BDNF humano</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11588836</td><td></td></tr><tr><td>Iscove (IMDM)</td><td>Biochrom</td><td>FG0465</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo Laminina</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10267092</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de chumbo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15326-25G</td><td></td></tr><tr><td>Luna FL Contador de células automatizado</td><td>Biozym</td><td>872040</td><td>Biozym descontinuado. O produto produzido pela Logos Biosystems.</td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x</td><td>Gibco</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Trenns&auml; ulen</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Câmera digital Morada</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiplatte Nunclon 4 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>10507591</td><td></td></tr><tr><td>N2 Suplemento 100x</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11520536</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Médio</td><td>Gibco</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>PBS estéril</td><td>Roth</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Super Cola-3 Loctite</td><td>Henkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM FEI Technai G2 Espírito</td><td>FEI Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracut UC-6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo C</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

geração livre de células neuronais derivadas do sangue

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Muitas doenças neurológicas humanas são causadas pela degeneração de neurônios e células gliais no cérebro. Devido a limitações em estratégias farmacológicas e outras terapêuticas, atualmente não há cura disponível para o cérebro ferido ou doente. A substituição celular aparece como uma estratégia terapêutica promissora para condições neurodegenerativas. Até hoje, as células-tronco neurais (NSCs) foram geradas com sucesso a partir de tecidos fetais, células embrionárias humanas (ES) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC). Um processo de desdiferente foi iniciado pela ativação da nova glicoproteína ligada ao GPI humano, que leva à geração de células-tronco pluripotentes. Essas células-tronco pluripotentes derivadas do sangue (BD-PSCs) diferenciam in vitro em células com um fenótipo neural, como mostrado por microscopia de campo brilhante e imunofluorescência. A análise ultraestrutural dessas células por meio da microscopia eletrônica confirma sua estrutura primitiva, bem como morfologia neuronal e características subcelulares.

Os resultados fornecem evidências de que este novo método livre de GM é capaz de reverter células progenitoras de sangue para seu estado mais primitivo sem agir diretamente sobre o genoma humano.
Já mostramos anteriormente que o crosslinking de anticorpos específicos ligados ao GPI inicia-se via PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulation de genes altamente conservados de desenvolvimento relevantes como WNT, NOTCH e C-Kit, iniciando assim um processo de desdiferenteização que leva ao primeir...

Apresentamos um método geneticamente livre de modificações (livre de GM) para obter células com um fenótipo neuronal de células sanguíneas periféricas reprogramadas. A ativação de uma via de sinalização ligada à nova proteína ligada ao GPI humano revela um método eficiente livre de GM para a obtenção de células-tronco pluripotentes humanas.

Geração livre de células neuronais derivadas do sangue

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

A significância do protocolo depende da membrana para a sinalização do núcleo e não afeta diretamente o genoma, como é o caso das células-tronco pluripotentes induzidas. A natureza não teratogênica das células-tronco pluripotentes derivadas do sangue é a principal vantagem da técnica, tornando-a adequada para aplicação clínica segura em vários campos da medicina regenerativa. Anne-Kathrin Schott, líder do projeto, e Oksana Greenacre, assistente de laboratório do meu laboratório.Para isolar os PBMNCs, adicione 25 mililitros de sangue de um para um diluídos com PBS a 10 mililitros de mídia gradiente de densidade e centrifugar a mistura a 300 vezes G por 30 minutos. Isole a camada de interface entre o plasma e a mídia gradiente de densidade por pipetação. Lave as células isoladas com cinco mililitros de PBS estéreis e centrífuga a 300 vezes G durante 10 minutos.Depois de repetir o procedimento duas vezes, conte o número de células usando uma câmara de contagem. Adicione 6 por 10 às células mononucleares ao tubo de 15 mililitros e, em seguida, realize a ligação cruzada de anticorpos de anticorpos específicos da membrana ligada ao GPI humano às células em PBS com 1%BSA e incubando por 3

gm-free-generation-of-blood-derived-neuronal-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um método simples e confiável sobre o isolamento e cultura de células-tronco neurais de tecido fetal humano descartado cortical é descrito. Derivados de culturas humanas conhecidas doenças neurológicas podem ser usados ​​para a caracterização de processos patológicos celular e molecular, bem como fornecer uma plataforma para avaliar a eficácia farmacológica.

Geração de células-tronco neurais de Discarded tecido fetal humano Cortical

Este método descreve como isolar e imortalizar células endoteliais microvasculares de cérebro de rato. Descreve-se um protocolo de passo-a-passo a partir da homogeneização do tecido cerebral, as etapas de digestão, a semeadura e imortalização das células. Normalmente, leva cerca de cinco semanas, para se obter uma homogeneidade, linha celular imortalizada microvascular endotelial.

Geração de uma Murine Cérebro Imortalizado linha celular endotelial microvascular como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sangue Cérebro Modelo Barreira

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar células neuronais a partir de células-tronco pluripotentes derivadas do sangue (BD-PSCs). As BD-PSCs são obtidas por meio da reprogramação de células progenitoras do sangue. As BD-PSCs indiferenciadas são cultivadas em lamínulas revestidas com substrato de cultura de células usando um meio de indução neural e um meio de diferenciação neural, desencadeando a diferenciação em células com fenótipo neuronal.

Geração de Células Neuronais a Partir de Células-Tronco Pluripotentes Derivadas do Sangue

O vídeo demonstra a geração de neurônios a partir de fibroblastos dérmicos humanos adultos (aHDFs). Os aHDFs são reprogramados usando um vetor lentiviral que transporta genes para fatores de transcrição neuronal e RNAs de grampo curto (shRNAs). Os shRNAs inibem a expressão de um repressor transcricional neuronal, e os fatores de transcrição neuronal ativam genes para diferenciar aHDFs em neurônios. Esses aHDFs reprogramados são cultivados em um meio de conversão neuronal precoce e tardia para...

Geração de neurônios por reprogramação de células de fibroblastos dérmicos humanos

Fonte: Becker-Kojić, Z. A., et. al., Geração Livre de GM de Células Neuronais Derivadas do Sangue. J. Vis. Exp. (2021)O vídeo demonstra um protocolo para preparar células neurais derivadas de células do sangue periférico reprogramadas para microscopia de fluorescência, mostrando diferentes tipos de células e estágios de desenvolvimento por meio de imagens de imunofluorescência.

Microscopia de Imunofluorescência de Células Neurais Diferenciadas de Células Derivadas do Sangue Periférico 

Foi desenvolvido um método para derivar directamente células estaminais neurais humanos a partir de células progenitoras hematopoiéticas enriquecidas de células do sangue periférico.

Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.

Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras

Reprogramação neuronal direta gera neurônios que mantêm a idade da célula somática inicial. Aqui, descrevemos um método baseado em vetor único para gerar neurônios induzidos de fibroblastos dérmicos obtidos de doadores humanos adultos.

Simples geração de uma cultura de alto rendimento de neurônios induzidas de fibroblastos de pele humana adulta

O protocolo apresenta a reprogramação de células mononucleares do sangue periférico para induzir células-tronco neurais por infecção pelo vírus de Sendai, diferenciação de iNSCs em neurônios dopaminérgicos, transplante de precursores da DA na unilateralmente lesionada Modelos do rato da doença de Parkinson, e avaliação da segurança e da eficácia de precursores DA DA do iNSC-derivados para o tratamento do paládio.

Geração de células-tronco neurais induzidas de células mononucleares periféricas e diferenciação para precursores de neurónios dopaminérgicos para estudos de transplante

Este artigo descreve um protocolo para a geração de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em um biorreator de suspensão 3D de bancada.

Produção de neurônios humanos induzíveis por neurogenina 2 em biorreator de suspensão tridimensional

Este estudo delineia uma nova abordagem para o estabelecimento de células semelhantes à micróglia derivadas de monócitos humanos (iMG) que permitem a avaliação indireta da inflamação cerebral. Isso apresenta um modelo celular que pode ser benéfico para pesquisas com foco na inflamação potencial do cérebro e distúrbios neuropsiquiátricos associados.

Engenharia de células semelhantes à microglia induzidas por sangue humano para pesquisa cerebral de tradução reversa

Aprenda a gerar células neuronais derivadas do sangue sem modificação genética para medicina regenerativa usando células mononucleares de sangue periférico. Este método seguro permite obtenção de células autólogas não teratogênicas.

Geração livre de células neuronais derivadas do sangue

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