Detecção de variantes genéticas no gene CALR usando análise de fusão de alta resolução

Este método define com precisão as mutações da calreticulina em pacientes com suspeita de condição hematológica, especialmente quando outras opções diagnósticas são limitadas ou há uma sobreposição com condições não hematológicas. A principal vantagem da técnica de espelho de alta resolução é detectar as variantes genéticas somáticas comuns na região de hotspot do gene da calreticulina no limite aceitável de detecção e custo acessível. Essa técnica permite o diagnóstico rápido e não invasivo de doenças mieloproliferativas, especialmente trombocitemia essencial e mielofibrose primária.

Atualmente, não tem efeito sobre a escolha da terapia nesses pacientes. No entanto, isso pode mudar no futuro. Comece preparando o master mix qPCR HRM conforme descrito no manuscrito do texto, fazendo o suficiente para três réplicas de cada amostra de DNA e controle.

Misture o conteúdo da reação batendo e invertendo suavemente o tubo e o vórtice por dois a três segundos e, em seguida, gire brevemente o tubo para coletar as gotículas espalhadas. Transfira 19 microlitros da mistura mestre qPCR HRM para cada poço da placa de reação óptica de 96 poços. Pipetar um microlitro dos controlos negativos, controlos positivos e amostras para os poços apropriados da placa para o controlo sem molde ou NTC a um microlitro de ARNs estéreis e de água livre de ADN utilizada para preparar a mistura principal de qPCR HRM em vez de ADN.

Sele a placa de reação firmemente com o filme adesivo óptico para evitar a evaporação durante a execução. Em seguida, gire-o a 780 vezes G em temperatura ambiente por um minuto. Verifique se o líquido está no fundo dos poços na placa de reação e execute o ensaio.

Atribua os controles e samples aos poços apropriados no software do sistema do instrumento e altere o protocolo de amplificação do instrumento padrão. Programe o instrumento conforme descrito no manuscrito do texto para realizar a análise de dissociação imediatamente após a qPCR. quando a execução terminar revise e verifique o gráfico de amplificação.

No menu de experimentos do software do sistema de instrumentos, selecione a opção de gráfico de amplificação. Se nenhum dado for exibido, clique no botão verde analisar. Na guia Gráfico de amplificação no menu suspenso do tipo de gráfico, selecione o gráfico que exibe os dados de amplificação como as leituras de fluorescência, normalizadas para a fluorescência da referência passiva em função do número do ciclo, no menu suspenso de cores do gráfico, selecione amostra.

No menu suspenso do tipo de gráfico, selecione o tipo de gráfico de amplificação linear, verifique se o ciclo inicial e final da linha de base está definido corretamente. O ciclo final deve ser definido alguns ciclos antes do número do ciclo em que um sinal fluorescente significativo é detectado. No menu suspenso do tipo de gráfico, selecione o tipo de gráfico de amplificação log 10, mostre a linha de limite no gráfico selecionando a opção de limite e ajuste o limite.

A linha de limiar deve cruzar a fase exponencial nas curvas de qPCR. Verifique se todos os poços de amostra e controle positivo têm curvas de amplificação normais e se não há amplificação nos poços NTC. Um gráfico de amplificação normal mostra um aumento exponencial na florescência que excede o limite entre os ciclos 15 e 35.

Nas curvas de fusão derivadas, revise as regiões pré e pós-fusão ou linhas de temperatura. As regiões pré e pós-fusão devem estar dentro de uma área plana onde não haja grandes picos ou declives nos níveis fluorescentes. Se necessário, defina o início e a parada das linhas de temperatura pré e pós-fusão, aproximadamente 0.5 graus Celsius uma da outra.

Reinicie a análise se os parâmetros forem ajustados clicando no botão analisar. Na guia de configurações de plotagem da guia do pote de diferença, escolha uma das réplicas de controle de tipo selvagem como o DNA de referência e reinicie a análise clicando no botão analisar. Na guia Curvas de fusão alinhadas, confirme se todos os controles positivos têm o genótipo correto e se o NTC falhou em amplificar.

Na tabela de poços, selecione um poço de controle para destacar a curva de fusão correspondente nos gráficos de análise e confirme se a cor da linha corresponde ao genótipo correto. Na guia curvas de fusão alinhadas, revise cuidadosamente as exibições de plotagem para as amostras desconhecidas e compare-as com as exibições de plotagem para controles. Selecione os poços que contêm as réplicas de amostra desconhecidas e alinhe as curvas de fusão com os controles em uma sequência ordenada, selecionando os poços que contêm os controles um por um.

Analise o resultado da amostra desconhecida na guia Gráfico de Diferença para verificar se os resultados obtidos são consistentes. Selecione os poços que contêm as réplicas de amostra desconhecidas e alinhe as curvas de fusão com os controles em uma sequência ordenada, selecionando os poços contendo controles um por um. Execute os produtos qPCR HRM em um gel pré-moldado de 4% de agarose contendo uma cepa de ácido nucleico fluorescente.

Execute apenas um NTC negativo positivo e sample réplicas de qPCR HRM. Retire o gel pré-fabricado e a da embalagem, retire o pente e introduza o gel no aparelho de acordo com as instruções do fabricante. Dilua uma amostra de 10 microlitros para 20 microlitros com água livre de RNA e DNA estéril e carregue cada poço com 20 microlitros da amostra diluída.

Dilua três microlitros de solução padrão de tamanho de DNA para 20 microlitros e carregue-o no poço do marcador. Encha todos os poços vazios com 20 microlitros de água livre de RNA e DNA estéril. Selecione imediatamente o programa de acordo com a porcentagem do gel que está sendo executado e defina o tempo de execução no aparelho para 20 minutos.

Inicie a eletroforese dentro de um minuto após o carregamento das amostras. Quando a eletroforese estiver concluída, visualize o DNA e o gel usando luz azul ou transiluminação UV. E a região de interesse do DNA amplificada com sucesso com um aumento exponencial de fluorescentes que excede o limite entre os ciclos 15 e 35 e valores muito estreitos do ciclo de quantificação em todas as réplicas e controles é um pré-requisito para a identificação confiável da variância genética por análise de fusão de alta resolução.

A análise HRM é realizada imediatamente após o qPCR, as regiões de fusão ativas das amostras, os controles e o NTC são usados para criar seus gráficos de curva de fusão alinhados. As regiões pré e pós-fusão definidas corretamente são importantes para visualizar e identificar adequadamente a variação genética nas amostras. Curvas de fusão alinhadas e diferentes potes são mostrados aqui.

As amostras desconhecidas estão fortemente alinhadas com um dos controles positivos. Regiões pré e pós-fusão ou linhas de temperatura definidas incorretamente resultam em curvas de fusão alinhadas e gráficos diferentes onde a identificação correta da variância genética é mais difícil. A variante genética na amostra pode ser identificada comparando o padrão de bandas da amostra com os controles.

E combinando a eletroforese em gel HRM e agarose. A identificação correta da variante genética só pode ser feita para as amostras que contêm a mesma variante genética de um dos controles usados no ensaio HRM. Amostras contendo variantes genéticas raras de calreticulina diferem no resultado da HRM e no padrão de banda de eletroforese.

Ao tentar este protocolo, é importante comparar cuidadosamente as exibições do gráfico da curva de fusão alinhada das amostras conhecidas e de controle.