Protocolo de injeção de lipidico para medições de cristalografia serial no Síncrotron Australiano

Este protocolo oferece aos cientistas a oportunidade de caracterizar cristais de proteínas embutidos em materiais altamente viscosos, bem como outros materiais macios atualmente difíceis de caracterizar usando as configurações existentes. Usando este método, as amostras são preparadas em seringas de vidro, montadas diretamente no injetor, tornando o sistema injetor fácil de usar e minimizando o desperdício de amostras. Para preparar cristais em um meio de alta viscosidade, primeiro centrifugue a solução cristalina em baixa velocidade para formar uma pastilha de cristal macio.

Depois de remover o excesso de meio, prenda um acoplador na extremidade de uma seringa de vidro de 100 microlitros e carregue 28 microlitros da solução cristalina no corpo da seringa. Insira lentamente o êmbolo na parte superior da seringa e empurre suavemente a solução até a extremidade da ponta do acoplador. Para remover bolhas, use um dedo enluvado para aplicar uma pressão muito suave na parte superior da ponta da agulha do acoplador embotado para criar uma vedação e retraia o êmbolo para afastar a solução da ponta da agulha para criar um acúmulo de pressão dentro da seringa e, em seguida, remova o dedo para liberar rapidamente a pressão e estourar quaisquer bolhas dentro da seringa.

Em alternativa, segure a seringa com uma das mãos com a agulha virada para cima e o êmbolo preso entre dois dedos e rode rapidamente o braço que segura a seringa numa direção duas a três vezes. A força centrífuga resultante forçará quaisquer bolhas de ar para fora da seringa. Quando todas as bolhas tiverem sido removidas, use uma espátula fina para adicionar 42 microlitros de graxa de silicone de alto vácuo diretamente no topo de uma segunda seringa de 100 microlitros e pressione o êmbolo até o final para remover quaisquer bolhas de ar e garantir que não haja espaço de ar na extremidade da seringa.

Quando todas as bolhas tiverem sido removidas de ambas as seringas, segurando ambas as seringas pelas pontas, prenda as seringas com o acoplador. Para misturar as amostras, pressione suavemente sequencialmente a solução de cristal e os êmbolos da seringa de graxa de silicone 50 a 100 vezes até que os materiais estejam bem misturados e pareçam homogêneos. Em seguida, visualize os cristais sob um microscópio óptico.

Para determinar a concentração de cristais na graxa de silicone, conte o número de cristais em uma área específica usando as imagens do microscópio óptico. Para diminuir a concentração do cristal, repita a preparação do cristal usando um volume maior de graxa de silicone ou dilua o pellet de cristal no tampão de cristalização antes da configuração da seringa. Para aumentar a concentração do cristal, repita a preparação do cristal usando um volume menor de graxa de silicone, tomando cuidado para não reduzir a viscosidade abaixo de 10 segundos pascal.

Quando a concentração de cristal apropriada for obtida, mova toda a amostra para uma única seringa e substitua o acoplador por uma agulha de injeção de diâmetro interno de 108 mícrons aparafusada firmemente na base da seringa. Para configurar o injetor, selecione as ferramentas e o modo de retorno e o interruptor de limite negativo e inicie o retorno e deixe o software funcionar até que o parafuso seja retraído o suficiente para que uma seringa de 100 microlitros caiba sob o parafuso. Insira a agulha de uma seringa vazia através da fenda no suporte da seringa para montar a seringa no injetor e alinhe a seringa contra o suporte.

Enrole um O-ring na seção intermediária da seringa, prendendo o anel aos ganchos em ambos os lados da seringa e enrole um segundo O-ring ao redor dos ganchos na parte superior da seringa. Certifique-se de que uma parte do segundo O-ring esteja posicionada em cima da seringa de vidro. Para preparar a seringa de amostra, prepare a seringa, coloque a tampa do injetor na cabeça do êmbolo da seringa de amostra e carregue a seringa no injetor.

Mova o parafuso de acionamento para a parte superior da tampa. No software de controle do injetor, selecione o modo de velocidade e ative o modo de velocidade. Defina o valor de configuração para 3.000 rotações por minuto e clique em aplicar valor de configuração.

À medida que o parafuso se aproxima da tampa da cabeça do êmbolo da seringa, altere o valor de configuração para zero. Uma vez feito o contato, clique em aplicar valor de configuração para ativar o valor predefinido, parando o parafuso instantaneamente. Em seguida, mexa suavemente a tampa para se certificar de que está firmemente presa no lugar.

Para operar o injetor, altere o valor de configuração para 100 rotações por minuto e inspecione visualmente a ponta para observar a amostra quando ela começa a extrudar. Depois de fechar a gaiola, diminua o valor de configuração em decréscimos de 10 até que um fluxo lento, mas estável, de material seja observado. Se o sample fluxo não fluir bem, aumente o valor de configuração em incrementos de 10 rotações por minuto até que o fluxo fique mais reto.

Se o fluxo não estabilizar, insira um coletor de amostra de poliestireno sob o fluxo de amostra para ajudar a guiar a amostra. Como alternativa, insira um funil de sucção Venturi no coletor de amostras, que pode ser conectado ao tubo de saída de ar localizado na gaiola do síncrotron australiano. Para determinar a vazão do fluxo, use a calculadora de vazão do dispositivo Lipidico.

Determinar a velocidade ideal de execução da amostra para o injetor é crucial para a estabilidade do fluxo. Uma taxa de fluxo lenta resulta em uma expansão da extrusão de graxa de silicone do injetor, enquanto uma taxa de fluxo mais rápida produz um fluxo mais fino. A ondulação do fluxo de mídia viscosa tem sido observada regularmente.

Para superar esse problema em amostras altamente carregadas, um coletor de poliestireno pode ser usado para introduzir uma força eletrostática fraca. Nessa análise, foi utilizada uma seringa de vidro contendo 26 microlitros de cristais de lisozima suspensos em graxa de silicone. Uma quantidade suficiente de dados foi coletada em 38 minutos, permitindo a geração do mapa de densidade eletrônica em torno das ligações dissulfeto na estrutura da lisozima.

Lembre-se de usar um pequeno volume de amostra na lâmina de vidro para avaliar a concentração de cristal da amostra para determinar se a viscosidade precisa ser corrigida. A versatilidade do injetor permite a caracterização por raios X de outros materiais altamente viscosos. Por exemplo, estruturas líquidas iônicas usando pesquisa de bateria ou materiais coloidais usando laticínios.