Name: Protocolo de injeção de lipidico para medições de cristalografia serial no Síncrotron Australiano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprenda a preparar cristais de proteínas em meios viscosos usando o injetor Lipidico no Síncrotron Australiano. Este protocolo minimiza o desperdício de amostras e facilita a caracterização de materiais macios em cristalografia serial.

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Este trabalho foi apoiado pelo Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Esta pesquisa foi realizada em parte usando a linha de feixe MX2 no Síncrotron Australiano, parte do ANSTO, e fez uso do detector da Australian Cancer Research Foundation (ACRF).

1. Preparação de cristais em uma mídia viscosa alta usando seringas de vidro
<ol><li>Centrifugar a solução de cristal suavemente (~1.000 x g, ~10 min a 22 °C) para formar uma pelota de cristal macio e remover o excesso de tampão. Isso resultará em uma alta concentração de cristais na pelota que podem ser usados para coleta de dados. NOTA: Para evitar a diluição da mídia viscosa aumente a concentração de cristal nesta etapa. Otimize a proporção de mídia viscosa ao volume de cristal para cada amostra para obter uma alta concentração de cristais, mantendo uma alta viscosidade para a mídia. Centrifugar a solução de cristal para formar uma pelota e remover o excesso de tampão para aumentar a concentração de cristal na solução, como descrito em Darmanin et. al.29.</li>
	<li>Configure duas seringas de 100 μL com um acotodo.</li>
	<li>Aperte o acostreiro até o final da primeira seringa e adicione 28 μL de solução cristalina ao topo da seringa. Lentamente, insira o êmbolo na parte superior da seringa e empurre suavemente a solução até o final da ponta do acoocoplador, removendo quaisquer bolhas de ar que se formam. Faça isso seguindo um dos dois métodos discutidos abaixo. NOTA: O volume de cristais a serem adicionados à mídia viscosa alta pode ser variado se não alterar significativamente a viscosidade da amostra geral.<ol>
<li>Primeiro método: Use mudanças rápidas de pressão para estourar as bolhas de ar.<ol>
<li>Coloque cuidadosamente um dedo enluvado na parte superior do ponto de agulha acotodo e (muito suavemente) aplique pressão para criar uma vedação. Não aplique muita pressão, pois isso pode resultar em uma lesão na agulha.</li>
			<li>Agora puxe o êmbolo de volta para afastar a solução do ponto da agulha, isso vai gerar um acúmulo de pressão na seringa.</li>
			<li>Solte rapidamente a pressão na parte superior da seringa removendo o dedo enluvado da ponta da agulha. Tenha cuidado, se a amostra estiver muito perto da ponta quando o dedo for removido, pode pulverizar, resultando na perda da amostra. A rápida mudança de pressão dentro da seringa vai estourar as bolhas de ar. Repita até que todas as bolhas tenham sido removidas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Segundo método: Usar a "centrífuga humana" para remover bolhas de ar.<ol>
<li>Coloque a seringa em uma mão com a agulha voltada para cima e o êmbolo preso entre dois dedos, de modo que não possa se mover.</li>
			<li>Gire rapidamente o braço segurando a seringa em uma direção 2-3 vezes, a força centrífuga resultante na amostra forçará qualquer bolha de ar para fora da seringa. Tenha cuidado, se for feita muito lentamente a amostra pode ser perdida.</li>
			<li>Inspecione a seringa em busca de bolhas de ar, se as bolhas permanecerem, repita as etapas 1.3.2.1 – 1.3.2.2 até que todas as bolhas de ar sejam removidas.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Com uma espátula fina, adicione ~42 μL de graxa de silicone de alto vácuo diretamente ao topo da segunda seringa. Empurre o êmbolo até o fim, removendo todas as bolhas de ar e garantindo que não haja abertura de ar no final da seringa. NOTA: A composição precisa da graxa de silicone não é crítica, pois está agindo como um portador inerte. Um valor de viscosidade de >10 Pa.s ou razão de aproximadamente 60:40 graxa de silicone para solução de cristal é ideal para injeção, no entanto, é possível que isso possa variar dependendo das características exatas da amostra. Ajuste o volume da solução cristalina adicionada à graxa de silicone para otimizar a concentração de cristal na mistura, conforme descrito na discussão. A mídia de alta viscosidade que não a graxa de silicone pode ser usada desde que sejam compatíveis com a amostra30,31,32,33.</li>
	<li>Certifique-se de que não há bolhas de ar em nenhuma das duas seringas e conecte as seringas juntas usando o acoedador. Segure as seringas verticalmente, agarrando apenas a extremidade da seringa, pois o aquecimento da seringa devido ao calor gerado pelos dedos pode afetar a amostra.</li>
	<li>Misture a amostra deprimindo suavemente o êmbolo do lado da solução de cristal para que se misture na graxa de silicone e, em seguida, empurre o êmbolo no lado da graxa de silicone, de modo que ele empurre a amostra de volta para o lado da solução de cristal. Suavemente, repita este processo 50 a 100 vezes para que a amostra seja completamente misturada e pareça homogênea. NOTA: Se os cristais forem cultivados diretamente em mídia altamente viscosa (por exemplo, fase cúbica lipídica, LCP), as etapas 1.1-1.6 não são necessárias. Protocolos para o cultivo de cristais dentro das seringas podem ser encontrados em Liu et.al. 34,35. Siga este protocolo até a consolidação da amostra, etapa 10, onde toda a amostra está agora contida em uma seringa e o tampão de cristalização é removido. A adição de 7.9MAG não é necessária para este protocolo. Em vez disso, remova todo o excesso de líquido da seringa empurrando suavemente o êmbolo para baixo na amostra até que não haja mais líquido na seringa.</li>
	<li>Visualize os cristais sob um microscópio óptico através da seringa ou, para obter melhores resultados, extraia uma pequena quantidade (~1 μL) em um slide de vidro e coloque um deslizamento de tampa na parte superior.</li>
	<li>Verifique a concentração de cristal.<ol>
<li>Determine a concentração de cristal na graxa de silicone contando o número de cristais em uma área específica usando as imagens do microscópio óptico. Para obter melhores resultados, uma alta densidade de cristais uniformemente dispensados em toda a mídia é ideal (>106 cristais/mL) a fim de obter uma alta taxa de acerto de cristal.</li>
		<li>Ajuste a concentração de cristal na seringa alterando a proporção de cristais para mídia viscosa nas etapas 1.3 e 1.4.<ol>
<li>Para diminuir a concentração de cristal, dilui os cristais na seringa aumentando a quantidade de graxa de silicone/mídia HV na etapa 1.4 ou diluindo a pelota de cristal em solução com o tampão de cristalização antes de configurar as seringas na etapa 1.1.</li>
			<li>Para aumentar a concentração de cristal, diminua a quantidade de graxa de silicone na etapa 1.4, mas tenha em atenção para não reduzir a viscosidade abaixo de 10 Pa.s. NOTA: A concentração de cristal relatada aqui foi otimizada para esta amostra específica e tamanho de cristal. No entanto, a concentração ideal de cristal dependerá do tamanho do cristal, do tamanho do feixe, do diâmetro interno da agulha (I.D.), e do fluxo de raios-X incidentes. Isso pode ser determinado a partir da taxa de acerto com uma taxa de acerto ideal de ~30% considerada como 'boa'. Na prática, a concentração de cristal deve ser otimizada para diferentes amostras durante o tempo do feixe para obter a taxa de acerto desejada. Comece com uma alta concentração de cristais, 109 cristais/mL. O procedimento para ajustar a concentração de cristal é dado em Liu et.al. 35.</li>
		</ol>
</li>
		<li>O protocolo pode ser pausado aqui até que o injetor esteja pronto para coleta de dados.<ol>
<li>Se os cristais são cultivados em LCP, então sele-os e deixe-os permanecer em seringas por até alguns dias à temperatura ambiente.</li>
			<li>Se os cristais foram transferidos para uma mídia viscosa diferente (por exemplo, graxa de silicone), então um teste de estabilidade dos cristais ao longo do tempo deve ser realizado antes da medição. Isso determinará quanto tempo os cristais estão estáveis na mídia inerte (idealmente > 8 h) e o prazo para coleta de dados. Aqui, os cristais de lise foram estáveis por dias em graxa de silicone e não mostraram sinais de dissolução quando inspecionados usando um microscópio óptico.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Mova toda a amostra para uma seringa antes de desconectar o acotravador. Desconecte o acotrador da seringa e conecte a agulha de injeção. Enrosque a agulha firmemente na base da seringa e certifique-se de que ela está bem presa para evitar vazamentos. Uma agulha de 108 μm (comprimento da agulha 13 mm, estilo ponto 3) foi usada para este experimento. Dependendo do tamanho do cristal e do tamanho do feixe, conecte uma agulha de 51 μm ou 108 μm. NOTA: O pré-teste do fluxo de amostras antes do tempo do feixe é necessário para poder selecionar o tamanho correto da agulha do injetor. Dependendo das características da amostra (ou seja, viscosidade, carregamento, composição tampão) e da ID da agulha, as amostras fluirão de forma diferente. Portanto, recomenda-se testar uma variedade de tamanhos de agulha para produzir o fluxo mais estável com a menor agulha de I.D. possível para maximizar a relação sinal-ruído durante a coleta de dados.</li>
	<li>Se o injetor já estiver montado e alinhado na linha do feixe, mova-se para a seção 3 e monte a seringa da amostra diretamente no injetor. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol>2. Montagem e controle do injetor
<ol><li>Monte o injetor na linha de vigas. Remova o bocal criogênico na linha de feixe MX2 e substitua-o pelo injetor. Solte o parafuso de fixação que segura o bocal criogênico e fixe-o ao suporte localizado ao lado do estágio motorizado.</li>
	<li>Levante o injetor do carrinho segurando a alça preta e coloque-o no palco motorizado.<ol>
<li>Para fixar o injetor ao estágio motorizado; aperte a mão do botão do parafuso de fixação preto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monte uma seringa vazia no injetor<ol>
<li>Na interface de controle do computador injetor (ou seja, software de controle de posição EPOS), selecione O Modo Homing em Ferramentas no menu de software. Em seguida, selecione O Interruptor de Limite Negativo e o Início do Homing,deixe o software funcionar até que o parafuso seja retraído o suficiente para que a seringa encaixe sob o parafuso. Se deixado para funcionar sem supervisão, o interruptor de limite pára automaticamente o parafuso.</li>
		<li>Monte uma seringa vazia ('manequim') no injetor inserindo a agulha através da fenda no suporte da seringa. Alinhe a seringa contra o suporte.</li>
		<li>Aperte a seringa com dois anéis O.<ol>
<li>Enrole o primeiro o-ring através da seção média da seringa anexando-o aos ganchos em ambos os lados da seringa.</li>
			<li>Enrole o segundo o-ring em torno dos ganchos na parte superior da seringa e, em seguida, coloque uma parte do anel O no topo da seringa de vidro, como mostrado na demonstração e figura 1B.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alinhe o injetor ao raio-X<ol>
<li>Mova o estágio motorizado com o injetor em direção ao ponto de interação de raios-X através do software de controle de linha de vigas. Isso pode ser visualizado usando a câmera inline. O tamanho e a posição do feixe são denotados por uma cruz vermelha na tela e o estágio motorizado pode ser movido para alinhar a agulha com a região de interação raio-X.</li>
		<li>Ajuste a posição x e y do palco para alinhar a agulha com a cruz vermelha.</li>
		<li>Ajuste a posição z até que a ponta da agulha entre em foco.</li>
		<li>Verifique o alinhamento da ponta da agulha e do raio-X visualmente verificando se a ponta da seringa atende às miras que são visíveis na imagem do microscópio óptico gerada pela câmera de linha de luz.</li>
		<li>Uma vez que a ponta da agulha esteja alinhada, mova a ponta acima dos cabelos cruzados ~100 μm. Isso elimina a dispersão de raios-X da ponta da agulha. NOTA: A montagem e o alinhamento do injetor na linha de feixe MX2 no síncrotron devem ser realizados pelos cientistas da linha de trave e podem ser concluídos em menos de 30 minutos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Montagem da seringa amostral
<ol><li>Substitua a seringa vazia pela seringa amostrada seguindo o passo 2.3.</li>
	<li>Coloque a tampa injetora na cabeça do êmbolo da seringa da amostra.</li>
	<li>Mova o parafuso da unidade para a parte superior da tampa.</li>
	<li>No software de controle do injetor selecione Modo Velocidade.</li>
	<li>Entrada 3000 rpm (~115 nL/s) como o Valor de Configuração e pressione aplicar valor de configuração.</li>
	<li>Quando o parafuso da unidade tocar a tampa na cabeça do êmbolo da seringa, pare o motor.<ol>
<li>Defina o valor rpm a zero no software de controle do injetor alterando o Valor de Configuração para '0' à medida que o parafuso se aproxima da tampa.</li>
		<li>Uma vez feito o contato, ative o valor predefinido pressionando Aplicar valor de configuração para parar o parafuso instantaneamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mova suavemente a tampa para ter certeza de que ela está firmemente presa no lugar. NOTA: Sempre que um novo valor definido é inserido na caixa "Definir valor" no software de controle, ele só é ativado após pressionar o Apply Setting Value.</li>
</ol>4. Executando o injetor
<ol><li>Depois que o parafuso da unidade da tampa tiver feito contato firme com a parte superior do êmbolo, mude o valor de configuração rpm para 100. Isso equivale a ~ 4 nL/s.</li>
	<li>Inspecione visualmente a ponta da agulha quando a amostra sair pela primeira vez ou olhe a imagem da câmera de feixe da agulha para observar quando a amostra começa a extrusão da ponta da agulha.</li>
	<li>Faça uma busca na cabana, feche a porta da cabana e ligue o raio-X. A partir deste ponto, o injetor deve ser operado remotamente de fora da cabana.</li>
	<li>Sintonize o rpm até que um fluxo estável seja gerado.<ol>
<li>Diminua o valor de configuração rpm para 90.</li>
		<li>Repita o passo 4.4.1, diminuindo o valor de ajuste rpm em incrementos de 10, para diminuir a velocidade do fluxo, mas ainda manter um fluxo estável. Para graxa de silicone foi utilizado um valor de 30 rpm. NOTA: A faixa típica de rpm varia entre 30 a 100 rpm (1 – 4 nL/s) dependendo das características da amostra e do tempo de exposição ao raio-X. Em geral, a rpm deve ser ajustada para produzir a taxa de fluxo mais lenta (para minimizar o consumo de amostras) mantendo um fluxo estável.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gerenciamento de um fluxo de amostra que não flui bem.<ol>
<li>Continue aumentando o valor de configuração rpm em incrementos de 10 até que o fluxo fique mais reto. Se o fluxo não estabilizar, mesmo depois de aumentar o valor de ajuste rpm para o valor máximo de 100 rpm tente melhorar a estabilidade implementando um dos dois métodos descritos abaixo.<ol>
<li>Primeiro método: Insira um apanhador de amostras de poliestireno sob o fluxo de amostras para ajudar a guiar a amostra. Este método funciona bem para fluxos de amostras altamente carregados.</li>
			<li>Segundo método: Insira um funil de sucção venturi no apanhador de amostras. Para fornecer ar ao funil, conecte-o ao tubo de saída de ar localizado na cabana. Este método pode auxiliar na direção e estabilização do fluxo amostral independente da carga do fluxo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez alcançado um fluxo constante e constante, inicie a coleta de dados e otimize a distância do detector de acordo com um experimento normal de cristalografia de raios-X. NOTA: A rpm é convertida em taxa de fluxo usando a tabela de conversão fornecida na Information Complementar, 'Lipidico Device Calculator'. Digite o valor de rpm, diâmetros da agulha e volumes de seringa para calcular a taxa de fluxo usando esta calculadora.</li>
</ol>

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<li>Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Liquid+Handling+for+Life+Science%3A+A+critical+review+of+the+current+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).</li>
</ol>

MK trabalha para projetos Kusel. Kusel Design, um desenvolvedor de dispositivos de laboratório personalizado, foi contratado pelo Dr. Peter Bentsen da Universidade de La Trobe e pelo Dr. Tom Caradoc-Davies da ANSTO e para desenvolver um dispositivo de baixo custo para permitir estudos viscosos elevados na linha de feixe MX2 no Síncrotron Australiano. O dispositivo foi desenvolvido em estreita consulta com o Dr. Caradoc-Davies. Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Um HVI alternativo foi desenvolvido, ideal para a realização de experimentos SX em fontes síncrotrons. Ele tem duas vantagens fundamentais sobre os HVIs existentes. Primeiro, é fácil instalar na linha de trave permitindo uma comutação rápida entre cristalografia convencional e SX, apenas ~30 minutos é necessário para instalação e alinhamento no MX2. Em segundo lugar, as seringas amostrais usadas para cultivar cristais podem ser usadas diretamente como reservatórios para injeção, limitando o desperdício durante a transfer...

A cristalografia serial (SX) é uma técnica que foi desenvolvida inicialmente no contexto de Lasers eletrônicos livres de raios-X (XFELs)1,2,3,4. Embora abordagens de alvo fixas possam ser usadas para SX5,6,7, normalmente, sistemas injetores são empregados para fornecer cristais em um fluxo contínuo para o feixe de raios-X. Por combinar dados de um grande número de cristais, o SX evita a necessidade de qualquer alinhamento de cristal durante o experimento, e permite que os dados sejam coletados à temperatura ambiente8,9. Com o auxílio de um injetor adequado, os cristais são transmitidos um a um na área de interação com raios-X e os dados de difração resultantes são coletados em um detector de área9,10. Até o momento, a SX foi bem sucedida na resolução de uma série de estruturas proteicas1,11,12,13 incluindocristais muito pequenos para medir usando a cristalografia convencional. Ele também forneceu novas percepções sobre a dinâmica molecular resolvida pelo tempo explorando a duração do pulso femtosegundo do XFEL. Iniciando reações de bomba-sonda com fontes ópticas de laser, estudos aprofundados foram realizados no fotossistema II14,15, proteína amarela fotoativa16,17, citocromo C oxidase18, bem como bacteriorhodopsin19,20,21. Esses estudos sondaram a dinâmica de transferência de elétrons que ocorrem após a ativação da luz demonstrando o potencial significativo da cristalografia serial para a compreensão de processos biológicos resolvidos pelo tempo.
O desenvolvimento da cristalografia serial também está se tornando cada vez mais prevalente nas fontes síncrotrons9,12,20,22,23,24. O SX baseado em síncrotron permite que um grande número de cristais individuais seja medido eficientemente à temperatura ambiente usando um sistema injetor apropriado. Essa abordagem é adequada para cristais menores, portanto, além de exigir um detector rápido de taxa de quadros para coletar os dados, um feixe micro-focado também é necessário. Em comparação com a cristalografia convencional, o SX não envolve a montagem e alinhamento de cristais individuais no feixe de raios-X. Como os dados de um grande número de cristais individuais são mesclados, a dose de radiação recebida por cada cristal pode ser substancialmente reduzida em comparação com a cristalografia convencional. O SX síncrotron também pode ser aplicado ao estudo de reações resolvidas pelo tempo, mesmo até o regime de milissegundos, desde que um detector com uma taxa de quadro suficientemente alta esteja disponível (por exemplo, 100 Hz ou mais). Vários experimentos de cristalografia serial foram realizados no síncrotron usando injetores que foram inicialmente desenvolvidos nas fontes XFEL20,22,23. Os dois tipos mais comuns de injetor são o Bocal Virtual Gas Dynamic (GDVN)25 e o Injetor Viscoso Alto (HVI)9,24,26,27,28. O GDVN é ideal para injetar baixa viscosidade, amostras líquidas, mas requer altas taxas de fluxo para alcançar fluxos estáveis, o que por sua vez leva a altas taxas de consumo amostral. Em contrapartida, os HVI's são adequados para amostras de alta viscosidade que permitem a geração de um fluxo estável a taxas de fluxo muito mais baixas, levando a um consumo amostral muito menor. O injetor HVI, portanto, favorece a entrega de amostras onde um portador viscoso é preferível (por exemplo, à base de lipídios para proteínas de membrana) e/ou grandes quantidades de amostra não estão disponíveis. Os injetores SX são geralmente desafiadores de usar e requerem treinamento extensivo para operar. Eles também envolvem protocolos longos de transferência de amostras, uma vez que a amostra precisa ser carregada em um reservatório especializado, isso geralmente tem um alto risco associado a ela de a amostra ser perdida no 'volume morto' ou através de vazamentos nas conexões. Portanto, é desejável otimizar o design do injetor para mitigar quaisquer perdas antes da amostra atingir o feixe de raios-X.
Recentemente, os primeiros resultados do SX foram publicados usando Lipidico23 com um alvo lysozyme, usando um detector Eiger 16M. Este projeto do injetor limita o desperdício da amostra, minimizando o número de etapas envolvidas na ida da cristalização inicial à transferência de cristais no injetor seguido pela entrega da amostra para o feixe de raios-X. Este manuscrito descreve e demonstra o procedimento de transferência de amostras a partir da preparação da amostra, passando para o processo de injeção e, finalmente, coleta de dados, usando o mesmo vaso de cristalização. O funcionamento do injetor também é descrito.

<table><tbody><tr><td>Lisozima de clara de ovo de galinha</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>Usada para cultivar cristais para testar o injetor e os cristais são transferidos para a graxa de silicone. https://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>Graxa de silicone de alto vácuo</td><td>Dow Corning</td><td>Z273554-1EA</td><td>Usada para teste de injetor. https://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>Agulha do injetor (108 &micro; m ID)</td><td>Hamilton</td><td>part No: 7803-05</td><td>www.hamiltoncompany.com</td></tr><tr><td>Seringas de vidro à prova de gás, 100 &micro; l</td><td>Hamilton</td><td>número da peça: 7656-01</td><td>Seringas usadas para injeção de amostras. www.hamiltoncompany.com</td></tr><tr><td>Acoplador de seringa LCP</td><td>Formulatrix</td><td>209526</td><td>Acoplador de seringa para misturar as amostras</td></tr><tr><td>Injetor Lipidico</td><td>La Trobe Univerity/ANSTO</td><td></td><td>Este é um equipamento específico que pode ser acessado através da La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility</td></tr></tbody></table>

protocolo de injeção de lipidico para medições de cristalografia serial no síncrotron australiano

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

Uma instalação para a realização de medições de cristalografia serial foi desenvolvida no síncrotron australiano. Esta instalação incorpora um injetor viscoso de alto efeito construído, Lipidico, como parte da linha de cristalografia macromolecular (MX2) para medir um grande número de pequenos cristais à temperatura ambiente. O objetivo desta técnica é permitir que cristais sejam cultivados/transferidos para seringas de vidro para serem usados diretamente no injetor para coleta de dados de cristalografia serial. As vantagens deste injetor incluem a capacidade de responder rapidamente às mudanças na taxa de fluxo sem interrupção do fluxo. Existem várias limitações para este injetor de alta viscosidade (HVI) que incluem uma restrição sobre as viscosidades amostrais permitidas para >10 Pa.s. A estabilidade do fluxo também pode ser um problema potencialmente dependendo das propriedades específicas da amostra. Um protocolo detalhado de como configurar amostras e operar o injetor para medições de cristalografia serial no síncrotron australiano é apresentado aqui. O método demonstra a preparação da amostra, incluindo a transferência de cristais de lise em uma alta mídia viscosa (graxa de silicone), e o funcionamento do injetor para coleta de dados em MX2.

Lipidico é um HVI construído como um sistema de entrega alternativa para uso em MX2 (Figura 1). É ideal para SX onde os cristais são cultivados em fase cúbica lipídica ou transferidos para uma alta mídia inerte viscosa.
Para demonstrar a aplicação injetora, a graxa de silicone misturada com cristais de lisezímola foi usada para coletar dados SX na linha de feixe MX2 no síncrotron australiano. Para montar o injetor na linha de feixe MX2, o bocal criogênico é removi...

O objetivo deste protocolo é demonstrar como preparar amostras de cristalografia serial para coleta de dados em um injetor viscoso alto, Lipidico, recentemente encomendado no síncrotron australiano.

Protocolo de injeção de lipidico para medições de cristalografia serial no Síncrotron Australiano

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

Este protocolo oferece aos cientistas a oportunidade de caracterizar cristais de proteínas embutidos em materiais altamente viscosos, bem como outros materiais macios atualmente difíceis de caracterizar usando as configurações existentes. Usando este método, as amostras são preparadas em seringas de vidro, montadas diretamente no injetor, tornando o sistema injetor fácil de usar e minimizando o desperdício de amostras. Para preparar cristais em um meio de alta viscosidade, primeiro centrifugue a solução cristalina em baixa velocidade para formar uma pastilha de cristal macio.Depois de remover o excesso de meio, prenda um acoplador na extremidade de uma seringa de vidro de 100 microlitros e carregue 28 microlitros da solução cristalina no corpo da seringa. Insira lentamente o êmbolo na parte superior da seringa e empurre suavemente a solução até a extremidade da ponta do acoplador. Para remover bolhas, use um dedo enluvado para aplicar uma pressão muito suave na parte superior da ponta da agulha do acoplador embotado para criar uma vedação e retraia o êmbolo para afastar a solução da ponta da agulha para criar um acúmulo de pressão dentro da seringa e, em seguida, remova o dedo para liberar rapidamente a pressão e estourar quaisquer bolhas dentro da seringa.Em alternativa, segure a seringa com uma das mãos com a agulha virada para cima e o êmbolo preso entre dois dedos e rode rapidamente o braço que segura a seringa numa direção duas a três vezes. A força centrífuga resultante forçará quaisquer bolhas de ar para fora da seringa. Quando todas as bolhas tiverem sido removidas, use uma espátula fina para adicionar 42 microlitros de graxa de silicone de alto vácuo diretamente no topo de uma segunda seringa de 100 microlitros e pressione o êmbolo até o final para remover quaisquer bolhas de ar e garantir que não haja espaço de ar na extremidade da seringa.Quando todas as bolhas tiverem sido removidas de ambas as seringas, segurando ambas as seringas pelas pontas, prenda as seringas com o acoplador. Para misturar as amostras, pressione suavemente sequencialmente a solução de cristal e os êmbolos da seringa de graxa de silicone 50 a 100 vezes até que os materiais estejam bem misturados e pareçam homogêneos. Em seguida, visualize os cristais sob um microscópio óptico.Para determinar a concentração de cristais na graxa de silicone, conte o número de cristais em uma área específica usando as imagens do microscópio óptico. Para diminuir a concentração do cristal, repita a preparação do cristal usando um volume maior de graxa de silicone ou dilua o pellet de cristal no tampão de cristalização antes da configuração da seringa. Para aumentar a concentração do cristal, repita a preparação do cristal usando um volume menor de graxa de silicone, tomando cuidado para não reduzir a viscosidade abaixo de 10 segundos pascal.Quando a concentração de cristal apropriada for obtida, mova toda a amostra para uma única seringa e substitua o acoplador por uma agulha de injeção de diâmetro interno de 108 mícrons aparafusada firmemente na base da seringa. Para configurar o injetor, selecione as ferramentas e o modo de retorno e o interruptor de limite negativo e inicie o retorno e deixe o software funcionar até que o parafuso seja retraído o suficiente para que uma seringa de 100 microlitros caiba sob o parafuso. Insira a agulha de uma seringa vazia através da fenda no suporte da seringa para montar a seringa no injetor e alinhe a seringa contra o suporte.Enrole um O-ring na seção intermediária da seringa, prendendo o anel aos ganchos em ambos os lados da seringa e enrole um segundo O-ring ao redor dos ganchos na parte superior da seringa. Certifique-se de que uma parte do segundo O-ring esteja posicionada em cima da seringa de vidro. Para preparar a seringa de amostra, prepare a seringa, coloque a tampa do injetor na cabeça do êmbolo da seringa de amostra e carregue a seringa no injetor.Mova o parafuso de acionamento para a parte superior da tampa. No software de controle do injetor, selecione o modo de velocidade e ative o modo de velocidade. Defina o valor de configuração para 3.000 rotações por minuto e clique em aplicar valor de configuração.À medida que o parafuso se aproxima da tampa da cabeça do êmbolo da seringa, altere o valor de configuração para zero. Uma vez feito o contato, clique em aplicar valor de configuração para ativar o valor predefinido, parando o parafuso instantaneamente. Em seguida, mexa suavemente a tampa para se certificar de que está firmemente presa no lugar.Para operar o injetor, altere o valor de configuração para 100 rotações por minuto e inspecione visualmente a ponta para observar a amostra quando ela começa a extrudar. Depois de fechar a gaiola, diminua o valor de configuração em decréscimos de 10 até que um fluxo lento, mas estável, de material seja observado. Se o sample fluxo não fluir bem, aumente o valor de configuração em incrementos de 10 rotações por minuto até que o fluxo fique mais reto.Se o fluxo não estabilizar, insira um coletor de amostra de poliestireno sob o fluxo de amostra para ajudar a guiar a amostra. Como alternativa, insira um funil de sucção Venturi no coletor de amostras, que pode ser conectado ao tubo de saída de ar localizado na gaiola do síncrotron australiano. Para determinar a vazão do fluxo, use a calculadora de vazão do dispositivo Lipidico.Determinar a velocidade ideal de execução da amostra para o injetor é crucial para a estabilidade do fluxo. Uma taxa de fluxo lenta resulta em uma expansão da extrusão de graxa de silicone do injetor, enquanto uma taxa de fluxo mais rápida produz um fluxo mais fino. A ondulação do fluxo de mídia viscosa tem sido observada regularmente.Para superar esse problema em amostras altamente carregadas, um coletor de poliestireno pode ser usado para introduzir uma força eletrostática fraca. Nessa análise, foi utilizada uma seringa de vidro contendo 26 microlitros de cristais de lisozima suspensos em graxa de silicone. Uma quantidade suficiente de dados foi coletada em 38 minutos, permitindo a geração do mapa de densidade eletrônica em torno das ligações dissulfeto na estrutura da lisozima.Lembre-se de usar um pequeno volume de amostra na lâmina de vidro para avaliar a concentração de cristal da amostra para determinar se a viscosidade precisa ser corrigida. A versatilidade do injetor permite a caracterização por raios X de outros materiais altamente viscosos. Por exemplo, estruturas líquidas iônicas usando pesquisa de bateria ou materiais coloidais usando laticínios.

lipidico-injection-protocol-for-serial-crystallography-measurements

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Descrevemos procedimentos para a preparação e entrega de microcristais de proteínas de membrana em fase cúbica lipídica para cristalografia seriada em lasers de elétrons livres de raios-X e fontes síncrotron. Esses protocolos também podem ser aplicados para incorporação e entrega de microcristais de proteínas solúveis, levando a uma redução substancial do consumo de amostras em comparação com a injeção de líquidos.

Preparação e entrega de microcristais de proteína na fase cúbica lipídico para Serial Femtosecond Cristalografia

Um protocolo é apresentado para cristalografia de raios X usando microcristais de proteína. São comparados dois exemplos de análise de microcristos criados em vivo após purificação ou em celulósio .

Microcristalografia de Cristais de Proteína e<em&gt; Em Cellulo</em&gt; Difração

É apresentado um protocolo simplificado para realizar uma extensa Caracterização bioquímica e estrutural de uma proteína de ligação do substrato de hidrato de carbono do Streptococcus pneumoniae .

Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

Este protocolo descreve em detalhes como fabricar e operar dispositivos microfluídicos para coleta de dados de difração de raios x em temperatura ambiente. Além disso, descreve como monitorar a cristalização de proteínas por difusão dinâmica da luz e como processar e analisar obtidos dados de difração.

Chips microfluídicos por difração de raio x de cristal In Situ e In Situ Difusão dinâmica da luz de cristalografia de Serial

Aqui, descrevemos como usar a triagem automatizada e opções de coleta de dados disponíveis em um pouco de luz síncroton síncrotron. Os cientistas enviar amostras de cryocooled para o síncrotron e as propriedades de difração são selecionadas, os conjuntos de dados são recolhidos e tratados e, sempre que possível, uma solução de estrutura é realizada — tudo sem intervenção humana.

Caracterização totalmente autónoma e coleta de dados de cristais de macromoléculas biológicas

O sucesso de um experimento de cristalografia de tempo-resolvido serial femtosecond é dependente da entrega de amostra eficiente. Aqui, descrevemos os protocolos para otimizar a extrusão de Bacteriorrodopsina microcristais de um injector de microextrusão de alta viscosidade. A metodologia baseia-se na homogeneização da amostra com um romance acoplador de três vias e visualização com uma câmera de alta velocidade.

Melhorando a extrusão de alta viscosidade de microcristais de tempo-resolvido Serial Femtosecond cristalografia em Lasers de raio-x

Apresentamos um guia abrangente para preparação fixa de amostras de alvo, coleta de dados e processamento de dados para cristalografia síncrotron serial na linha de feixe Diamond I24.

Coleta de dados seriais de alvo fixo na fonte Diamond Light

Aqui, apresentamos um protocolo para preparação de amostras criogênicas e transferência de cristais para a estação final de vácuo na linha de luz I23 na Diamond Light Source, para experimentos de cristalografia de raios-X de comprimento de onda longa.

Protocolo de preparação e transferência de amostras para cristalografia de comprimento de onda longa no vácuo na linha de luz I23 na Fonte de Luz de Diamante

Aqui, descrevemos como usar os dutos de cristalografia macromolecular automatizados para análises de proteínas para estrutura, análise rápida do complexo ligante-proteína e triagem de fragmentos em larga escala com base na tecnologia CrystalDirect no Laboratório HTX em EMBL Grenoble.

Os gasodutos automatizados de cristalização no embl HTX Facility em Grenoble

Esta contribuição descreve como configurar a cristalização de proteínas em dispositivos cristal sobre cristal e como executar a coleta automatizada de dados seriais à temperatura ambiente usando a plataforma de cristalização no chip.

Cristalização no chip e difração serial em larga escala à temperatura ambiente

Apresentamos um protocolo para a cristalização de proteínas usando a instalação de cristalização no Complexo de Pesquisa em Harwell e subsequente coleta de dados cristalográficos de raios X in situ de cristais dentro das placas na linha de luz Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) de Diamond. Descrevemos os requisitos da amostra, protocolos de cristalização e diretrizes de coleta de dados.

Cristalização e Coleta de Dados de Temperatura Ambiente In Situ Usando a Instalação de Cristalização em Harwell e Linha de Luz VMXi, Fonte de Luz Diamante

Aprenda a preparar cristais de proteínas em meios viscosos usando o injetor Lipidico no Síncrotron Australiano. Este protocolo minimiza o desperdício de amostras e facilita a caracterização de materiais macios em cristalografia serial.

Protocolo de injeção de lipidico para medições de cristalografia serial no Síncrotron Australiano

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