Blot ocidental de alta velocidade usando tecnologia de aprimoramento de imunoreaction

O Western blotting é um método estabelecido que detecta antígenos em uma membrana transferida e é comumente usado em pesquisas biomédicas, mas leva horas ou dias para concluir todo o procedimento. Usando a combinação de tecnologia de aprimoramento imunológico com drenagem e reposição cíclica, uma vez que você tenha uma membrana de bloqueio, todo o procedimento pode ser realizado em menos de 20 minutos sem sacrificar a sensibilidade. Como o Western blotting é comum a muitas áreas de pesquisa diferentes, ele tem ampla aplicabilidade para acelerar a pesquisa.

O uso bem-sucedido deste protocolo depende da otimização da diluição de anticorpos com reagente de aprimoramento de imunorreação e tempo de incubação. Comece incubando as membranas de PVDF em tampões de bloqueio apropriados por uma hora com agitação à temperatura ambiente. Enquanto as membranas estão incubando, prepare uma solução de agente de reforço de imunorreação a 10% ou IRE1 com água destilada e vortex bem, depois dilua o anticorpo primário com 10% de IRE1, misturando-o suave e completamente.

Pegue a membrana de PVDF com uma pinça e drene brevemente a solução de bloqueio. Insira a membrana em um tubo cônico com anticorpo primário, garantindo que toda a membrana adira à parede do tubo e que o lado da membrana que estava originalmente em contato com o gel esteja voltado para dentro. Tampe bem o tubo.

Insira o tubo em uma garrafa de vidro para o forno de hibridização e ligue o forno. Incube a membrana com rotação de seis RPM por pelo menos cinco minutos. Pare a rotação e remova cuidadosamente a membrana de PVDF do tubo com uma pinça.

Coloque a membrana em um recipiente com 50 mililitros de PBST e enxágue-a, depois enxágue em um recipiente com água destilada até que não apareçam bolhas, o que removerá a maior parte do anticorpo. Transfira a membrana para um centrifugador de salada que contenha 250 mililitros de PBST. Coloque a cesta do filtro no centrifugador e certifique-se de que a tampa foi colocada com segurança, depois ative o centrifugador e deixe-o funcionar por 20 a 30 segundos.

Descarte a solução e enxágue brevemente o interior do centrifugador com água destilada. Adicione 250 mililitros de PBST no spinner e repita a centrifugação, depois incube a membrana com os anticorpos secundários e lave-a novamente conforme descrito no manuscrito do texto. Coloque um pedaço de filme flexível semitransparente em uma superfície plana.

Misture dois componentes do substrato quimioluminescente em um tubo de cinco mililitros e transfira imediatamente 1,5 mililitros do substrato misturado para o filme semitransparente. Coloque a membrana de PVDF na solução e transfira o restante da solução de substrato para a membrana. Incubar a membrana de PVDF com o substrato misturado durante um minuto.

Pegue a membrana de PVDF com uma pinça e drene a solução de substrato brevemente. Sanduíche a membrana entre um par de filmes de transparência e imagem-lo sob o modo quimioluminescente. As quantidades de antígeno e anticorpo, respectivamente, necessárias para a detecção quimioluminescente de Western blot são mostradas aqui.

Tanto nas incubações estáticas quanto nas CDR, o uso de soluções IRE aumentou a sensibilidade. Da mesma forma, a concentração mínima de anticorpo anti-6s His tag foi reduzida de 100 para 50 nanogramas por mililitro em condições estáticas e de 100 para 12,5 nanogramas por mililitro em condições de CDR. A incubação de CDR por 5 ou 10 minutos reduziu drasticamente o limite de detecção em comparação com a incubação estática.

Além disso, a combinação de CDR com IRE revelou sensibilidade superior no Western blot, mesmo dentro do período de incubação extremamente curto. A aplicação bem-sucedida deste método a um Western blot com detecção fluorescente é demonstrada aqui. A detecção fluorescente, em contraste com a detecção quimioluminescente, tem a capacidade única de detectar vários alvos no mesmo borrão ao mesmo tempo, sem remover e reprovar anticorpos.

A fosfatase alcalina e a beta-actina marcadas com His nos lisados celulares foram detectadas simultaneamente usando um fluoróforo de duas cores. A incubação de CDR com IRE não apenas acelerou a detecção, mas também aumentou a sensibilidade. Durante a incubação, a membrana deve permanecer presa à parede do tubo.

O tubo deve ser girado horizontalmente para que a solução seja lavada continuamente sobre a superfície da membrana. Este protocolo acelerou significativamente nossa produtividade em pesquisa, que depende fortemente dos procedimentos de Western blotting.