Name: Imagem de cálcio in vivo bem sucedida com um microscópio miniaturizado de head-mount na Amígdala do Rato Livremente Comportado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda imagem de cálcio in vivo na amígdala de camundongos usando microscopia miniaturizada head-mount. Este protocolo permite monitorar atividades neuronais em animais em comportamento livre, facilitando estudos sobre plasticidade neural e respostas emocionais.

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<ol><li>Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+neuronal+representations+through+time+and+damage+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus.</a> Science. 365 (6455), 821-825 (2019).</li>
<li>Ghandour, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrated+ensemble+activities+constitute+a+hippocampal+memory+engram%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram.</a> Nature Communications. 10 (1), 2637(2019).</li>
<li>Grundemann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+ensembles+encode+behavioral+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amygdala ensembles encode behavioral states.</a> Science. 364 (6437), (2019).</li>
<li>Krabbe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+disinhibitory+gating+by+VIP+interneurons+permits+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).</li>
<li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li>
<li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li>
<li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emotion+circuits+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).</li>
<li>Burgoyne, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+sensor+proteins%3A+generating+diversity+in+neuronal+Ca2%2B+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).</li>
<li>Miyakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+activated+increases+in+Ca2%2B+concentration+in+hippocampal+CA1+pyramidal+cells+are+primarily+due+to+voltage-gated+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels.</a> Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).</li>
<li>Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+dynamics+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium dynamics in dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li>
<li>Huber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Grewe, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+ensemble+dynamics+underlying+a+long-term+associative+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory.</a> Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Compact+Head-Mounted+Endoscope+for+In+vivo+Calcium+Imaging+in+Freely+Behaving+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Xiong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Cerebral+Vascular+Atlas+in+Stereotaxic+Coordinates+of+Whole+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128(2017).</li>
<li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E., DeOlmos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+configurations+in+lateral+and+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala.</a> Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+organization+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei%3A+a+Golgi+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).</li>
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O autor não tem nada a revelar

Técnicas de cirurgia habilidosas são essenciais para alcançar imagens de cálcio óptica in vivo bem sucedidas com microscopia em miniatura de montagem de cabeça em regiões cerebrais mais profundas, como a amígdala como descrevemos aqui. Portanto, embora este protocolo forneça uma diretriz para processos cirúrgicos otimizados de fixação de placas base e implantação de lentes GRIN, processos adicionais de otimização podem ser necessários para etapas críticas. Como mencionado na seção de protocolo, amígdala coordena em cirur...

O cálcio é um segundo mensageiro onipresente, desempenhando um papel crucial em quase todas as funções celulares8. Nos neurônios, o potencial de ação de disparo e a entrada sináptica causam rápida mudança de livre intracelular [Ca2+]9,10. Portanto, o rastreamento de transintes de cálcio oferece uma oportunidade de monitorar a atividade neuronal. GeCIs são ferramentas poderosas que permitem o monitoramento [Ca2+] em populações celulares definidas e compartimentos intracelulares11,12. Entre muitos tipos diferentes de indicador de cálcio à base de proteína, o GCaMP, uma sonda Ca2+baseada em uma única molécula de GFP13,é a GECI mais otimizada e, portanto, amplamente utilizada. Através de várias rodadas de engenharia, uma série de variantes de GCaMP foi desenvolvida12,14,15,16. Utilizamos um dos GCaMPs recentemente desenvolvidos, GCaMP7b, neste protocolo16. Os sensores GCaMP contribuíram muito para o estudo das funções do circuito neural em uma série de organismos modelo, como imagens de transientes Ca2+ durante o desenvolvimento17, imagem in vivo em uma camada cortical específica18,medição da dinâmica do circuito no aprendizado de tarefas motoras19 e imagem da atividade do conjunto celular relacionada com memória de medo associativo no hipocampo e amígdala20,21.
A imagem óptica de GECIs tem várias vantagens22. A codificação genética permite que os GECIs sejam expressos por um longo período de tempo em um subconjunto específico de células definidas por perfil genético ou padrões específicos de conectividade anatômica. A imagem óptica permite o monitoramento simultâneo in vivo de centenas a milhares de neurônios em animais vivos. Alguns sistemas ópticos de imagem foram desenvolvidos para imagens in vivo e análise de GECIs dentro do cérebro de camundongos que se comportam livremente com microscópios de fluorescência miniaturizada de montagem da cabeça21,23,24,25. Apesar da técnica de imagem óptica in vivo baseada em GECIs, lente GRIN e um microscópio em miniatura de montagem de cabeça ser uma ferramenta poderosa para estudar a ligação entre a atividade do circuito neural e o comportamento, aplicar essa tecnologia à amígdala tem sido difícil devido a vários problemas técnicos relacionados com o direcionamento da lente GRIN para células expressando GECIs na amígdala sem causar artefatos de movimento que reduzem severamente a qualidade da aquisição de imagens e encontrar células expressas gecIs. Este protocolo visa fornecer uma diretriz útil para procedimentos cirúrgicos de fixação de placa base e implantação de lentes GRIN que são etapas críticas para o sucesso da imagem óptica de cálcio in vivo na amígdala. Embora este protocolo tenha como alvo a amígdala, a maioria dos procedimentos descritos aqui são comumente aplicáveis a outras regiões cerebrais mais profundas. Embora este protocolo seja baseado em um sistema específico (por exemplo, Inscopix), o mesmo propósito pode ser facilmente alcançado com outros sistemas alternativos.

<table><tbody><tr><td>Agulha 26G</td><td>BD</td><td>302002</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE</td><td>Addgene</td><td>104493-AAV1</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>AAV2 / 1-CaMKii&alpha;-GFP</td><td>personalizado</td><td>Cirurgia</td><td></td></tr><tr><td>Cimento acrílico-dental (Ortho-jet Acrílico Rosa)</td> <td>Lang</td><td>1334-rosa</td><td>Cirurgia & Fixação da placa de base</td></tr><tr><td>Manipulador de fluxo de ar</td><td>Neurotar</td><td>NTR000253-04 Fixação da</td><td>placa de base</td></tr><tr><td>Amoxicilina</td><td>SIGMA</td><td>A8523-5G</td><td>Placa</td></tr><tr><td>de base</td> cirúrgica <td>INSCOPIX</td><td>1050-002192</td><td>Fixação da placa de</td></tr><tr><td>base Tampa da placa de base</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002193</td><td>Fixação da placa de base</td></tr><tr><td>Aparelho comportamental (câmara)</td> <td>Coulbourn Instrumento</td><td>Testcage</td><td>Teste de comportamento</td></tr><tr><td>Aparelho comportamental (software)</td><td>Coulbourn Instrument</td><td>Freeze Frame</td><td>Teste de comportamento</td></tr><tr><td>Gaiola de carbono</td><td>Neurotar</td><td>180mm x 70mm</td><td>Fixação da placa de base</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>SIGMA</td><td>PHR1452-1G</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Software de processamento de dados</td><td>INSCOPIX</td><td>INSCOPIX Software de processamento de dados</td><td>Baseplate Anexo & Teste de comportamento</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>SIGMA</td><td>D1756-500MG</td><td>Broca de Cirurgia</td></tr><tr><td></td><td>Seyang</td><td>marathon-4</td><td>Broca</td></tr> de <tr><td>Cirurgia</td><td>ELA</td><td>US1/2, Shank104</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Agulha de vidro</td><td>WPI</td><td>PG10165-4</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Lente GRIN (INSCOPIX Proview Lens Probe)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002208</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Hamilton Seringa</td><td>Hamilton</td><td>84875</td><td>Placa</td></tr><tr><td>de cabeça</td> de cirurgia <td>Neurotar</td><td>Modelo 5</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Hex-key</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004195</td><td>Fixação da placa de base</td></tr><tr><td>Computador portátil</td><td>Samsung</td><td>NT950XBV</td><td>Cirurgia & Fixação da placa de base</td></tr><tr><td>Suporte da lente, haste estereotáxica (kit de implante INSCOPIX proview)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004223</td><td>Pinça</td>de</tr><tr><td>microscópio</td> cirúrgico <td>INSCOPIX</td><td>1050-002199</td> Microscópio <td>de fixação da placa de base</td></tr><tr><td>, software DAQ, hardware</td><td>INSCOPIX</td><td>nVista 3.0</td><td>Fixação da placa de base e Teste de comportamento</td></tr><tr><td>Gaiola de casa móvel</td><td>Neurotar</td><td>MHC V5</td><td>Fixação de placa de base</td></tr><tr><td>Braço motorizado</td><td>Neurostar</td><td>Cirurgia personalizada</td><td></td></tr><tr><td>Software de braço motorizado</td><td>Neurostar</td><td>Cirurgia personalizada</td><td>Placa</td></tr><tr><td>NI</td><td>Instrumento</td><td></td> nacional <td>Teste de comportamento</td></tr><tr><td>Ligação epóxi removível</td><td>WPI</td><td>Kwik-Cast</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Cimento de resina (Super-bond)</td> <td>Sun medical</td><td>Super bond C & B</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Parafuso de crânio</td><td>Stoelting</td><td>51457</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Suporte de eletrodo estereotáxico</td><td>ASI</td><td>EH-600</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Quadro estereotáxico</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Manipulador estereotáxico</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td>Fixação da placa de base</td></tr></tbody></table>

imagem de cálcio in vivo bem sucedida com um microscópio miniaturizado de head-mount na amígdala do rato livremente comportado

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

O monitoramento in vivo em tempo real das atividades neuronais em animais em movimento livre é uma das principais abordagens para ligar a atividade neuronal ao comportamento. Para isso, uma técnica de imagem in vivo que detecta transitórios de cálcio em neurônios usando indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs), um microscópio de fluorescência miniaturizada e uma lente de índice de refração gradiente (GRIN) foi desenvolvida e aplicada com sucesso em muitas estruturas cerebrais1,2,3,4,5,6. Esta técnica de imagem é particularmente poderosa porque permite imagens simultâneas crônicas de populações celulares geneticamente definidas por um período de longo prazo até várias semanas. Embora útil, essa técnica de imagem não tem sido facilmente aplicada às estruturas cerebrais que se localizam profundamente dentro do cérebro, como a amígdala, uma estrutura cerebral essencial para o processamento emocional e a memória do medo associativo7. Existem vários fatores que dificultam a aplicação da técnica de imagem na amígdala. Por exemplo, artefatos de movimento geralmente ocorrem com mais frequência durante a imagem realizada nas regiões cerebrais mais profundas porque um microscópio de montagem de cabeça implantado nas profundezas do cérebro é relativamente instável. Outro problema é que o ventrículo lateral está posicionado perto da lente GRIN implantada e seu movimento durante a respiração pode causar artefatos de movimento altamente irregulares que não podem ser facilmente corrigidos, o que dificulta a formação de uma visão de imagem estável. Além disso, como as células da amígdala são geralmente silenciosas em um estado de repouso ou anestesiado, é difícil encontrar e concentrar as células-alvo expressando GECI na amígdala durante o procedimento de base para imagens posteriores. Este protocolo fornece uma diretriz útil para como direcionar eficientemente as células expressando GECI na amígdala com microscópio miniaturizado de montagem de cabeça para imagens de cálcio in vivo bem sucedidas em uma região cerebral tão profunda. Nota-se que este protocolo é baseado em um sistema específico (por exemplo, Inscopix), mas não restrito a ele.

Validação da implantação das lentes GRIN Antes de anexar cronicamente a placa base ao cérebro por cimentação, a implantação da lente GRIN precisa ser validada. Em animais com implantação bem sucedida de lentes, tanto células expressas GCaMP quanto vasos sanguíneos foram claramente observados dentro de uma faixa de plano focal determinada pela distância entre lente objetiva de microscópio e lente GRIN implantada(Figura 2A e B). Em contras...

A imagem microendoscópica de cálcio in vivo é uma ferramenta inestimável que permite o monitoramento em tempo real das atividades neuronais em animais de comportamento livre. No entanto, aplicar essa técnica à amígdala tem sido difícil. Este protocolo visa fornecer uma diretriz útil para atingir com sucesso células de amígdala com um microscópio miniaturizado em camundongos.

Imagem de cálcio in vivo bem sucedida com um microscópio miniaturizado de head-mount na Amígdala do Rato Livremente Comportado

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

Muitos desafios podem surgir ao usar microscopia miniaturizada para imagens de cálcio in vivo da amígdala. Este protocolo fornece diretrizes de economia de tempo para obter imagens de cálcio in vivo bem-sucedidas. A imagem de cálcio in vivo permite a imagem simultânea contínua de populações de células geneticamente definidas durante um período de até várias semanas, um processo que anteriormente não era possível.Para injeção de AAV, com o camundongo anestesiado preso em uma estrutura estereotáxica, alinhe a altura do bregma e lambda com o pino e identifique o local específico no crânio exposto e desinfetado para a craniotomia. Use uma broca equipada com uma broca de 0,6 milímetro para fazer cuidadosamente uma craniotomia de 1,6 milímetro com uma velocidade de perfuração de 18.000 rotações por minuto e lave o crânio com PBS estéril. Subtraia a diferença dorsoventral entre o bregma e a superfície cerebral exposta de 4,2 milímetros, a coordenada dorsoventral do implante da lente com base em um bregma para calcular o valor A distância e carregue três microlitros de óleo mineral e 0,7 microlitros de um maior que um vezes 10 elevado ao 13º genoma viral por mililitro da solução de AAV em uma pipeta de vidro.Remova o pino do suporte da sonda estereotáxica para permitir que a pipeta seja fixada à estrutura e posicione a pipeta sobre o local de injeção preparado. Quando o sangramento tiver parado completamente, insira a ponta da pipeta de vidro 4,3 milímetros no tecido cerebral a partir da coordenada do bregma dorsoventral e use uma bomba de injeção para fornecer todo o volume do vírus antes de remover lentamente a pipeta. Quando todo o vírus tiver sido injetado, perfure o crânio mais duas vezes, conforme demonstrado, para permitir a implantação de dois parafusos cranianos e lave as frações cranianas com PBS.Em seguida, implante os parafusos esterilizados com etanol a 70% o mais profundamente possível e instale um braço de cirurgia motorizado na estrutura estereotáxica. Conecte o hardware necessário a um laptop no qual o software de controle esteja instalado e use um porta-cânula para prender de forma estável uma agulha de calibre 26 na estrutura estereotáxica. Depois de calcular as coordenadas para o local de inserção da agulha, use o manipulador estereotáxico para posicionar a ponta da agulha na superfície exposta do cérebro e hidratar o tecido cerebral com duas a três gotas de PBS.Insira as coordenadas dorsoventral e lateral apropriadas da amígdala no software e clique em GoTo para abaixar a agulha. Quando a agulha estiver completamente parada, insira 45 milímetros na caixa de posição inicial e clique em Ir para para elevar a agulha. Quando a agulha parar de se mover, remova o PBS da superfície do cérebro e desinstale a agulha e o suporte da cânula da estrutura estereotáxica.Fixe o suporte da objetiva na haste estereotáxica e fixe a objetiva GRIN no suporte da objetiva. Esterilize a lente com 70% de etanol e prenda a haste estereotáxica à armação estereotáxica. Posicione a ponta da lente GRIN no local designado na superfície do cérebro e subtraia o valor absoluto de A da coordenada dorsoventral da superfície cerebral para determinar a coordenada dorsoventral para o implante da lente.Hidrate o tecido cerebral com mais duas a três gotas de PBS e use o braço motorizado para definir a profundidade de abaixamento para 1.000 micrômetros e a altura de elevação para 300 micrômetros. Quando a lente GRIN atingir o local alvo, remova o PBS e aplique cuidadosamente cimento dentário de resina ao redor da lente GRIN, parafusos e paredes laterais dos parafusos. Quando o cimento dentário estiver endurecido, remova o suporte da lente da lente e aplique cimento acrílico na superfície do crânio.Em seguida, substitua o suporte da lente por uma placa de cabeça presa à ponta da haste na orientação horizontal. Abaixe lentamente a haste até que a placa da cabeça esteja posicionada na parte superior do manguito da lente antes de abaixar a placa da cabeça 1.000 micrômetros até que a lente esteja localizada na borda direita do anel interno da placa da cabeça. Use cimento acrílico para prender a placa da cabeça às camadas de cimento e use filme de parafina para proteger a superfície da lente GRIN implantada da poeira e, em seguida, aplique uma ligação epóxi removível no filme de parafina para prender o filme à superfície da lente e retornar o animal à sua gaiola com monitoramento até a decúbito total.Para avaliar a qualidade do implante da lente GRIN, coloque uma gaiola de carbono sob o mouse anestesiado na barra de cabeça de um sistema de gaiola de casa móvel e ligue o fluxo de ar para que a gaiola se mova livremente sem atrito. Use uma garra de microscópio e um manipulador estereotáxico para alinhar verticalmente um microscópio miniaturizado à estrutura antes de abaixar o microscópio até que a superfície da lente GRIN implantada apareça no campo de visão da imagem dentro do software. Alinhe o centro da lente GRIN implantada com o centro do campo de visão e capture a imagem da superfície da lente GRIN implantada e, em seguida, levante lentamente a lente objetiva do microscópio enquanto observa a imagem quanto à aparência de células que expressam GCaMP.Em animais com implante de lente bem-sucedido, tanto as células quanto os vasos sanguíneos que expressam GCaMP podem ser claramente observados dentro de uma única faixa de plano focal. Em contraste, em animais com implantação fora do alvo, uma imagem clara das células que expressam GCaMP não é observada dentro da faixa do plano focal, embora os vasos sanguíneos possam ser observados com alguma dificuldade. No caso de uma lente fora do visor, nem os vasos sanguíneos nem as células que expressam GCaMP podem ser visualizados e uma borda brilhante pode ser observada na lente GRIN implantada.Em animais com um implante bem-sucedido de lente GRIN, aproximadamente 50 a 150 células provavelmente espontaneamente ativas normalmente exibem uma mudança significativa de fluorescência dentro do campo de visão na amígdala lateral, mesmo sem tônus. Após a apresentação do tom, apenas algumas células exibem uma mudança específica do tom do sinal GCaMP, conforme determinado pela análise de imagem delta F. Quando a mesma análise é conduzida em camundongos injetados com AAV que expressa GFP como controle, as células que expressam GFP são detectadas dentro da faixa do plano focal e nenhuma célula exibe uma mudança significativa de fluorescência com ou sem tom.A verificação histológica da expressão de GCaMP e do direcionamento da lente GRIN não revela nenhum sinal de dano tecidual devido à inflamação do tecido cerebral ao redor da lente GRIN. Se a velocidade da agulha ou da lente não for consistente, isso pode causar artefatos de movimento e baixa qualidade de imagem. Usar um braço de cirurgia motorizado pode ajudar.Se o sistema de atendimento domiciliar móvel não estiver pronto durante a etapa de fixação da placa de base, uma baixa concentração de gás isoflurano pode ser usada para anestesiar o mouse durante a fixação da placa de base.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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