Name: Imagem de cálcio in vivo bem sucedida com um microscópio miniaturizado de head-mount na Amígdala do Rato Livremente Comportado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda imagem de cálcio in vivo na amígdala de camundongos usando microscopia miniaturizada head-mount. Este protocolo permite monitorar atividades neuronais em animais em comportamento livre, facilitando estudos sobre plasticidade neural e respostas emocionais.

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<ol><li>Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+neuronal+representations+through+time+and+damage+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus.</a> Science. 365 (6455), 821-825 (2019).</li>
<li>Ghandour, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrated+ensemble+activities+constitute+a+hippocampal+memory+engram%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram.</a> Nature Communications. 10 (1), 2637(2019).</li>
<li>Grundemann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+ensembles+encode+behavioral+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amygdala ensembles encode behavioral states.</a> Science. 364 (6437), (2019).</li>
<li>Krabbe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+disinhibitory+gating+by+VIP+interneurons+permits+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).</li>
<li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li>
<li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li>
<li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emotion+circuits+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).</li>
<li>Burgoyne, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+sensor+proteins%3A+generating+diversity+in+neuronal+Ca2%2B+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).</li>
<li>Miyakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+activated+increases+in+Ca2%2B+concentration+in+hippocampal+CA1+pyramidal+cells+are+primarily+due+to+voltage-gated+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels.</a> Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).</li>
<li>Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+dynamics+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium dynamics in dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li>
<li>Huber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Grewe, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+ensemble+dynamics+underlying+a+long-term+associative+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory.</a> Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Compact+Head-Mounted+Endoscope+for+In+vivo+Calcium+Imaging+in+Freely+Behaving+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Xiong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Cerebral+Vascular+Atlas+in+Stereotaxic+Coordinates+of+Whole+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128(2017).</li>
<li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E., DeOlmos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+configurations+in+lateral+and+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala.</a> Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+organization+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei%3A+a+Golgi+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).</li>
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O autor não tem nada a revelar

Técnicas de cirurgia habilidosas são essenciais para alcançar imagens de cálcio óptica in vivo bem sucedidas com microscopia em miniatura de montagem de cabeça em regiões cerebrais mais profundas, como a amígdala como descrevemos aqui. Portanto, embora este protocolo forneça uma diretriz para processos cirúrgicos otimizados de fixação de placas base e implantação de lentes GRIN, processos adicionais de otimização podem ser necessários para etapas críticas. Como mencionado na seção de protocolo, amígdala coordena em cirur...

O cálcio é um segundo mensageiro onipresente, desempenhando um papel crucial em quase todas as funções celulares8. Nos neurônios, o potencial de ação de disparo e a entrada sináptica causam rápida mudança de livre intracelular [Ca2+]9,10. Portanto, o rastreamento de transintes de cálcio oferece uma oportunidade de monitorar a atividade neuronal. GeCIs são ferramentas poderosas que permitem o monitoramento [Ca2+] em populações celulares definidas e compartimentos intracelulares11,12. Entre muitos tipos diferentes de indicador de cálcio à base de proteína, o GCaMP, uma sonda Ca2+baseada em uma única molécula de GFP13,é a GECI mais otimizada e, portanto, amplamente utilizada. Através de várias rodadas de engenharia, uma série de variantes de GCaMP foi desenvolvida12,14,15,16. Utilizamos um dos GCaMPs recentemente desenvolvidos, GCaMP7b, neste protocolo16. Os sensores GCaMP contribuíram muito para o estudo das funções do circuito neural em uma série de organismos modelo, como imagens de transientes Ca2+ durante o desenvolvimento17, imagem in vivo em uma camada cortical específica18,medição da dinâmica do circuito no aprendizado de tarefas motoras19 e imagem da atividade do conjunto celular relacionada com memória de medo associativo no hipocampo e amígdala20,21.
A imagem óptica de GECIs tem várias vantagens22. A codificação genética permite que os GECIs sejam expressos por um longo período de tempo em um subconjunto específico de células definidas por perfil genético ou padrões específicos de conectividade anatômica. A imagem óptica permite o monitoramento simultâneo in vivo de centenas a milhares de neurônios em animais vivos. Alguns sistemas ópticos de imagem foram desenvolvidos para imagens in vivo e análise de GECIs dentro do cérebro de camundongos que se comportam livremente com microscópios de fluorescência miniaturizada de montagem da cabeça21,23,24,25. Apesar da técnica de imagem óptica in vivo baseada em GECIs, lente GRIN e um microscópio em miniatura de montagem de cabeça ser uma ferramenta poderosa para estudar a ligação entre a atividade do circuito neural e o comportamento, aplicar essa tecnologia à amígdala tem sido difícil devido a vários problemas técnicos relacionados com o direcionamento da lente GRIN para células expressando GECIs na amígdala sem causar artefatos de movimento que reduzem severamente a qualidade da aquisição de imagens e encontrar células expressas gecIs. Este protocolo visa fornecer uma diretriz útil para procedimentos cirúrgicos de fixação de placa base e implantação de lentes GRIN que são etapas críticas para o sucesso da imagem óptica de cálcio in vivo na amígdala. Embora este protocolo tenha como alvo a amígdala, a maioria dos procedimentos descritos aqui são comumente aplicáveis a outras regiões cerebrais mais profundas. Embora este protocolo seja baseado em um sistema específico (por exemplo, Inscopix), o mesmo propósito pode ser facilmente alcançado com outros sistemas alternativos.

<table><tbody><tr><td>Agulha 26G</td><td>BD</td><td>302002</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE</td><td>Addgene</td><td>104493-AAV1</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>AAV2 / 1-CaMKii&alpha;-GFP</td><td>personalizado</td><td>Cirurgia</td><td></td></tr><tr><td>Cimento acrílico-dental (Ortho-jet Acrílico Rosa)</td> <td>Lang</td><td>1334-rosa</td><td>Cirurgia & Fixação da placa de base</td></tr><tr><td>Manipulador de fluxo de ar</td><td>Neurotar</td><td>NTR000253-04 Fixação da</td><td>placa de base</td></tr><tr><td>Amoxicilina</td><td>SIGMA</td><td>A8523-5G</td><td>Placa</td></tr><tr><td>de base</td> cirúrgica <td>INSCOPIX</td><td>1050-002192</td><td>Fixação da placa de</td></tr><tr><td>base Tampa da placa de base</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002193</td><td>Fixação da placa de base</td></tr><tr><td>Aparelho comportamental (câmara)</td> <td>Coulbourn Instrumento</td><td>Testcage</td><td>Teste de comportamento</td></tr><tr><td>Aparelho comportamental (software)</td><td>Coulbourn Instrument</td><td>Freeze Frame</td><td>Teste de comportamento</td></tr><tr><td>Gaiola de carbono</td><td>Neurotar</td><td>180mm x 70mm</td><td>Fixação da placa de base</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>SIGMA</td><td>PHR1452-1G</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Software de processamento de dados</td><td>INSCOPIX</td><td>INSCOPIX Software de processamento de dados</td><td>Baseplate Anexo & Teste de comportamento</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>SIGMA</td><td>D1756-500MG</td><td>Broca de Cirurgia</td></tr><tr><td></td><td>Seyang</td><td>marathon-4</td><td>Broca</td></tr> de <tr><td>Cirurgia</td><td>ELA</td><td>US1/2, Shank104</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Agulha de vidro</td><td>WPI</td><td>PG10165-4</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Lente GRIN (INSCOPIX Proview Lens Probe)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002208</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Hamilton Seringa</td><td>Hamilton</td><td>84875</td><td>Placa</td></tr><tr><td>de cabeça</td> de cirurgia <td>Neurotar</td><td>Modelo 5</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Hex-key</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004195</td><td>Fixação da placa de base</td></tr><tr><td>Computador portátil</td><td>Samsung</td><td>NT950XBV</td><td>Cirurgia & Fixação da placa de base</td></tr><tr><td>Suporte da lente, haste estereotáxica (kit de implante INSCOPIX proview)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004223</td><td>Pinça</td>de</tr><tr><td>microscópio</td> cirúrgico <td>INSCOPIX</td><td>1050-002199</td> Microscópio <td>de fixação da placa de base</td></tr><tr><td>, software DAQ, hardware</td><td>INSCOPIX</td><td>nVista 3.0</td><td>Fixação da placa de base e Teste de comportamento</td></tr><tr><td>Gaiola de casa móvel</td><td>Neurotar</td><td>MHC V5</td><td>Fixação de placa de base</td></tr><tr><td>Braço motorizado</td><td>Neurostar</td><td>Cirurgia personalizada</td><td></td></tr><tr><td>Software de braço motorizado</td><td>Neurostar</td><td>Cirurgia personalizada</td><td>Placa</td></tr><tr><td>NI</td><td>Instrumento</td><td></td> nacional <td>Teste de comportamento</td></tr><tr><td>Ligação epóxi removível</td><td>WPI</td><td>Kwik-Cast</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Cimento de resina (Super-bond)</td> <td>Sun medical</td><td>Super bond C & B</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Parafuso de crânio</td><td>Stoelting</td><td>51457</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Suporte de eletrodo estereotáxico</td><td>ASI</td><td>EH-600</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Quadro estereotáxico</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td>Cirurgia</td></tr><tr><td>Manipulador estereotáxico</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td>Fixação da placa de base</td></tr></tbody></table>

imagem de cálcio in vivo bem sucedida com um microscópio miniaturizado de head-mount na amígdala do rato livremente comportado

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

O monitoramento in vivo em tempo real das atividades neuronais em animais em movimento livre é uma das principais abordagens para ligar a atividade neuronal ao comportamento. Para isso, uma técnica de imagem in vivo que detecta transitórios de cálcio em neurônios usando indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs), um microscópio de fluorescência miniaturizada e uma lente de índice de refração gradiente (GRIN) foi desenvolvida e aplicada com sucesso em muitas estruturas cerebrais1,2,3,4,5,6. Esta técnica de imagem é particularmente poderosa porque permite imagens simultâneas crônicas de populações celulares geneticamente definidas por um período de longo prazo até várias semanas. Embora útil, essa técnica de imagem não tem sido facilmente aplicada às estruturas cerebrais que se localizam profundamente dentro do cérebro, como a amígdala, uma estrutura cerebral essencial para o processamento emocional e a memória do medo associativo7. Existem vários fatores que dificultam a aplicação da técnica de imagem na amígdala. Por exemplo, artefatos de movimento geralmente ocorrem com mais frequência durante a imagem realizada nas regiões cerebrais mais profundas porque um microscópio de montagem de cabeça implantado nas profundezas do cérebro é relativamente instável. Outro problema é que o ventrículo lateral está posicionado perto da lente GRIN implantada e seu movimento durante a respiração pode causar artefatos de movimento altamente irregulares que não podem ser facilmente corrigidos, o que dificulta a formação de uma visão de imagem estável. Além disso, como as células da amígdala são geralmente silenciosas em um estado de repouso ou anestesiado, é difícil encontrar e concentrar as células-alvo expressando GECI na amígdala durante o procedimento de base para imagens posteriores. Este protocolo fornece uma diretriz útil para como direcionar eficientemente as células expressando GECI na amígdala com microscópio miniaturizado de montagem de cabeça para imagens de cálcio in vivo bem sucedidas em uma região cerebral tão profunda. Nota-se que este protocolo é baseado em um sistema específico (por exemplo, Inscopix), mas não restrito a ele.

Validação da implantação das lentes GRIN Antes de anexar cronicamente a placa base ao cérebro por cimentação, a implantação da lente GRIN precisa ser validada. Em animais com implantação bem sucedida de lentes, tanto células expressas GCaMP quanto vasos sanguíneos foram claramente observados dentro de uma faixa de plano focal determinada pela distância entre lente objetiva de microscópio e lente GRIN implantada(Figura 2A e B). Em contras...

A imagem microendoscópica de cálcio in vivo é uma ferramenta inestimável que permite o monitoramento em tempo real das atividades neuronais em animais de comportamento livre. No entanto, aplicar essa técnica à amígdala tem sido difícil. Este protocolo visa fornecer uma diretriz útil para atingir com sucesso células de amígdala com um microscópio miniaturizado em camundongos.

Imagem de cálcio in vivo bem sucedida com um microscópio miniaturizado de head-mount na Amígdala do Rato Livremente Comportado

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

Muitos desafios podem surgir ao usar microscopia miniaturizada para imagens de cálcio in vivo da amígdala. Este protocolo fornece diretrizes de economia de tempo para obter imagens de cálcio in vivo bem-sucedidas. A imagem de cálcio in vivo permite a imagem simultânea contínua de populações de células geneticamente definidas durante um período de até várias semanas, um processo que anteriormente não era possível.Para injeção de AAV, com o camundongo anestesiado preso em uma estrutura estereotáxica, alinhe a altura do bregma e lambda com o pino e identifique o local específico no crânio exposto e desinfetado para a craniotomia. Use uma broca equipada com uma broca de 0,6 milímetro para fazer cuidadosamente uma craniotomia de 1,6 milímetro com uma velocidade de perfuração de 18.000 rotações por minuto e lave o crânio com PBS estéril. Subtraia a diferença dorsoventral entre o bregma e a superfície cerebral exposta de 4,2 milímetros, a coordenada dorsoventral do implante da lente com base em um bregma para calcular o valor A distância e carregue três microlitros de óleo mineral e 0,7 microlitros de um maior que um vezes 10 elevado ao 13º genoma viral por mililitro da solução de AAV em

successful-vivo-calcium-imaging-with-head-mount-miniaturized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Para entender a dinâmica da rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial para gravar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In-vivo de dois fótons de imagens de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma densa população neuronal com uma única célula de resolução.

Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos

Fonte: Lee, H. et. al., Imagem de cálcio in vivo bem-sucedida com um microscópio miniaturizado montado na cabeça na amígdala de um camundongo que se comporta livremente. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra imagens de cálcio in vivo em um camundongo usando um índice de refração gradiente, ou lente GRIN, e um microscópio miniaturizado. A configuração combina a fixação da cabeça dentro de um sistema de gaiola móvel sem atrito, estimulando os neurônios e desencadeando o influxo de íons de...

Imagem microendoscópica de cálcio em tempo real em um camundongo que se move livremente

Fonte: Thapa, R., et. al., Injeção Viral Estereotáxica e Implante de Lente de Índice de Gradiente para Imagem de Cálcio Cerebral Profundo In Vivo.  J. Vis. Exp. (2021)O vídeo demonstra imagens de cálcio em tempo real usando um miniscópio em um camundongo transduzido, correlacionando a atividade neuronal com o comportamento.

Imagem de cálcio em tempo real de um córtex pré-frontal medial de camundongo usando um miniscópio

Aqui nós descrevemos os procedimentos experimentais envolvidos em dois fótons de imagem de rato córtex durante o comportamento em um ambiente de realidade virtual.

Dois fótons de imagem de cálcio em camundongos Navegando um ambiente da realidade virtual

Apresentamos um protocolo para expor o tronco cerebral do rato adulto do lado ventral. Usando uma lente de índice gradiente-refrativo com um microscópio em miniatura, a imagem de cálcio pode ser usada para examinar a atividade de somata neural inferior de oliva in vivo.

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Miniscópio em imagem de cálcio vivo é uma técnica poderosa para estudar dinâmica neuronal e microcircuitos em camundongos que se comportam livremente. Este protocolo descreve a realização de cirurgias cerebrais para obter uma boa imagem in vivo de cálcio usando um miniscópio.

Injeção viral esteretaxica e implantação de lente de índice de gradiente para imagem de cálcio no cérebro profundo em vivo

Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Este protocolo detalha o procedimento para obter imagens de respostas de cálcio no colículo superior (CS) de camundongos acordados, incluindo a obtenção de imagens da atividade de um único neurônio com microscopia de dois fótons, deixando o córtex intacto em camundongos selvagens, e a obtenção de imagens de todo o SC com microscopia de campo largo em camundongos mutantes do córtex parcial.

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

O giro dentado do hipocampo desempenha funções essenciais e distintas na aprendizagem e na memória. Este protocolo descreve um conjunto de procedimentos robustos e eficientes para imagens de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado em camundongos em movimento livre.

Imagem de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado do hipocampo em camundongos 

Este protocolo investiga a relação cérebro-comportamento no hipocampo CA1 em camundongos navegando em uma pluma de odor. Fornecemos um protocolo passo a passo, incluindo cirurgia para acessar imagens do hipocampo, treinamento comportamental, gravação e processamento do cérebro do miniscope GCaMP6f e dados comportamentais para decodificar a posição do mouse a partir da atividade neural do ROI.

Miniscope registrando sinais de cálcio no hipocampo de camundongos navegando em uma pluma de odor

Este protocolo detalha a imagem in vivo de cálcio de neurônios hipotalâmicos usando um microscópio miniaturizado (miniscópio) em camundongos que se comportam livremente durante manipulação do estado social (isolamento social e reunião social). Esse método permite a imagem, com resolução de neurônio único, da atividade hipotálmica que representa necessidade social e saciedade social, possibilitando estudos mecanicistas da homeostase social.

In Vivo Imagem de Cálcio com Microscópio Miniaturizado no Hipotálamo para Compreensão de Comportamentos Sociais em Camundongos

Aprenda imagem de cálcio in vivo na amígdala de camundongos usando microscopia miniaturizada head-mount. Este protocolo permite monitorar atividades neuronais em animais em comportamento livre, facilitando estudos sobre plasticidade neural e respostas emocionais.

Imagem de cálcio in vivo bem sucedida com um microscópio miniaturizado de head-mount na Amígdala do Rato Livremente Comportado

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