Name: Agrobacterium-Transformação Genética Mediada, Produção Transgênica e Sua Aplicação para o Estudo do Desenvolvimento Reprodutivo Masculino no Arroz (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprenda a transformação genética mediada por Agrobacterium em arroz para estudar o desenvolvimento reprodutivo masculino usando Oryza sativa. Este método demonstra edição CRISPR-Cas9 do gene OsABCG15 para criar linhagens macho-estéreis.

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Os autores gostariam de reconhecer Xiaofei Chen por fornecer as inflorescências de arroz jovens e assistência para tornar a cultura do tecido de arroz meio. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31900611).

1. construção vetorial de expressão vegetal sgRNA-CAS9 e transformação mediada por Agrobacterium
<ol><li>Alvo de um gene estéril masculino OsABCG15 em arroz de acordo com a literatura publicada28.</li>
	<li>Design sgRNA para o local alvo localizado entre 106-125 bp no segundo exon de OsABCG15 (Figura 1).</li>
	<li>Use a quinase de polinucleotídeo T4 para sintetizar os oligos sgRNA (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCCCTCAAGGGGAT3' e 5 sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCCCTTGAGGATGGATGTGTGTTT').</li>
	<li>Use o endonuclease BbsI para digerir o vetor de espinha dorsal psgR-Cas929.</li>
	<li>Liga o sgRNA oligos de tamanho sintetizado com espinha dorsal psgR-Cas9 linearizada usando ligase T4 seguindo o protocolo do fabricante.</li>
	<li>Utilizando HindIII/EcoRI, digerir o sgRNA da etapa 1.5 e subclone no local HindIII/EcoRI do vetor binário pCAMBIA1300 para transformação estável29.</li>
	<li>Confirme o plasmídeo construído por digestão enzimética e sequenciamento. Posteriormente, transforme a construção binária na cepa EHA105 e plante-as em placas de seleção Kan/Rif a 28 °C por 2 a 3 dias.</li>
</ol>2. Transformação genética do arroz e cultura do tecido vegetal
<ol><li>Indução e regeneração de Calo NOTA: Use inflorescências de arroz jovem fresco como material inicial para induzir calo(Figura 2).<ol>
<li>Recolher as inflorescências jovens do campo de pastagem ou da casa verde na fase de meiose, determinadas por comprimento florete de 1,6-4,8 mm(Figura 2A)29. Certifique-se de que as inflorescências de arroz estão cobertas com baia de folhas. Limpe cada inflorescência com um cotonete de álcool de 70% e deixe secar antes de cortar.</li>
		<li>Leve a inflorescência para um banco limpo estéril. Corte-o em pequenos pedaços (quanto menor melhor) com uma tesoura esterilizada e, em seguida, transfira os cortes para uma placa de Petri contendo meio NBD2(Figura 2B, Tabela 1).</li>
		<li>Incubar a placa no escuro a 26 °C por cerca de 10-14 dias para induzir calo(Figura 3A). NOTA: Use o calo recém-formado para infiltração de Agrobacterium (etapa 2.2.7) diretamente ou recondicionada mais uma vez no meio NBD2 fresco para obter mais calo. Transfira o calo para o novo meio NBD2 a cada 8 a 10 dias.</li>
	</ol></li>
	<li>Transformação e co-cultivo<ol>
<li>Use bactérias A. tumefaciens contendo o plasmídeo binário da etapa 1.6 para transformação. Armazene as cepas de A. tumefaciens em meio YEB(Tabela 1) com 50% de glicerol a -80 °C para uso posterior.</li>
		<li>Streak A. tumefaciens de um estoque de glicerol de -80 °C para yeb meio de ágar contendo antibióticos seletivos (Tabela 1) e crescer a 25-28 °C por 48-72 h, para permitir que as colônias apareçam.</li>
		<li>Inocular uma única colônia da placa YEB com antibióticos seletivos a 5 mL de meio YEB líquido contendo os mesmos antibióticos seletivos(Tabela 1), em um tubo de ensaio estéril cônico de 50 mL. Agite em um agitador orbital a 250 x g, a 25-28 °C até que as bactérias cresçam para um OD600 de 0,5.</li>
		<li>Adicione 1 mL de suspensão bacteriana a 100 mL de meio YEB(Tabela 1) com os mesmos antibióticos seletivos em um frasco cônico de 250 mL e agite em um agitador orbital a 250 x g,a 28 °C por 4 h.</li>
		<li>Centrífuga a 4.000 x g por 10 minutos à temperatura ambiente para coletar bactérias. Descarte o supernaspeso.</li>
		<li>Resuspene a pelota bacteriana com meio AAM-AS(Tabela 1) e dilua a suspensão a um OD600 = 0,4. NOTA: O OD perfeito da suspensão bacteriana é fundamental para uma transformação eficiente. Ajuda a eliminar o crescimento bacteriano em excesso no calo.</li>
		<li>Colete cerca de 150 cali embrigênicos frágeis amarelo-claros de crescimento saudável da etapa 2.1.3 em um frasco estéril de 150 mL. Adicione 50-75 mL de suspensão celular bacteriana da etapa 2.2.6 no frasco estéril e, em seguida, adicione alguns meios AAM-AS frescos de 10-25 mL para imergir o cali por 10-20 min, tremendo ocasionalmente.</li>
		<li>Despeje a suspensão bacteriana do frasco cuidadosamente e seque o excesso de suspensão bacteriana do calo usando papel filtro estéril #1 ou papel de tecido. Em seguida, coloque-os em uma placa de Petri com meio NBD-AS(Tabela 1)coberto com um papel filtro estéril #1. Incubar a 25-28 °C no escuro por 3 dias e verificar se há excesso de crescimento bacteriano.</li>
	</ol></li>
	<li>Seleção para calo resistente<ol>
<li>Após 3 dias de co-cultivo, transfira o cali para uma placa de Petri estéril com um papel filtro estéril.</li>
		<li>Seque o caldo por 2h em um banco limpo. Certifique-se de que o calo não seja aderido ao papel filtro.</li>
		<li>Transfira o calli uniformemente usando pinça estéril para o meio de seleção primária NBD2 (com 40 mg/L de higromicina e 250 mg/L tempontina)(Tabela 1). Cultura calli por 2 semanas a 25-28 °C no escuro.</li>
		<li>Após 2 semanas, transfira calli uniformemente para uma nova placa contendo médio de seleção fresca NBD2 (com 40 mg/L de higromicina e 250 mg/L tempontina) (Tabela 1). Cultura o calli por mais 2 semanas a 25-28 °C no escuro.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciação de Calo<ol>
<li>Transferir calo para ms médio fresco (com 25 mg/L de higromicina e 150 mg/L tempontina) (Tabela 1). Cultura sob a luz a 25-28 °C por cerca de 2 semanas.</li>
		<li>Repita o passo 2.4.1 mais uma vez.</li>
		<li>Transfira os botões de tiro para o novo meio MS (com 10 mg/L de higromicina) para proliferar mais brotos.</li>
	</ol></li>
	<li>Indução radicular<ol>
<li>Transfira os novos brotos para o meio de 1/2 MS(Tabela 1). Cultura sob a luz a 25 °C - 28 °C. As plantas transformadas produzem raízes dentro de 2 semanas.</li>
		<li>Após 1 semana, transfira as plantas para limpar vasos que cobrem a planta para evitar a desidratação.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Identificação genótipo
<ol><li>Coletar folhas jovens de plantas recém-geradas para extração total de DNA usando o método cetyltrimethyl ammonium brometo (CTAB)31.</li>
	<li>Usando o DNA genômico como modelo, escolha os primers (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCTCGTATT 3' e Hygromycin-R: 5' CGAAGAATCTCGTGCTTTCA 3' localizado na região de Hygromycin) para realizar a reação em cadeia de polimerase (PCR) para validar a integração transgênica e as frequências(Figura 4). As seguintes condições de PCR: 94 °C para 5 min; 36 ciclos (94 °C para 30 s; 56 °C para 30 s; 72 °C por 1 min ); 72 °C por 7 min. Reações de PCR bem sucedidas produzem um amplicon de 604 bp.</li>
	<li>Execute outro PCR para amplificar a região genômica ao redor dos locais de destino CRISPR usando primers específicos (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTGCTCAACAGTCT 3' e OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTTTAAAACATTGCTAT 3') para identificar o genótipo dos transformadores. As condições do PCR são as mesmas da etapa 3.2.</li>
	<li>Use fragmentos PCR da etapa 3.3 diretamente para sequenciamento Sanger para identificar mutações.</li>
</ol>4. Observe o fenótipo básico do mutante
<ol><li>Prepare a solução I2-KI: dissolva 2 g de KI (iodeto de potássio) em 10 mL de água destilada e, em seguida, adicione 0,2 g de I2 (iodo resublimado) nele. Após a mistura, leve o volume total para 100 mL com água destilada.</li>
	<li>Prepare a solução FAA (63% etanol anidro, 5% ácido acético glacial, 5% formaldeído e 27% água) e misture antes de usar.</li>
	<li>Prepare a solução de coloração azul toluidina de 0,5%: dissolva 0,5 g de azul toluidina em 100 mL de água destilada.</li>
	<li>Realize observação fenotípica vegetativa, por meio de imagens de plantas inteiras com uma câmera digital.</li>
	<li>Realize observação de fenótipo reprodutivo, remova a palea e a lemma do florete. Tire fotos de anthers inteiros sob um estereóscópio.</li>
	<li>Observe a viabilidade do pólen por coloração de iodo.<ol>
<li>Escolha espinhos de arroz maduros antes da anestesia da flor, remova a palea e a lemma para soltar os antenos.</li>
		<li>Pegue 6 anteras e coloque-os em um escorregador de vidro. Adicione 1 gota de água destilada, esmague bem o anteã com pinças para liberar os grãos de pólen e, em seguida, adicione 2-3 gotas de solução I2-KI. Cubra com a mancha de cobertura.</li>
		<li>Observe sob um microscópio de baixa ampliação. Grãos de pólen tingidos preto mostram viabilidade mais vigorosa, nenhuma cor ou marrom-amarelo tingido são atrofiados ou degenerados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realize uma seção semi-fina de anther de arroz<ol>
<li>Fixar as flores de arroz de diferentes estágios de desenvolvimento em uma solução da FAA. Aspire os materiais a 4 °C (geralmente 15 min) para permitir que o fixador penetre nos tecidos até que o material afunde no fundo da garrafa de coleta.</li>
		<li>Substitua por uma nova solução da FAA no dia seguinte. Uma vez que o material afunde até o fundo, substitua com 70% de etanol e armazene a 4 °C para uso a longo prazo.</li>
		<li>Desidratar os materiais com diferentes gradientes de etanol (70%, 80%, 95% cada vez por 30 min, 100% etanol por 2h, 100% etanol contendo um pouco de corante safranin por 2h). NOTA: Adicione um pouco de corante Safranin no segundo 100% etanol para colorir os antethers para facilitar a secção depois.</li>
		<li>Realize a incorporação seguindo as instruções do fabricante (Tabela de Materiais). Em seguida, asse em forno a 60 °C por 48 h antes de se seccionar.</li>
		<li>Selar a amostra para uma espessura de 2 μm usando um microtome. Adicione uma gota de água na lâmina de vidro. Em seguida, pegue as seções finas contendo blocos de anárpe por fórceps e coloque-as na superfície da gota d'água nas lâminas.</li>
		<li>Coloque os slides no banho de água a 50 °C para espalhar completamente as seções para deixá-lo firmemente aderir ao escorregador.</li>
		<li>Use 0,5% de toluidina azul solução manchar os slides por 30 minutos. Em seguida, enxágue com água e seque no capô da fumaça. Selar com cola de árvore neutra. Coloque delicadamente uma mancha de cobertura no escorregador e seque no capô da fumaça.</li>
		<li>Observe e fotografe a amostra sob um microscópio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR%2FCas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system.</a> Cell Research. 23 (10), 1229(2013).</li>
</ol>

Mutantes estéreis artificiais machos são tradicionalmente gerados por mutagênese física, química ou biológica aleatória. Embora sejam técnicas poderosas, sua natureza aleatória não consegue capitalizar a vasta quantidade de conhecimento genômico moderno que tem o potencial de proporcionar melhorias personalizadas na reprodução molecular32. O sistema CRISPR-Cas9 tem sido amplamente utilizado em plantas devido aos seus meios simples e acessíveis para manipular e editar DNA29<...

O arroz é a cultura alimentar mais importante, particularmente nos países em desenvolvimento, e representa um alimento básico para mais da metade da população mundial. No geral, a demanda por grãos de arroz está crescendo e deve aumentar 50% até 2030 e 100% até 20501,2. Melhorias futuras no rendimento do arroz precisarão capitalizar em diversos recursos moleculares e genéticos que fazem do arroz um excelente modelo para pesquisa de plantas monocotíces. Estes incluem um sistema de transformação eficiente, mapa molecular avançado e banco de dados de sequência expressa, que foram gerados ao longo de muitos anos3,4. Uma estratégia para melhorar o rendimento das culturas é a produção de sementeshíbridas 5, um elemento central do qual é a capacidade de manipular a fertilidade masculina. Compreender o controle molecular da fertilidade masculina nas culturas de cereais pode ajudar a traduzir conhecimentos-chave em técnicas práticas para melhorar a produção de sementes híbridas e aumentar a produtividade das culturas6,,7.
A transformação genética é uma ferramenta fundamental para a pesquisa básica e a agricultura comercial, uma vez que permite a introdução de genes estrangeiros ou manipulação de genes endógenos em plantas agrícolas, e resulta na geração de linhas geneticamente modificadas. Um protocolo de transformação adequado pode ajudar a acelerar os estudos de biologia genética e molecular para a compreensão fundamental da regulação genética8. Nas bactérias, a transformação genética ocorre naturalmente; no entanto, nas plantas, é realizado artificialmente utilizando técnicas de biologia molecular9,10. Agrobacterium tumefaciens é uma bactéria gram-negativa que causa a doença da gárbia da coroa nas plantas através da transferência de T-DNA, uma região de seu plasmídeo Ti, para a célula vegetal através de um sistema de secreção tipo IV11,12. Nas plantas, a transformação mediada por A. tumefaciensé considerada um método generalizado para modificação genética porque leva à integração estável e de baixo número de cópia do T-DNA no genoma hospedeiro13. O arroz transgênico foi gerado pela primeira vez através da transformação genética mediada pela Agrobacteriumem meados da década de 1990 na cultivar japonica14. Por meio desse protocolo, várias linhas transgênicas foram obtidas em um período de 4 meses com uma eficiência de transformação de 10% a 30%. O estudo indicou que há dois passos críticos para a transformação bem sucedida: um é a indução do calo embrionário de sementes maduras e outro é a adição de acetossiingona, um composto fenólico, à cultura bacteriana durante o coculoculto, o que permite maior transformação nas plantas14,15. Este protocolo tem sido amplamente utilizado com pequenas alterações na japonica16,,17,,18,,19, bem como outras cultivares como indica20,,21,,22,23 e japonicatropical24,25. De fato, mais de 80% dos artigos que descrevem a transformação do arroz utilizam a transformação genética mediada pelo Agrobacteriumcomo ferramenta13. Até o momento, vários protocolos de transformação genética foram desenvolvidos utilizando sementes de arroz como material inicial para indução calos16,17,18,,19. No entanto, muito pouco se sabe sobre a inflorescência jovem como explantas para a produção de calo. No geral, é importante estabelecer um protocolo de transformação e regeneração genética rápido, reprodutível e eficiente para genômica funcional e estudos sobre melhoria das culturas.
Nos últimos anos, o avanço da tecnologia CRISPR-Cas9 resultou em um mecanismo preciso de edição de genomas para entender a função genética e proporcionar melhorias agronomicamente importantes para a criação de plantas26,27. A CRISPR também oferece uma promessa considerável para a manipulação do desenvolvimento reprodutivo masculino e da produção híbrida. Neste estudo, utilizamos um sistema de eliminação genética usando a tecnologia CRISPR-Cas9 e o unimos a um protocolo eficiente de transformação de genes de arroz usando inflorescências jovens como explantas, criando assim linhas estéreis masculinas estáveis para o estudo do desenvolvimento reprodutivo.

<table><tbody><tr><td>Ácido 1-naftalenoacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td></td></tr><tr><td>2, Ácido 4-diclorofenoxiacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7299</td><td></td></tr><tr><td>6-Benzilaminopurina (6-BA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>Acetosiringona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10000561</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de amônio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10002918</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de aneurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>Etanol anidro</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Peptona bacteriológica</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100636</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de carne bovina</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600114</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10004808</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>Hidrolisado de ácido de caseína</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>C184</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cobalto (II) hexahidratado</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10007216</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II) pentahidratado</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10008218</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glicose anidra</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>63005518</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>63011037</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, sal dissódico, di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>EOS Digital SLR e câmeras de sistema compacto</td><td>Canon</td><td>EOS 700D</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo rotativo totalmente automatizado</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica RM 2265</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10000208</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>62011516</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>H370</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>63007738</td><td></td></tr><tr><td>Iodo</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10011517</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de ferro (II) heptahidratado</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10012116</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>K378</td><td></td></tr><tr><td>Kinetin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K0753</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>62004034</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-aspártico</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>62004736</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>G229</td><td></td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>P698</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de manganês monohidratado</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10013418</td><td></td></tr><tr><td>Microscópios</td><td>NIKON</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Phytotech</td><td>M519</td><td></td></tr><tr><td>Ácido nicotínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0765</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10016308</td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de potássio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10017608</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de potássio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10017160</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de potássio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>1001721933</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de piridoxina (B6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47862</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>R501</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato de sódio di-hidratado</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019816</td><td></td></tr><tr><td>Microscópios estéreo</td><td>Leica Microsystems Leica</td><td>M205 A</td><td></td></tr><tr><td>Sucarose</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>Technovit embutindo Kits 7100</td><td>Heraeus Teknovi, Alemanha</td><td>14653</td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>T869</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria para seções de parafina</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Sangon Biotech</td><td>A515245</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de zinco heptahidratado</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10024018</td><td></td></tr></tbody></table>

agrobacterium-transformação genética mediada, produção transgênica e sua aplicação para o estudo do desenvolvimento reprodutivo masculino no arroz

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

A esterilidade masculina é um importante traço agronômico para a produção de sementes híbridas que geralmente é caracterizada por defeitos funcionais em órgãos reprodutivos/gametas masculinos. Os recentes avanços na tecnologia de edição de genomas CRISPR-Cas9 permitem alta eficácia de edição e mutações de eliminação de tempo de genes candidatos endógenos em locais específicos. Além disso, a transformação genética mediada pelo agrobacteriumdo arroz também é um método-chave para a modificação genética, que tem sido amplamente adotada por muitos laboratórios públicos e privados. Neste estudo, aplicamos ferramentas de edição de genomas CRISPR-Cas9 e geramos com sucesso três linhas mutantes estéreis masculinas por edição de genoma direcionado de OsABCG15 em uma cultivar japonica. Utilizamos um método modificado de transformação de arroz mediado por Agrobacteriumque poderia fornecer excelentes meios de emasculação genética para a produção de sementes híbridas no arroz. Plantas transgênicas podem ser obtidas dentro de 2-3 meses e transformadores homozigos foram rastreados por genotipagem usando amplificação PCR e sequenciamento Sanger. A caracterização fenotípica básica da linha homozigosa estéril masculina foi realizada pela observação microscópica dos órgãos reprodutivos machos do arroz, análise de viabilidade do pólen por iodida de potássio iodo (I2-KI) manchando semi-fina seção transversal de anthers em desenvolvimento.

Demonstrado aqui o uso da tecnologia de edição de genes para criar uma linha masculina estéril para futuras pesquisas da Agrobacterium- transformação genética mediada em arroz. Para criar a linha masculina estéril de osabcg15,a mutagênese mediada pelo CRISPR-CAS9 foi usada para a construção de vetores binários. O sgRNA foi conduzido pelo promotor osU3, enquanto o de expressão de hSpCas9 foi impulsionado pelo promotor duplo 35S, e o vetor médio foi montado em um único vetor binário pCAMBIA1300 p...

Este trabalho descreve o uso da tecnologia de edição de genomas CRISPR-Cas9 para eliminar o gene endógeno OsABCG15 seguido por um protocolo de transformação modificado agrobacterium mediadopara produzir uma linha estável masculino-estéril no arroz.

Agrobacterium-Transformação Genética Mediada, Produção Transgênica e Sua Aplicação para o Estudo do Desenvolvimento Reprodutivo Masculino no Arroz

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

As inflorescências jovens como explantamento para a produção de calos são importantes para estabelecer uma transformação genética rápida e eficiente e um método de regeneração para revelar a função genética, bem como para a melhoria das culturas. Inflorescências jovens como explant para a produção de calos são importantes para estabelecer uma rápida e eficiente transformação genética e o método de regeneração para revelar a função genética. A demonstração em vídeo desta técnica ajudará o espectador a entender o processo de manutenção dos materiais para produzir aquele alinhado transgênico desejado sem perder tempo e esforço.Comece coletando inflorescências de arroz jovem do campo de pastagem ou de uma estufa na fase de meiose, certificando-se de que eles estão cobertos com a baia de folhas. Limpe cada inflorescência com um cotonete de 70% de álcool e deixe secar antes de cortar. Leve a inflorescência para um banco de laboratório estéril e corte-a em pequenos pedaços com uma tesoura esterilizada, em seguida, transfira as estacas para uma placa de Petri contendo meio NBD2.Incubar a placa no escuro a 26 graus Celsius por 10 a 14 dias para induzir calo. Para realizar a transformação, transfira uma única colônia da placa EB branca com antibióticos seletivos para cinco mililitros de meio YEB líquido contendo os mesmos antibióticos em um tubo de ensaio estéril cônico de 50 mililitros. Agite o tubo em um agitador orbital a 250 vezes g e 25 a 28 graus Celsius até que as bactérias cresçam para um OD 600 de 0,5.Adicione um mililitro de suspensão bacteriana a 100 mililitros de meio YEB com os mesmos antibióticos seletivos em um frasco cônico de 250 mililitros e agite o frasco em um agitador orbital a 250 vezes g e 28 graus Celsius por quatro horas. Centrifugar a cultura a 4.000 g por 10 minutos à temperatura ambiente para coletar as bactérias. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota com a média AAM AS, em seguida, dilua a suspensão para um OD 600 de 0,4.Após a incubação, colete cerca de 150 cali embriogênico amarelo claro saudável em um frasco estéril de 150 mililitros. Adicione 50 a 75 mililitros da suspensão celular bacteriana no frasco e adicione 10 a 25 mililitros de meio AAM AS fresco para imergir o cali por 10 a 20 minutos, tremendo ocasionalmente. Despeje a suspensão bacteriana do frasco cuidadosamente e seque o caldo com papel filtro estéril, em seguida, coloque-os em uma placa de Petri com meio NBD AS e cubra-os com papel filtro.Incubar o cali a 25 a 28 graus Celsius no escuro por três dias, verificando-os quanto o crescimento bacteriano. Após três dias de co-cultivo, transfira o cali para uma placa de Petri estéril usando papel filtro, depois seque-os por duas horas em um banco limpo. Certifique-se de que o calli não seja aderido ao papel do filtro e transfira-os para o meio de seleção primária NBD2.Depois de duas semanas, transfira o calli uniformemente para uma nova placa contendo meio de seleção fresco, em seguida, mova o cali para o meio ms fresco para diferenciação e os brotos de tiro para ms médio com 10 miligramas por litro Hygromiccin para proliferar mais brotos. Transfira os novos brotos para meio MS para indução de raiz e culta-os sob luz a 25 a 28 graus Celsius. As plantas transformadas devem produzir raízes dentro de duas semanas.Para realizar a observação do fenótipo reprodutivo, remova a palea e a lemma do florido e imagem de todos os anteros sob um microscópio estéreo. Para observar a viabilidade do pólen, escolha espinhos de arroz maduros antes da anestesia da flor e remova a palea e a lemma para liberar os antenos. Pegue seis anteras e coloque-os em um escorregador de vidro.Adicione uma gota de água destilada, esmague o antero com pinças para liberar os grãos de pólen, em seguida, adicione duas a três gotas de solução de iodo e cubra com uma tampa. Observe o slide sob um microscópio de baixa ampliação. Grãos de pólen tingidos preto mostram viabilidade mais vigorosa, enquanto grãos sem cor ou aqueles marrom amarelo tingido são atrofiados ou degenerados.Para realizar a microscopia transversal de secção, use uma solução azul de toluidina de 0,5% para colorar os slides por 30 minutos e enxágüe-os com água e seque-os na capa de fumaça. Uma vez seco, sele os slides com cola de árvore neutra, coloque delicadamente uma mancha de cobertura no slide e seque-os no capô da fumaça, em seguida, imagem a amostra sob um microscópio. Este protocolo foi usado para criar uma linha masculina estéril pela transformação genética mediada pela Agrobacterium no arroz.Os cali embrionários foram utilizados diretamente para a transformação ou subcultos para proliferação para obter mais cali para infecção posterior. Após co-cultivar por 48 horas, os calli foram transferidos para uma segunda rodada de seleção. Após 10 a 14 dias, calli transformado mostrou microcalli recém-formado enquanto o calli não formado ficou marrom e morreu.Posteriormente, cali de cor saudável e cremosa foram transferidos para o meio de regeneração. Os calli transformados mostraram gradualmente manchas verdes. Esses pontos verdes foram cultivados em meio de regeneração para permitir o crescimento de brotos e, em seguida, mudaram para meio MS médio para induzir raízes.Mais tarde, foram colhidas brotos saudáveis e vigorosos de cultivo com raízes bem desenvolvidas. No total, foram obtidas 21 mudas regeneradas. Amplificação do PCR para a região da Higromicina mostrou que a frequência de transformação foi de aproximadamente 85,71% Os transformadores foram genótipos para identificar as mutações nos locais alvo do sgRNA.Entre as 18 plantas transgênicas, oito linhas heterozigous e três linhas homozigos foram CRISPR CAS9 positivas. Os mutantes homozigos foram validados pela observação básica de órgãos reprodutivos masculinos. Os anthers de osabcg15 eram menores e mais pálidos do que os do tipo selvagem e não tinham grãos maduros de pólen.A microscopia transversal foi realizada para investigar os defeitos morfológicos anteros em osabcg15. No estágio 10, microsporos do tipo selvagem tornaram-se em forma redonda e vacuolados com exina manchada azul escuro. Em contraste, os microsporos osabcg15 entraram em colapso e degradaram.Ao tentar esse protocolo, é importante garantir que o material coletado esteja em fase de meiose e controlar o tempo seco do caldo.

agrobacterium-mediated-genetic-transformation-transgenic-production

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Beernink, B. M. et al. Agroinoculação direta de mudas de milho por injeção com clones infecciosos do Vírus do Mosaico do Rabo-de-Raposa Recombinante e do Vírus do Mosaico da Cana-de-Açúcar. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra a entrega mediada por Agrobacterium de clones virais recombinantes em mudas de milho para silenciamento gênico. Ele descreve o processo de infecção por Agrobacterium , disseminação viral sistêmica e mudanças fenotípicas impulsionadas pela interferência de RNA.

Entrega mediada por agrobactérias de clones virais recombinantes em mudas de milho para silenciamento gênico

Neste vídeo, demonstramos a transformação genética do genoma do arroz usando um vetor binário de Agrobacterium tumefaciens. Esta bactéria facilita a transferência de um plasmídeo de DNA estranho usando proteínas de virulência de Agrobacterium.

Transformação genética mediada por agrobactérias: um método para transformar geneticamente o genoma do arroz por meio de Agrobacterium tumefaciens geneticamente modificado

Aqui, apresentamos dois protocolos para transformar plantas de batata. A transformação de Agrobacterium tumefaciens leva a uma planta transgénica completa enquanto o Agrobacterium rhizogenes produz raízes peludas transgênicas em uma selvagem tipo de fotos que podem ser propagados Self. Nós então detectar atividade de promotor por GUS coloração nas raízes transformadas.

Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes-transformação mediada de batata e a atividade de promotor de um Gene de suberina por GUS Staining

Genes morfogênicos vegetais podem ser usados para melhorar a transformação genética de genótipos recalcitrantes. Descrito aqui está um protocolo de transformação genética mediado pela Agrobacterium(QuickCorn) para três importantes linhas de milho público.

Agrobacterium-Transformação de embrião imaturo mediado de linhas de milho recalcitrante usando genes morfogênicos

Devido à sua versátil aplicação como espécie-modelo em vários campos de estudo, há a necessidade de um kit de ferramentas de transformação genética em banana-da-terra (Plantago lanceolata) de  folha estreita. Aqui, utilizando a transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens, é apresentado um protocolo que resulta em linhagens transgênicas estáveis com eficiência de transformação de 20%.

Transformação Genética Mediada por Agrobacterium tumefaciens de Plátano de Folha Estreita

Este protocolo descreve a utilização da transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) para integrar gene(s) de interesse no genoma nuclear da microalga verde Chlorella vulgaris, levando à produção de transformantes estáveis.

Engenharia Genética Mediada por Agrobacterium tumefaciens de Microalgas Verdes, Chlorella vulgaris

Apresentamos um protocolo para a produção de raízes pilosas de soja transgênica de alta eficiência.

Transformação de raízes pilosas de soja para análise da função gênica

O protocolo descreve a criação de variedades de arroz para amido resistentes por design usando tecnologias de edição de genoma de maneira precisa, eficiente e tecnicamente simples.

Melhoramento por Design para Arroz Funcional com Tecnologias de Edição de Genoma

Apresentamos um protocolo eficiente e otimizado para a transformação mediada por Agrobacterium de uma espécie anfíbia assexuada de Brassicaceae, Rorippa aquatica, sem procedimentos intensivos em recursos de cultura de tecidos estéreis. Utilizando um marcador visual de transformação e um oleoduto de regeneração de brotos, geraram com sucesso transformantes quase clonais, avançando assim os estudos futuros sobre a adaptação das plantas ao ambiente subaquático.

Transformação Eficiente Baseada em Regeneração Mediada por Agrobactérias de uma Espécie Assexuada de Brassicáceas, Rorippa aquatica

Teste de sensibilidade visual em lagartos usando um paradigma de condicionamento operante, que emprega a reprodução de vídeo de random-dot kinematograms e computer-generated invertebrados.

Teste de sensibilidade visual para a velocidade e direção do movimento em Lagartos

Aprenda a transformação genética mediada por Agrobacterium em arroz para estudar o desenvolvimento reprodutivo masculino usando Oryza sativa. Este método demonstra edição CRISPR-Cas9 do gene OsABCG15 para criar linhagens macho-estéreis.

Agrobacterium-Transformação Genética Mediada, Produção Transgênica e Sua Aplicação para o Estudo do Desenvolvimento Reprodutivo Masculino no Arroz (Vídeo) | JoVE Journal

Agrobacterium-Transformação Genética Mediada, Produção Transgênica e Sua Aplicação para o Estudo do Desenvolvimento Reprodutivo Masculino no Arroz

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