Name: Demonstração de Complexos Heterologos formados por Proteínas de Membrana Tipo III de Golgi-Residente usando Ensaio de Complementação de Luciferase Dividida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-10T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Aprenda a analisar interações entre proteínas de membrana tipo III do complexo de Golgi em células HEK293 vivas usando ensaio de complementação de luciferase dividida. Este método sensível permite detectar interações em níveis de expressão baixos.

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Este trabalho foi apoiado pela concessão nº 2016/23/D/NZ3/01314 do Centro Nacional de Ciência (NCN), Cracóvia, Polônia.

1. Geração de plasmídeos de expressão
<ol><li>Examine a topologia da membrana das proteínas de interesse usando uma ferramenta de previsão de topologia.</li>
	<li>Projete a estratégia de clonagem para que os fragmentos maiores e menores enfrentem o citoplasma uma vez que as proteínas de fusão tenham sido inseridas nas membranas golgi. Se, como no caso aqui apresentado, tanto n- quanto C-termini das proteínas de interesse são citoplasmicamente orientados, marque as proteínas de oito maneiras possíveis (ver Figura 1B). Se n ou C-terminus de uma ou ambas as proteínas de interesse forem luminally orientadas, exclua-a da marcação.</li>
	<li>Subclone os genes de interesse em vetores de expressão apropriados (ver Tabela de Materiais) seguindo protocolos de clonagem padrão. NOTA: O teste de todas as orientações possíveis é recomendado, uma vez que algumas opções de marcação podem não funcionar devido à proximidade insuficiente, orientação subótima ou restrições espaciais.</li>
</ol>2. Transfecção transitória da expressão plasmídeos nas células
<ol><li>Colher a cultura celular hek293T aderente por experimentação e resuspensar as células em um meio de crescimento completo dedicado. Coloque as células (2 x 104/100 μL/bem) em uma placa de fundo claro, lado branco de 96 poços. Ajuste o número total de poços para acomodar todas as combinações e controles testados, incluindo réplicas. NOTA: Tente usar apenas os 60 poços internos da placa para minimizar as mudanças térmicas e evitar a evaporação durante a noite. O uso de placas revestidas de poli-D-lysina é altamente recomendado, como as indicadas na Tabela de Materiais, caso contrário as células podem se desprender durante as etapas subsequentes de lavagem.</li>
	<li>Cultura as células durante a noite em condições padrão (37 °C, 5% CO2).</li>
	<li>No dia seguinte transfectam as células com as combinações desejadas de plasmídeos de expressão obtidos no ponto 1.1.<ol>
<li>Plasmídeos de expressão diluídos em um meio livre de soro (ver Tabela de Materiais) a 6,25 ng/μL para cada construção.</li>
		<li>Adicione o reagente de transfecção à base de lipídio em uma proporção lipídica-DNA apropriada e incubar de acordo com a instrução do fabricante.</li>
		<li>Adicione 8 μL de mistura lipídica:DNA aos poços designados. Misture o conteúdo da placa por rotação suave. Isso resulta na transfecção de ambas as construções de expressão a 50 ng/bem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultura as células por 20-24 h em condições padrão (37 °C, 5% CO2). NOTA: A colheita das células por mais tempo pode resultar em níveis mais elevados de expressão proteica de fusão, o que pode promover uma associação não específica entre os fragmentos.</li>
</ol>3. Troca média
<ol><li>No dia seguinte substitua o meio condicionado por 100 μL de um meio livre de soro em cada poço. Certifique-se de que as células não se separaram em troca média. NOTA: Esta etapa deve ser feita 2-3 h antes da adição da solução de trabalho furimazine. A retirada do soro minimiza o fundo causado pela autoluminescência da furimazina.</li>
</ol>4. Preparação da solução de trabalho furimazine
<ol><li>Pouco antes da medição, misture 1 volume de furimazine com 19 volumes de um tampão de diluição (uma diluição de 20 vezes). NOTA: O volume total da solução de trabalho furimazine a ser preparada depende do número de poços individuais a serem analisados (a solução de trabalho furimazine é adicionada ao meio de cultura celular em uma proporção de 1:5, portanto, a cada poço previamente preenchido com 100 μL de um meio sem soro 25 μL da solução de trabalho furimazine deve ser adicionado).</li>
	<li>Adicione a solução de trabalho furimazine aos poços designados (25 μL/well). Misture suavemente a placa à mão ou usando um agitador orbital (por exemplo, 15 s a 300-500 rpm).</li>
</ol>5. Medir a luminescência
<ol><li>Insira a placa em um leitor de microplaca de luminescência.<ol>
<li>Para experimentos que devem ser realizados a 37 °C equilibre a placa por 10-15 min na temperatura indicada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecione os poços a serem analisados.</li>
	<li>Leia a luminescência com tempo de integração de 0,3 s. Continue monitorando a luminescência por até 2 h quando necessário.</li>
</ol>6. Análise de dados
<ol><li>Calcular valores médios e desvios padrão para todas as combinações testadas e de controle.</li>
	<li>Analise os dados usando ANOVA unidirecional com várias comparações.</li>
	<li>Calcule os valores de alteração do fold dividindo uma luminescência média obtida para combinações de interesse por uma luminescência média obtida para os controles negativos correspondentes. Avalie os resultados. NOTA: A abordagem da análise de dados aqui proposta pressupõe que a interação pode ser reivindicada se a luminescência obtida para a combinação testada for estatisticamente significativamente maior do que a luminescência obtida para a combinação de controle correspondente e, ao mesmo tempo, a razão desses dois valores excede 10.</li>
</ol>

<ol><li>Hadley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+nucleotide+sugar+transporters%3A+Current+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).</li>
<li>Puglielli, L., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution%2C+identification%2C+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+GDP-fucose+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).</li>
<li>Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+UDP-N-acetylgalactosamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).</li>
<li>Gao, X., Dean, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+protein+domains+of+the+yeast+Golgi+GDP-mannose+transporter+mediate+oligomer+assembly+and+export+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).</li>
<li>Olczak, M., Guillen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mutation+and+an+alternative+splicing+of+UDP-galactose+transporter+in+MDCK-RCAr+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).</li>
<li>Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-N-acetylglucosamine+transporter+and+UDP-galactose+transporter+form+heterologous+complexes+in+the+Golgi+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane.</a> FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).</li>
<li>Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+delivery+of+activated+sialic+acid+into+Golgi+for+sialyation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).</li>
<li>Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+substrate+specificity+and+regulation+of+nucleotide+sugar+transporters+in+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer.</a> Nature Communications. 10 (1), 4657(2019).</li>
<li>Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+homologous+and+heterologous+interactions+between+UDP-galactose+transporter+and+beta-1%2C4-galactosyltransferase+1+using+NanoBiT%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT.</a> Analytical Biochemistry. 593, 113599(2020).</li>
<li>Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Leishmania+GDP-mannose+transporter+is+an+autonomous%2C+multi-specific%2C+hexameric+complex+of+LPG2+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits.</a> Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).</li>
<li>Sosicka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+the+orphan+nucleotide+sugar+transporter+SLC35A4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).</li>
<li>Sprong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+Golgi+UDP-galactose+transporter+with+UDP-galactose%3Aceramide+galactosyltransferase+allows+UDP-galactose+import+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).</li>
<li>Maszczak-Seneczko, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-galactose+%28SLC35A2%29+and+UDP-N-acetylglucosamine+%28SLC35A3%29+Transporters+Form+Glycosylation-related+Complexes+with+Mannoside+Acetylglucosaminyltransferases+%28Mgats%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats).</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).</li>
<li>Khoder-Agha, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylglucosaminyltransferases+and+nucleotide+sugar+transporters+form+multi-enzyme-multi-transporter+assemblies+in+golgi+membranes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).</li>
<li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
<li>Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+in+live+cells+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging in live cells and animals.</a> Neurophotonics. 3 (2), 025001(2016).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).</li>
<li>Inoue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+G-Protein-Coupling+Selectivity+of+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs.</a> Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).</li>
<li>White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+Protein+Tagging+with+Nanoluciferase+to+Investigate+Native+Chemokine+Receptor+Function+and+Conformational+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes.</a> Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).</li>
<li>Akinjiyan, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Luminescence-Based+High-Throuput+Approach+for+Cellular+Resolution+of+Protein+Ubiquitination+using+Tandem+Ubiquitin+Binding+Entities+%28TUBEs%29%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs).</a> SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).</li>
<li>Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoBiT+Complemetation+to+Monitor+Agonist-Induced+Adenosine+A1+Receptor+Internalization%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization.</a> SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).</li>
<li>Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+in+the+ATG5-ATG16L1+complex+following+nutrient+deprivation+measured+using+NanoLuc+Binary+Technlology+%28NanoBiT%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT).</a> FEBS Journal. , 15275(2020).</li>
<li>Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+NanoBiT-based+assay+monitors+the+interaction+between+lipoprotein+lipase+and+GPIHBP1+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time.</a> Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui fornecemos um protocolo detalhado que permite a demonstração de complexos heterologos formados entre proteínas de membrana tipo III residente em Golgi, como NSTs, utilizando o ensaio de complementação da luciferase split. A abordagem proposta para análise e interpretação de dados envolve relacionar a luminescência obtida para a combinação proteica de interesse à luminescência obtida para a combinação de controle correspondente, que é composta por uma das proteínas de interesse fundidas com o fragmento maior e a prot...

Este manuscrito descreve um protocolo passo-a-passo para verificar a presença de interações heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residentes em Golgi em células humanas transitóriamente transfectadas usando a variante mais recente do ensaio de complementação da luciferase dividida. O procedimento foi mais extensivamente testado contra transportadores de açúcar nucleotídeos (NSTs), mas também conseguimos resultados positivos para outras proteínas de membrana tipo III residentes em Golgi cujas proteínas de membrana N e/ou C-termini estão enfrentando o citoplasma.
Nosso grupo de pesquisa explora o papel dos NSTs na glicosilação de macromoléculas. Os NSTs são proteínas de membrana tipo III residentes em Golgi e/ou ER com n-e C-termini voltados para o lado citoplasmásmico da membrana organellar1. Acredita-se que os NSTs carreguem açúcares ativados por nucleotídeos através de membranas organela para fornecer glicosilatransferases com seus substratos. Os NSTs formam dimers e/ou maiores oligômeros2,3,4,5,6,7,8,9,10. Além disso, também foram relatadas interações heterólogas entre diferentes NSTs. Os NSTs também foram demonstrados para formar complexos com enzimas de glicosilação funcionalmente relacionadas12,13,14. Buscamos uma alternativa à técnica atualmente utilizada, a abordagem FRET baseada em fluorescência (FLIM), para estudar interações de NSTs e proteínas residentes em Golgi, então decidimos testar o ensaio de complementação da luciferase dividida. Permitiu identificar uma nova interação entre um NST e uma enzima de glicosylation funcionalmente relacionada9.
A modificação mais recente do ensaio de complementação da luciferase split, NanoBiT, é utilizada no protocolo aqui apresentado. Ela se baseia na reconstituição da enzima luciferase (por exemplo, NanoLuc) dos dois fragmentos - o grande, denominado como BiT grande ou LgBiT, uma proteína de 17,6 kDa, e o pequeno, composto por apenas 11 aminoácidos, denominados como pequenos BiT ou SmBiT. As duas proteínas de interesse são fundidas com os fragmentos complementares e transitavelmente expressas em uma linha celular humana. Se as duas proteínas de fusão interagirem, uma luminescência é produzida in situ após a adição de um substrato permeável celular. Esses dois fragmentos foram otimizados para que se associem à afinidade mínima, a menos que sejam reunidos por uma interação entre as proteínas de interesse a que se fundem.
Em geral, os métodos baseados em bioluminescência têm algumas vantagens sobre os baseados na fluorescência. Os sinais bioluminescentes têm uma maior relação sinal-ruído porque a luminescência de fundo é insignificante em comparação com o sinal derivado da luciferase16. Em contraste, abordagens baseadas em fluorescência geralmente sofrem de um fundo relativamente alto causado pelo fenômeno da autofluorescência. Além disso, a bioluminescência é menos prejudicial às células analisadas do que a fluorescência, pois no primeiro caso não há necessidade de excitar a amostra. Por essas razões, abordagens bioluminescentes para estudar PPIs in vivo superam os métodos fluorescentes comumente usados como Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ou Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).
Nosso protocolo se baseia em referir a luminescência obtida para a combinação proteica de interesse à luminescência obtida para a combinação de controle. Esta última inclui uma das proteínas testadas que é fundida com um fragmento maior e uma proteína de controle (por exemplo, HaloTag), fundida com um fragmento menor. Esta última é uma proteína de origem bacteriana que não se espera que interaja com nenhuma das proteínas mamíferas. O uso dessa proteína como controle coloca limitações à topologia dos pares de proteínas residentes em Golgi a serem analisados. Uma vez que nas células de mamíferos essa proteína é sintetizada no citoplasma, ambas as proteínas de interesse devem ter pelo menos uma cauda citoplasmática.
Esta abordagem pode ser particularmente útil para a triagem inicial de PPIs. Pode se tornar o método de escolha quando as proteínas de fusão de interesse são expressas em níveis que são simplesmente insuficientes para que outras abordagens sejam aplicadas. Da mesma forma, o ensaio de complementação da luciferase dividido pode ser a melhor opção se as proteínas de interesse forem expressas em níveis elevados, mas isso afeta negativamente sua localização subcelular ou é conhecido por forçar interações não específicas. Como o fragmento menor tem apenas 11 aminoácidos, o ensaio de complementação da luciferase dividido pode ser aplicado ao usar tags maiores é impossível. Por fim, pode ser empregado para confirmar ainda mais os dados obtidos utilizando outras técnicas, como no caso aqui apresentado.

<table><tbody><tr>Solução <td></td><td></td><td></td>de <td>tripsina-EDTA a 0,25%</td></tr><tr><td>Linha</td><td></td><td></td><td></td>celular de mamíferos aderente</tr><tr><td>BioCoat Poly-D-Lysine 96 poços Branco / Transparente Fundo Plano Microplaca tratada com TC, com tampa</td><td>Corning</td><td>356651</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td>de cultura</tr><tr><td>de células Suplementos de cultura de células (soro bovino fetal inativado por calor, L-glutamina, penicilina, estreptamicina)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expressão de plasmídeos que codificam proteína(s) de interesse não marcados com fragmentos</td><td></td><td></td><td></td>de NanoBiT</tr><tr><td>Reagente de transfecção FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>GloMax Discover Microplate Reader (ou um leitor de microplacas de luminescência diferente)</td><td>Promega</td><td>GM3000</td><td></td></tr><tr><td>Meio de crescimento dedicado à linha celular utilizada</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiais e reagentes para clonagem molecular padrão (bactérias, polimerase termoestável, enzimas de restrição, DNA ligase, materiais e reagentes para purificação de ácidos nucleicos)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT MCS Starter System</td><td>Promega</td><td>N2014</td><td>Este kit contém vetores que permitem a marcação das proteínas de interesse com fragmentos de NanoBiT em diferentes orientações, bem como o plasmídeo de controle que codifica a proteína HaloTag fundida com SmBiT e um par de plasmídeos de controle positivo.</td></tr><tr><td>Sistema de ensaio de células vivas Nano-Glo</td><td>Promega</td><td>N2011</td><td>Este kit contém furimazina, que é um substrato que permite a detecção da atividade de NanoLuc em células vivas, e um tampão de diluição dedicado.</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium, sem vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Agitador</td><td></td><td></td><td></td>de oribital</tr><tr><td>Software para análise de dados (por exemplo, GraphPad Prism)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

demonstração de complexos heterologos formados por proteínas de membrana tipo iii de golgi-residente usando ensaio de complementação de luciferase dividida

Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay

O objetivo deste protocolo é explorar a aplicabilidade da variante mais recente da complementação da luciferase dividida para demonstrar complexos heterologos formados por transportadores de açúcar nucleotídeos (NSTs). Essas proteínas multitransmembrana residentes em ER e Golgi carregam os açúcares nucleotídeos citoplasmicamente sintetizados através de membranas organelas para fornecer enzimas que mediam a glicosiloção com seus substratos. Os NSTs existem como dimers e/ou oligômeros superiores. Interações heterólogas entre diferentes NSTs também foram relatadas. Para verificar se a técnica é adequada para estudar o fenômeno da heteromerização do NST, testamos-a contra uma combinação dos dois NSTs residentes em Golgi que foram previamente mostrados para associar por vários outros meios. O ensaio de complementação da luciferase parece ser particularmente adequado para estudar interações entre proteínas de membrana residente em Golgi, pois não requer altos níveis de expressão, que muitas vezes desencadeiam a deslocalização da proteína e aumentam o risco de falsos positivos.

Para obter os dados mais confiáveis nesta abordagem, todas as combinações possíveis devem ser testadas (ver Figura 1). Em paralelo, devem ser incluídos controles positivos e negativos. O controle positivo deve consistir nas duas proteínas que são conhecidas por interagir, das quais uma é fundida com o fragmento maior e a outra é fundida com o fragmento menor. O controle negativo, idealmente, deve consistir nas duas proteínas de membrana tipo III não interagindo marcadas da mesma forma. No en...

O protocolo aqui apresentado destina-se a demonstrar a ocorrência de interações heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residente em Golgi com n- e/ou C-termini expostos citoplasma em células de mamíferos vivos usando a variante mais recente do ensaio de complementação da luciferase dividida.

Demonstração de Complexos Heterologos formados por Proteínas de Membrana Tipo III de Golgi-Residente usando Ensaio de Complementação de Luciferase Dividida

The goal of this protocol is to explore the applicability of the most recent variant of split luciferase complementation for demonstrating heterologous ...

Nosso protocolo permite identificar e analisar interações entre proteínas multitransmembranares do retículo endoplasmático e complexo de golgi em células vivas com baixos níveis de expressão. A principal vantagem desta técnica é a sensibilidade especial, que permite evitar altos níveis de superexpressão que muitas vezes são prejudiciais à saúde celular e podem perturbar a localização subcelular da proteína. Colha a cultura de células T HEK293 aderente por tripsinização e ressuspenda as células em um meio de crescimento completo dedicado.Coloque as células em uma placa de fundo transparente, com 96 poços de 96 poços. Ajustar o número total de alvéolos para acomodar todas as combinações e controlos testados, incluindo réplicas. Em seguida, cultive as células durante a noite em condições padrão.No dia seguinte, transfecte as células com as combinações desejadas de plasmídeos de expressão. Dilua os plasmídeos em um meio sem soro para 6,25 nanogramas por microlitro para cada construção e adicione o reagente de transfecção à base de lipídios. Adicione uma proporção apropriada de lipídios para DNA.Incube os plasmídeos de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, adicione oito microlitros da mistura de DNA lipídico aos poços designados. Misturar o conteúdo da placa com uma rotação suave e cultivar as células durante 20 a 24 horas em condições normais.No dia seguinte, substitua o meio condicionado em cada poço por 100 microlitros de meio sem soro, certificando-se de que as células não se desprendam na troca do meio. Imediatamente antes de medir a luminescência, misturar um volume de furimazina com 19 volumes de tampão de diluição. Adicione 25 microlitros da solução de trabalho de furimazina em cada poço e misture suavemente a placa manualmente ou com um agitador orbital.Insira a placa em um leitor de microplacas de luminescência e equilibre a placa a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Selecione os poços a serem analisados e leia a luminescência com um tempo de integração de 0,3 segundos. Continue monitorando a luminescência por até duas horas quando necessário.Este protocolo foi testado em dois transportadores de açúcar nucleotídeo, SLC35A2 e SLC35A3, que são proteínas de membrana tipo três residentes em golgi com terminais N e C voltados para o citoplasma. Havia oito opções de marcação possíveis e as proteínas de fusão resultantes poderiam ser reunidas de oito maneiras possíveis. As unidades médias de luminescência relativa ou os valores de RLU correspondentes a todas as combinações testadas e de controle são mostrados aqui.Os valores de RLU obtidos para três das combinações foram significativamente maiores do que os obtidos para a combinação controle correspondente. Para obter os valores de razão para as combinações de interesse, os valores de RLU foram divididos pelos valores de RLU obtidos para os respectivos controles. Proporções entre 10 e 1000 são altamente indicativas de interações específicas.Havia duas dessas combinações que apoiavam a ideia de que SLC35A2 e SLC35A3 interagem. Para confirmar esses dados, SLC35A2 ou SLC35A3 marcados com HA foram co-expressos com a combinação que resultou na maior luminescência relativa. Quantidades variáveis dos plasmídeos e variantes NST marcadas com HA foram usadas para co-transfecção, resultando em uma diminuição dependente da dose estatisticamente significativa nos valores de RLU.O mais crítico é abordar seu interesse próprio de proteína de todas as maneiras possíveis e testar todas as combinações possíveis, pois alguma orientação de marcação pode produzir resultados falsos negativos. Uma vez selecionada a combinação de melhor desempenho, a dinâmica da interação correspondente pode ser monitorada para, por exemplo, identificar agentes ou condições que interrompem seu complexo de interesse ao longo do tempo.

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Aqui, descrevemos os procedimentos para estudar mudanças na fagocitose induzida por expressão de genes com uma abordagem gene luciferase baseado repórter usando o Dual-GloTM Sistema de ensaio de luciferase da Promega.

Estudando Biogenesis de membrana com um ensaio de luciferase Gene-Based Reporter

A localização subcelular de proteínas é importante para determinar a regulação espaço-temporal de sinalização celular. Aqui, descrevemos complementação bimolecular de fluorescência (BiFC) como um método simples para monitorar as interações espaciais de proteínas na célula.

Complementação de fluorescência bimolecular

Um procedimento eficiente para avaliar a propensão oligomerização de domínios de uma única passagem transmembrana (DTM) é descrito. Proteínas quiméricas que consiste na DTM fundido a ToxR são expressos em uma cepa de E. coli repórter. DTM induzida por oligomerização causas dimerização de ToxR, a ativação de transcrição e de produção da proteína repórter, galactosidase.

Transmembrana Propensão Oligomerização Domínio determinado pelo Assay ToxR

Nós desenvolvemos um ensaio de fusão de células que quantifica SNARE mediadas por eventos de fusão da membrana por expressão activada de β-galactosidase.

Análise de SNARE mediada por fusão de membrana usando um ensaio de fusão celular enzimática

Este vídeo demonstra o ensaio de complementação de luciferase dividida para detectar interações proteína-proteína. Neste ensaio, as proteínas de interesse são marcadas em pequenos e grandes fragmentos da enzima luciferase. Quando as proteínas interagem, os fragmentos grandes e pequenos se combinam para formar um complexo enzimático ativo, que na presença de um substrato específico, libera luminescência brilhante que pode ser medida.

Ensaio de complementação de luciferase dividida para identificar interações proteína-proteína específicas

A localização exacta dos residentes de Golgi é essencial para a compreensão de Golgi a funções celulares. No entanto, a microscopia óptica convencional é incapaz de resolver a estrutura sub-Golgi. Aqui descrevemos o protocolo para um método de super-resolução microscopia convencional baseado determinar quantitativamente a localização sub-Golgi de uma proteína.

Localização de quantitativa de uma proteína de Golgi por imagem sua massa centro de fluorescência

Aqui, nós mostramos como usar uma proximidade da ligadura do ensaio (PLA) para visualizar MST1/MST2 heterodimerization em células fixas com alta sensibilidade.

Deteção de Heterodimerization de isoformas de proteínas usando um ensaio de ligadura de proximidade em Situ

Aqui nós apresentamos um biossensor baseado em luciferase para quantificar a atividade da quinase do supressor do tumor grande (LATS)-uma quinase central no Hippo via de sinalização. Este biosensor tem diversas aplicações na pesquisa básica e translacional, visa investigar hipopótamo via reguladores in vitro e em vivo.

Monitoramento de hipopótamo, sinalizando o Pathway atividade usando um Tumor grande baseado em Luciferase supressor (LATS) Biosensor

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a interação eIF4E-eIF4G em células vivas que permitiria ao usuário avaliar a perturbação induzida por drogas da dinâmica complexa eIF4F em formatos de triagem.

Monitorando o conjunto eIF4F medindo a interação eIF4E-eIF4G em células vivas

Este protocolo demonstra o uso do ensaio de ligadura de proximidade para sondar interações proteína-proteína in situ na germinação C. elegans.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline usando Ensaio de Ligação de Proximidade

Estabelecemos um ensaio de remontagem de luciferase dividida para monitorar os contatos retículo-mitocôndria endoplasmática em células vivas. Usando este ensaio, descrevemos um protocolo para medir quantitativamente o nível desses acoplamentos inter-organelas em HEK293T células, sob a condição de tratamento químico.

Ensaio de remontagem de luciferase dividida para medir contatos de retículo endoplasmático-mitocôndrias em células vivas

Aprenda a analisar interações entre proteínas de membrana tipo III do complexo de Golgi em células HEK293 vivas usando ensaio de complementação de luciferase dividida. Este método sensível permite detectar interações em níveis de expressão baixos.

Demonstração de Complexos Heterologos formados por Proteínas de Membrana Tipo III de Golgi-Residente usando Ensaio de Complementação de Luciferase Dividida (Vídeo) | JoVE Journal

Demonstração de Complexos Heterologos formados por Proteínas de Membrana Tipo III de Golgi-Residente usando Ensaio de Complementação de Luciferase Dividida

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