Isolamento e Identificação Conjuntivival Commensal em Camundongos
May 1st, 2021
Apresentado aqui é um protocolo para o isolamento e amplificação de bactérias comensais anaeróbicas aeróbicas e facultativas de camundongos anastrérmicos utilizando um cotonete de olho único e passo de enriquecimento baseado em cultura com identificação subsequente por métodos à base microbiológica e espectrometria de massa MALDI-TOF.
Este método identifica microrganismos conjuntivistas oculares viáveis, o que é desafiador devido ao ambiente hostil dos olhos. Ele pode ajudar a responder se existe um microbioma ocular e como a presença bacteriana muda na doença ocular. Em contraste com o sequenciamento de DNA, que identifica microrganismos viáveis e não viáveis, este método identifica apenas microrganismos viáveis, resultando em uma compreensão mais clara da comunidade commensal ocular.
Estudos sugerem que doenças oculares difíceis de diagnosticar, como olho seco não autoimune e autoimune, têm presença bacteriana ocular única. Este método poderia ser usado para diagnosticar doenças oculares com assinaturas microbianas distintas. Comece autoclavando a quantidade apropriada de rebatidas de algodão e palitos de dente para o número de ratos a serem varridos, em seguida, beliscar 1/2 um centímetro de comprimento pedaço de algodão rebatendo e provocá-lo puxando-o para fora puxando as bordas para formar uma camada porosa plana parando pouco antes do rebatedor desmoronar.
Gire o rebatedor em torno de uma das extremidades afiadas do palito segurando levemente a peça esticada na ponta do palito enquanto é torcida. O cotonete de olho acabado terá uma camada muito fina de algodão estendida sobre a ponta que se estende aproximadamente 1/2 a um centímetro de distância da ponta. Insira os cotonetes em um pequeno béquer, cotonete de lado para baixo, em seguida, cubra e autoclave-os.
Limpe a área de trabalho com um desinfetante para minimizar a contaminação e alíquota de 0,5 mililitros de infusão cardíaca cerebral estéril, ou mídia BHI em tubos de micro centrífugas estéreis de 1,5 mililitros. Tampe os tubos em um rack e coloque o rack no gelo. Configure o fluxo de trabalho da esquerda para a direita começando com a estação de anestesia do rato, que contém a gaiola com os ratos experimentais, gaiola estéril vazia, anestesia de temperatura ambiente, agulha de calibre 25 e uma seringa de um mililitro.
Em seguida, prepare uma estação de limpeza ocular que contém o BHI aliquoted no gelo, cotonetes oculares esterilizados, colírios lubrificantes, recipiente de risco biológico, toalhas de papel limpas e spray de isopropanol de 70%. Por fim, configure a estação de revestimento com placas de ágar de sangue de temperatura ambiente, uma pipeta de 10 microliter, 10 microliter estérilsa de pontas descartáveis estéreis e um recipiente de resíduos de risco biológico. Certifique-se de que o mouse está devidamente anestesiado apertando uma almofada traseira.
Só prossiga se não houver movimento. Atribua uma mão para manusear ratos anestesiados e as outras mãos para manusear o cotonete dos olhos e a cultura. Retire o rato da gaiola e coloque-o em cima da superfície de trabalho posicionada de lado com o olho esquerdo exposto.
Pulverize as mãos com isopropanol e seque-as com uma toalha de papel. Descap o tubo de micro centrífugas BHI rotulado com a mão de manuseio de mídia dedicada e coloque os dois de volta no rack. Mergulhe a ponta revestida de algodão do cotonete do olho no BHI, em seguida, retire o cotonete do tubo enquanto gira a ponta duas vezes contra o tubo interno para remover o excesso de líquido e removê-lo.
Com a mão manuseando o mouse, segure suavemente o mouse pelo escroto do pescoço. Por outro lado, coloque a ponta do cotonete dos olhos contra a região de conjunturação medial do olho esquerdo. Deprimir levemente o globo ocular e mover o cotonete em um movimento de lavagem da janela entre a pálpebra inferior e o olho 10 vezes, mantendo a pressão constante.
Sem tocar na pele, remova suavemente a ponta do cotonete perpendicular para onde foi inserido. Coloque o lado do algodão do cotonete para baixo, diretamente em um tubo de micro centrífuga rotulado com mídia BHI. Aplique um colírio no olho esfregado.
Se desejar, adquira cotonetes de pele ou pele para amostras de controle, esterilizando luvas adequadamente entre cada cotonete. Quando terminar, devolva o rato para a gaiola. Deixe o cotonete ficar por 10 a 15 minutos no gelo, depois esterilize as mãos enluvadas e remova o cotonete enquanto mistura a ponta na mídia para 10 rotações.
Retire o cotonete girando a ponta contra a parede interna do tubo para cinco rotações e descarte-o em um recipiente de risco biológico. Repita o processo para cada mouse. Enriqueça a amostra incubando o tubo estaticamente por uma hora a 37 graus Celsius.
Durante a incubação, rotule uma placa TSA de temperatura ambiente por cotonete de olho de rato ou cotonete de controle e divida-a ao meio. Remova as amostras enriquecidas da incubadora e coloque-as no gelo. Brevemente o vórtice das amostras para misturar, em seguida, aliquot 10 microliters da amostra na placa TSA e inclinar a placa para formar uma tira.
Repita isso duas vezes. Do outro lado da linha divisória das placas, crie 10 pontos com 10 microliters de amostra cada. Incubar as placas a 37 graus Celsius durante 18 horas, dois dias e quatro dias em uma câmara limpa que impede a secagem das placas de ágar.
Conte as colônias nas tiras. Note morfologia e calcule unidades de formação de colônias por cotonete para isolados morfologicamente semelhantes. Olhe para os pontos onde organismos únicos não são capturados nas tiras.
Para facilitar a visualização, banhamos bactérias densamente nas placas média e direita. Normalmente, observamos muito menos bactérias em placas de cotonetes oculares. Note que, de vez em quando, os cotonetes oculares podem não produzir bactérias recuperáveis.
Uma placa de cotonete de olho representativa com isolados morfologicamente diversos de um rato c57 preto seis é mostrado aqui. Para cada isolado distinto, as colônias foram contadas na faixa e a abundância relativa foi calculada e plotada. Para caracterização microbiológica, as bactérias foram colhidas a partir de placas individuais de cotonetes de olhos de rato para produzir uma placa TSA mestre.
Quando o crescimento apareceu, foram realizados testes adicionais para caracterizar ou identificar os micróbios. A placa principal foi usada para fornecer inóculo suficiente para expandir os respectivos isolados. Para identificar isolados, uma placa TSA foi listrada e incubada durante a noite, e MALDI-TOF MS foi realizada.
Exemplos de isolados aqui mostrados foram identificados como Streptococcus acidominimus e Aerococcus viridans. Níveis significativamente diferentes de organismos commensais foram recuperados de seis camundongos pretos C57 masculinos e femininos. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans coagulates negativos Staphylococci e E.coli foram isolados de C57 preto seis N ratos.
Ao tentar este protocolo, tenha em mente que o melhor resultado será alcançado revestindo o cotonete finamente e tomando tempo durante o passo do cotonete dos olhos. Se o acesso ao MALDI-TOF MS for limitado, os isolados poderão ser identificados por testes microbiológicos e bioquímicos.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para isolar e amplificar bactérias comensais conjuntivais de camundongos aeróbicas e facultativas anaeróbicas. Ele emprega uma etapa única de esfregaço ocular e enriquecimento baseado em cultura, seguida de identificação usando métodos microbiológicos e espectrometria de massa MALDI-TOF.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Oftalmologia
- Bactérias Comensais
Fundo
- Identificar microrganismos conjuntivais oculares viáveis é desafiador devido ao ambiente hostil do olho.
- Este método foca em microrganismos viáveis, fornecendo uma compreensão mais clara da comunidade comensal ocular.
- Assinaturas bacterianas únicas podem estar associadas a doenças oculares difíceis de diagnosticar.
- O método contrasta com o sequenciamento de DNA, que detecta microrganismos viáveis e não viáveis.
Propósito do Estudo
- Determinar a existência de um microbioma ocular.
- Investigar como a presença bacteriana muda na doença ocular.
- Desenvolver um método diagnóstico para doenças oculares baseado em assinaturas microbianas.
Métodos Usados
- Autoclavagem de algodão e palitos para esfregaço em camundongos.
- Esfregaço na área conjuntival de camundongos com algodão preparado.
- Enriquecimento baseado em cultura das bactérias isoladas.
- Identificação de bactérias usando espectrometria de massa MALDI-TOF.
Principais Resultados
- Microorganismos viáveis foram identificados com sucesso a partir de amostras conjuntivais de camundongos.
- O método forneceu insights sobre a comunidade comensal ocular.
- Possíveis ligações entre presença bacteriana e doenças oculares foram sugeridas.
- Esta abordagem pode melhorar o diagnóstico de doenças oculares com assinaturas microbianas distintivas.
Conclusões
- O protocolo efetivamente isola e identifica microrganismos oculares viáveis.
- Oferece uma compreensão mais clara do microbioma ocular em comparação com métodos tradicionais.
- Este método pode ser fundamental no diagnóstico de doenças oculares baseado em perfis microbianos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Isolating viable ocular commensal bacteria enables target validation in preclinical models of eye disease by providing a disease-relevant system to monitor microbial shifts. This method supports mechanistic de-risking by distinguishing live from dead microorganisms, improving predictive confidence in biomarker discovery. It positions microbiological profiling as a translational tool for de-risking therapeutic hypotheses in ophthalmology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating viable conjunctival microorganisms under different disease conditions.
- Operational Value: Provides a culture-based method to define commensal diversity in mice, supporting biological de-risking of ocular targets.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking microbial signatures to disease states, improving target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enriching aerobic and facultative anaerobic genera from ocular samples.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through a swab-based technique with controlled enrichment and plating steps.
- Scalability: Highlights platform reuse potential for monitoring microbial shifts across experimental groups and disease models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking unique bacterial presence to difficult-to-diagnose eye diseases such as autoimmune and non-autoimmune dry eye.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal monitoring of ocular microbiota.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decisions based on microbial signatures, aligning with translational biomarker alignment strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to preclinical validation, supporting lead identification through microbial profiling.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by isolating viable microorganisms to clarify pathway involvement in ocular surface immunity.
- Screening: Describes assay readiness through culture-based enrichment and quantitative outputs like colony forming units per swab.
- Analytics: Highlights measurements such as morphology, relative abundance, and MALDI-TOF MS identification that help teams compare conditions across groups.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling monitoring of microbial changes in disease models, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for microbiological profiling across ocular disease models, not a single-use technique.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in ocular microbiome studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of viable bacterial isolation from low-abundance ocular samples.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in ophthalmology programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on microbial signatures linked to disease phenotypes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in microbiological techniques, anaerobic culture handling, and MALDI-TOF MS operation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include autoclave, incubator, plating equipment, and mass spectrometry for identification.
- Cross-team standardization requirements for swab preparation, enrichment timing, and plating consistency across users.
- Adaptation considerations across model systems, including potential adjustments for different species or ocular surface accessibility.
- Practical limitations supported by source material: low recoverable bacteria, occasional failure to yield isolates, and dependence on proper swabbing technique.
