Transplante de um Patch Bioimpresso 3D em um modelo murino de infarto do miocárdio
26 de setembro de 2020
Este protocolo visa transplantar um patch bioimpresso 3D no epicárdio de camundongos infartados modelando insuficiência cardíaca. Inclui detalhes sobre anestesia, abertura do tórax cirúrgico, ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD) e aplicação de um patch bioimpresso na área infarto do coração.
A cada 10 minutos, alguém na Austrália tem um ataque cardíaco. Isso pode deixá-los com músculo cardíaco danificado, e isso pode levar à insuficiência cardíaca. Descobrimos que podemos converter células-tronco, de sangue ou pele, em células cardíacas pulsas.
Então, se colocarmos essas células reprogramadas, através de nossa bioimpressora 3D, usando bioink, acreditamos que podemos fazer remendos cardíacos com células que correspondem às próprias células das pessoas. Um rato profundamente anestesiado, usando xilazina de cetamina, é entubado usando um cateter de calibre 20. Após a intubação do rastreador, o mouse é cuidadosamente colocado em uma almofada de aquecimento e, em seguida, conectado ao ventilador que define automaticamente o volume alvo com base no peso do mouse.
Sob uma anestesia leve usando fluoreto de iso, o rato só está limpo com iodo e etanol. Uma toracotomia lateral esquerda é realizada para expor o coração. Um retraído é colocado entre a terceira e a quarta costela.
O pericárdio é cortado cuidadosamente. O RAPAZ identificado sob o microscópio. Para a etapa de ligadura LAD, é importante evitar o corte de sutura através do LAD.
Portanto, uma peça de reforço de sutura de seda 3.06 é colocada no coração como mostrado, correndo na mesma direção e apenas em cima do LAD. Usando uma sutura de seda 7.06, o LAD é isolado e permanentemente ligado. Isso permite o branqueamento do coração que está recebendo um ataque cardíaco.
Isso levará à remodelação e o ventrículo esquerdo falhará com o tempo. Um patch cardíaco bioimpresso 3D é gerado em laboratório usando uma bioimpressora 3D. Isso permite a camada por camada, deposição de células cardíacas, usando uma combinação de células e hidrogéis.
Você pode ver um flutuando neste vídeo e agora nesta imagem. Aqui está uma imagem da aparência do patch quando imagens por microscopia de luz de epifluorescência em um poço de uma placa de seis poços. O patch foi manchado com mancha hoechst para núcleos celulares, e esta mancha azul também está destacando os hidrogéis autofluorescentes.
Este é um patch de gelatina algenada intacta adequado para transplante, semelhante ao mostrado no vídeo. Com nosso método, a maioria das manchas começou a se desintegrar entre 14 e 28 dias, na cultura, como mostrado aqui nesta imagem de outro patch, que se desintegrou. Descobrimos que o momento ideal para transplantar patches foi entre o sétimo dia e o dia 14 após a bioimpressão.
Foi quando manchas contendo células cardíacas começaram a bater, mostrando um grau de maturação tecidual, mas antes das manchas começarem a se desintegrar. O patch é levado para a sala cirúrgica, e lentamente e cuidadosamente colocado em cima do coração em parte do rato. Cuidadosamente também é movido para a área do inferimento.
O retrátil é lentamente removido. Finalmente, a terceira e quarta costelas são fechadas juntas usando uma sutura de 6.0 prolene. Junto com um músculo, as costelas são fechadas, seguidas pelo fechamento da pele.
Após o fechamento do baú, o rato é injetado com Antisedan e furosemida. Lentamente, o rato recuperará a atividade respiratória independente, e responderá ao aperto do dedo do dedo do dedo. O rato é monitorado de perto, e uma vez que ele acorda do anestésico, ele é colocado em sua própria gaiola.
Esta imagem mostra, com a área adotada, onde o patch bioimpresso ficará em cima do coração do rato. Em conclusão, mostramos que manchas de gelatina de algenato bioimpressoras 3D podem ser transplantadas pelo nosso método, para o epicárdio, em um modelo de camundongo de infarto do miocárdio. Na fase de bioimpressão, os hidrogéis de gelatina algenate têm excelente impressão devido às suas propriedades reológicas, permitindo a extrusão sem danificar as células, mas também tendo a força biomecânica para reter sua estrutura após a bioimpressão 3D, e durante o transplante.
Nosso método provavelmente será amplamente viável e também adequado para testar vários grupos de patches bioimpostos 3D. Por exemplo, com diferentes conteúdos celulares.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para o transplante de um retalho bioprintado tridimensional sobre o epicárdio de camundongos infartados, modelando insuficiência cardíaca. O método inclui etapas cirúrgicas detalhadas e o uso de retalhos bioprintados feitos a partir de células cardíacas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Engenharia de tecidos cardíacos
- Bioprintagem 3D
- Modelos de infarto do miocárdio
Antecedentes
- Ataques cardíacos podem levar a danos no músculo cardíaco e insuficiência cardíaca.
- Células-tronco podem ser reprogramadas em células cardíacas contráteis.
- A bioimpressão 3D permite a criação de retalhos cardíacos utilizando bio-tinta.
- O tempo ideal para o transplante do retalho é crucial para o sucesso.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para o transplante de retalhos cardíacos bioprintados.
- Avaliar a viabilidade do uso de células compatíveis com o paciente na criação dos retalhos.
- Avaliar a eficácia dos retalhos em um modelo murino de infarto do miocárdio.
Métodos Utilizados
- Uso de cetamina e xilazina como anestesia em camundongos.
- Toracotomia lateral esquerda para exposição do coração.
- Ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda.
- Transplante de retalhos bioprintados em 3D sobre o coração.
Resultados Principais
- Os enxertos bioprintados em 3D apresentaram boa capacidade de impressão e resistência biomecânica.
- Os enxertos começaram a se desintegrar entre 14 e 28 dias em cultura.
- O transplante ideal ocorreu entre os dias 7 e 14 após a bioprintagem.
- O método é adequado para testar diversas composições de enxertos bioprintados.
Conclusões
- Os retalhos bioprintados em 3D de alginato-gelatina podem ser transplantados com sucesso.
- A técnica provavelmente será amplamente aplicável na pesquisa cardíaca.
- Estudos futuros podem explorar diferentes conteúdos celulares para melhorar os resultados.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo aborda um gargalo crítico na pesquisa de regeneração cardíaca: o teste confiável in vivo de retalhos terapêuticos bioprintados em 3D em modelos de infarto do miocárdio murinos. Ao reduzir a variabilidade procedural e a mortalidade associada ao transplante cirúrgico, ele permite uma avaliação pré-clínica mais estatisticamente robusta de tecidos engenheirados. Esse avanço contribui para a redução de riscos de biológicos e biomateriais em estágios iniciais, melhorando a reprodutibilidade em estudos de validação funcional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a avaliação funcional de retalhos bioprintados em um microambiente isquêmico relevante para a doença, validando hipóteses mecanicistas sobre enxerto tecidual e sinalização parácrina.
- Valor Operacional: Padroniza a administração cirúrgica de biológicos complexos, reduzindo a variabilidade entre animais na eficiência de enxerto.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Fornece uma plataforma reproduzível para comparar formulações de enxertos (por exemplo, tipos celulares, proporções de hidrogéis) com base em métricas de retenção estrutural e integração.
- Valor Operacional: Apoia a triagem de média produtividade de candidatos a biomateriais ao permitir a administração cirúrgica consistente entre os grupos de estudo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a avaliação longitudinal do remodelamento ventricular mediado por retalho e da recuperação funcional em um modelo clinicamente relevante de lesão isquêmica.
- Valor Operacional: Permite estudos com maior poder estatístico e menor taxa de perda, melhorando a viabilidade de experimentos de otimização de dose-resposta e cronometragem.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico ao permitir a administração padronizada de tecidos engenheirizados após a validação do alvo e antes da triagem de eficácia em modelos de doenças.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses relacionadas à sobrevivência celular, enxertia e secreção de fatores bioativos no miocárdio infartado.
- Triagem: Permite a comparação quantitativa de diferentes designs de retalhos por meio de implante cirúrgico padronizado e monitoramento pós-transplante.
- Análises: Gera dados histopatológicos e funcionais (por exemplo, tamanho do infarto, espessura da parede) para classificar o desempenho dos retalhos.
- Pesquisa Translacional: Conecta métricas de maturação in vitro com resultados funcionais in vivo para orientar decisões de continuidade ou interrupção de projetos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma cirúrgica reutilizável para avaliar diversos candidatos regenerativos cardíacos em diferentes projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Melhora a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao reduzir variáveis cirúrgicas de confusão.
- Valor Operacional: Aumenta a reprodutibilidade e escalabilidade de procedimentos complexos de transplante de tecidos.
- Valor Estratégico: Reduz o ruído biológico nas avaliações de eficácia, apoiando decisões mais claras de avançar ou não avançar no desenvolvimento inicial.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos à regeneração cardíaca com base em dados pré-clínicos mais confiáveis.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cirurgia cardíaca em camundongos, anestesia e cuidados pós-operatórios.
- Depende do acesso a ferramentas de sutura microcirúrgica, ventiladores e estereomicroscópios para a ligadura precisa da artéria descendente anterior (LAD).
- Necessita padronização dos protocolos de manipulação e posicionamento do retalho entre diferentes operadores.
- Deve levar em conta a variabilidade no tempo de maturação do retalho com base na fonte celular e na composição do hidrogel.
- Limita-se a modelos de lesão aguda e subaguda; não é adequado para estudos de isquemia crônica sem adaptação do modelo.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:42
Surgical Procedure
1:18
Preparing the Surgical Field
1:31
Left Lateral Thoracotomy
2:00
Left Anterior Descending (LAD) Permanent Coronary Artery Ligation
2:58
3D Bioprinting and Culturing Patches (7-14 days before transplantation)
4:19
Transplantation of the Bioprinted Patch onto the Epicardium
5:39
Mouse Recovery
6:29
Representative Results
6:45
Conclusion
