Um Ensaio Ex Vivo Choroid de Angiogênese Microvascular Ocular
6 de agosto de 2020
Este protocolo apresenta ensaio de brotos de choroide, um modelo ex vivo de proliferação microvascular. Este ensaio pode ser usado para avaliar caminhos envolvidos na proliferação de micro vasos choroidais e avaliar tratamentos medicamentosos usando tipo selvagem e tecido de camundongos geneticamente modificados.
Este ensaio de coróide é altamente reprodutível e pertinente à pesquisa de angiogênese coroidal e degeneração macular relacionada à idade, DMRI Pode complementar estudos in vivo do comportamento microvascular. Este ensaio pode ser usado para rastrear compostos como tratamentos potenciais para DMRI neovascular ou para avaliar as vias envolvidas na Neovascularização Coroidal usando tecido de camundongo selvagem e geneticamente modificado. Para começar, adicione cinco mililitros de penicilina, estreptomicina e 10 e cinco mililitros de suplementos disponíveis comercialmente a 500 mililitros de meio clássico completo com soro e, em seguida, alíquota de 50 mililitros do meio, descongele o extrato de membrana basal ou BME durante a noite em uma geladeira a dois a oito graus Celsius.
Coloque uma alíquota de meio clássico completo no gelo. Limpe o microscópio de dissecação, fórceps e tesoura com etanol a 70%. Preparar para placas de cultura de células e colocar uma no microscópio de dissecação e a outra no gelo.
Em seguida, adicione 10 mililitros de meio clássico completo a cada prato. Mantenha os olhos em meio clássico completo no gelo antes da dissecação. Remova o tecido conjuntivo e o nervo óptico e, em seguida, use uma microtesoura para cortar circunferencialmente 0,5 milímetros posterior ao limbo da córnea.
Remova o complexo da córnea da íris, vítreo e para o cristalino. Faça uma incisão de um milímetro perpendicular à borda cortada em direção ao nervo óptico e, para cortar uma faixa circunferencial de um milímetro de largura, separe as regiões central e periférica do complexo. Use uma pinça para descascar a retina do complexo da esclera coróide do EPR.
Mantenha a banda coróide periférica em meio clássico completo no gelo. Isole o outro olho e repita o processo para cortar uma segunda faixa. Corte a faixa circular em cinco a seis pedaços quadrados aproximadamente iguais.
Adicione 30 microlitros do BME descongelado no centro de cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Certifique-se de que a gota de BME forme uma cúpula convexa na parte inferior da placa sem tocar nas bordas. Coloque o tecido no meio do BME.
Não alise a planta X da coróide. Deixe o tecido se expandir dentro do BME. Incube a placa a 37 graus Celsius por 10 minutos para deixar o gel solidificar e, em seguida, adicione 500 microlitros de meio clássico completo em cada poço.
Mude o meio clássico a cada dois dias. O brotamento da coróide pode ser observado após três dias com um microscópio. Abra a imagem de brotamento de coróide com a imagem J e verifique a imagem, digite e oito bits com escala de cinza.
Em seguida, otimize o contraste selecionando imagem, ajuste, contraste de brilho e ajustando-o. Use a função de varinha mágica para delinear e remover o tecido coróide que está presente no centro dos brotos. Remova o fundo da imagem com as ferramentas de seleção gratuitas.
Em seguida, vá para a imagem, ajuste o limiar e use a função de limiar para definir os brotos microvasculares contra o fundo na periferia. Clique em F2 e um resumo aparecerá. Clique em salvar para salvar uma imagem da área selecionada na mesma pasta da imagem original para referência futura.
Depois que um grupo de amostras for medido, copie os dados registrados para análise. Este protocolo foi usado para examinar e quantificar o brotamento da coróide em C 57, camundongos J pretos seis do terceiro ao sexto dia. Em um caso representativo, a área de brotação da coroide foi de 0,38, 1,47, 5,62 e 10,09 milímetros quadrados nos dias três, quatro, cinco e seis, respectivamente.
Os efeitos da perda de FFAR4 na germinação vascular da coroide foram avaliados usando o ensaio de germinação da coróide em camundongos FFAR4 quatro knockout e FFAR4 do tipo selvagem. A área de brotamento em camundongos knockout para FFAR4 aumentou o crescimento vascular coroidal em comparação com o tipo selvagem FFAR4 no sexto dia. Além disso, o tratamento com um agonista micromolar FFAR4 reduziu a área de brotamento coroidal em comparação com camundongos não tratados no sexto dia.
Este ensaio permite a avaliação reprodutível do potencial antiangiogênico de compostos farmacológicos e a variação do papel de vias específicas na Neovascularização Coroidal utilizando tecido de camundongos geneticamente modificados.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este protocolo apresenta um ensaio de brotamento da coroide como um modelo ex vivo para o estudo da proliferação microvascular, especificamente em relação à angiogênese coroidal e à degeneração macular relacionada à idade de tipo neovascular (DMRI). O ensaio permite a avaliação das vias envolvidas na proliferação de microvasos coroidais e a análise de tratamentos farmacológicos utilizando tecidos de camundongos tanto do tipo selvagem quanto geneticamente modificados.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Angiogênese coroidal
- Degeneração macular relacionada à idade (DMRI)
- Comportamento microvascular
Antecedentes
- Importância da angiogênese coroidal em doenças oculares
- Modelos ex vivo complementando estudos in vivo
- Modelos de camundongos geneticamente modificados para insights aprimorados
Métodos Utilizados
- Ensaio de brotamento coroidal
- Uso de tecidos de camundongos de linhagens selvagens e geneticamente modificadas
- Microscopia para observar o brotamento coroidal
Resultados Principais
- O ensaio permite medidas reprodutíveis da brotação coroidal ao longo de vários dias
- A perda de FFAR4 em camundongos knockout aumentou o crescimento vascular coroidal em comparação com o tipo selvagem
- O tratamento com agonista de FFAR4 reduziu a área de brotação coroidal em camundongos knockout
Conclusões
- O estudo demonstra a eficácia do ensaio na avaliação do potencial antiangiogênico de compostos farmacológicos
- Destaca o papel de vias de sinalização específicas na neovascularização coroidal
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O ensaio de brotamento coroidal ex vivo fornece um modelo reprodutível para avaliar a proliferação microvascular coroidal, diretamente relevante para a descoberta de fármacos contra a degeneração macular relacionada à idade de tipo neovascular (DMAE). Ele permite a desvinculação mecanicista de vias angiogênicas utilizando tecidos de camundongos selvagens e modificados geneticamente, apoiando a validação de alvos e a identificação de compostos promissores em pipelines oftalmológicos. O ensaio conecta a biologia descritiva e a avaliação pré-clínica ao quantificar a dinâmica de brotamento em um sistema de explante tecidual fisiologicamente relevante.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a medição da brotação coroidal em resposta à modulação genética ou farmacológica de vias angiogênicas.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos como FFAR4 em um contexto tecidual multicelular que inclui endotélio, macrófagos, pericitos e epitélio pigmentado da retina (RPE).
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao quantificar os efeitos dependentes da dose de compostos sobre a brotação microvascular ao longo do tempo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas baseadas em imagens da área de brotamento que refletem a formação de redes microvasculares sob condições controladas.
- Valor Operacional: Utiliza o plaqueamento padronizado de explantes em BME com redução de fatores de crescimento e com cronogramas definidos de troca de meio para garantir reprodutibilidade entre experimentos.
- Escalabilidade: Compatível com o formato de placa de 24 poços e com análise semiautomatizada no ImageJ, permitindo triagem de compostos em média a alta produtividade.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a arquitetura nativa do coroide-RPE-esclera, preservando as interações célula-célula essenciais para modelar a angiogênese fisiopatológica.
- Valor Operacional: Permite a comparação direta entre tecidos selvagens e tecidos com genes eliminados (por exemplo, FFAR4) para isolar as contribuições genéticas aos fenótipos de brotamento.
- Valor Preditivo: Permite a avaliação dos efeitos de agonistas/antagonistas sobre o brotamento, fornecendo evidências pré-clínicas para a modulação de vias.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta em oftalmologia, desde a validação do alvo até a otimização do fármaco líder e os testes pré-clínicos de eficácia, especialmente para estratégias antiangiogênicas na DMAE.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre reguladores angiogênicos mediante a quantificação de alterações na brotação em resposta à inibição ou ativação de vias.
- Triagem: Fornece métricas quantitativas e reprodutíveis de brotação que permitem a classificação dos efeitos de compostos em um formato baseado em tecido.
- Análises: Oferece medições baseadas em área e resolvidas no tempo (por exemplo, do dia 3 ao dia 6) que apoiam a análise cinética das respostas microvasculares.
- Pesquisa Translacional: Utiliza explantes relevantes para a doença para modelar a neovascularização coroidal, facilitando a extrapolação para modelos in vivo de DMAE.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada e reutilizável para avaliar múltiplos compostos ou modelos genéticos em diversos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao associar perturbações genéticas ou farmacológicas a resultados quantificáveis de brotamento em um contexto de tecido nativo.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de isolamento de tecido, plaqueamento em BME, troca de meio e aquisição de imagens.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer evidências precoces, baseadas em tecido, de atividade antiangiogênica antes de testes in vivo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em dados de resposta à dose e validação genética.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em dissecação de tecidos murinos e isolamento de explantes sob condições estéreis.
- Depende do acesso ao extrato de membrana basal com redução de fatores de crescimento (BME) e à microscopia de contraste de fase.
- Necessita de fluxos de trabalho padronizados de análise de imagens (por exemplo, macro do ImageJ) para quantificação consistente da brotação.
- Deve levar em conta a variabilidade no tamanho dos explantes e na viabilidade tecidual ao interpretar as métricas de brotação.
- Limitado a tecidos murinos; diferenças entre espécies podem afetar a transposição para a biologia coroidal humana.
