Name: Um Ensaio Ex Vivo Choroid de Angiogênese Microvascular Ocular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprenda o ensaio de brotamento de coroide ex vivo para estudar angiogênese microvascular ocular e degeneração macular relacionada à idade em tecidos de camundongo. Este método permite avaliar o potencial antiangiogênico de compostos farmacológicos.

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O trabalho foi apoiado por subsídios da Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children's Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children's Hospital Ofthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship e Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; ao BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).

Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Infantil de Boston (protocolo ARCH número 19-04-3913R).
1. Preparação
<ol><li>Adicione 5 mL de Penicillin/Streptomycin (10000 U/mL) e 5 mL e 10 mL de suplementos disponíveis comercialmente a 500 mL de meio clássico completo com soro. Alíquota de 50 mL do meio inicialmente. NOTA: Não devolva nenhum meio de volta ao estoque para evitar contaminação.</li>
	<li>Coloque uma alíquota de meio clássico completo no gelo.</li>
	<li>Use 70% de etanol para limpar o microscópio de dissecação, fórceps e tesouras.</li>
	<li>Preparar dois pratos de cultura celular (10 cm), um no microscópio de dissecção, outro no gelo; colocar 10 mL de meio clássico completo em cada prato.</li>
</ol>2. Etapas experimentais(Figura 1)
<ol><li>Sacrifício C57BL/6J camundongos em torno de posta natal (P) 20 usando 75-100 mg/kg de cetamina e 7,5 -10 mg/kg de xilazina injetada intraperitoneally. Mantenha os olhos em meio clássico completo no gelo antes da dissecação.</li>
	<li>Remova o tecido conjuntivo (músculo e tecido gorduroso) e o nervo óptico no olho.</li>
	<li>Use uma micro-tesoura para cortar circunferencialmente 0,5 mm posterior ao limbus da córnea. Remova o complexo de córnea/íris, vítreo e a lente.</li>
	<li>Faça uma incisão de 1 mm perpendicular à borda de corte em direção ao nervo óptico e corte uma faixa circunferencial de 1 mm de largura. Separe as regiões centrais e periféricas do complexo. Use fórceps para descascar a retina do complexo RPE/coroid/sclera.</li>
	<li>Manter a banda coroide periférica em meio clássico completo no gelo; isolar o outro olho e repetir o processo para cortar uma segunda faixa.</li>
	<li>Corte a faixa circular em 6 ~peças quadradas iguais (~1 mm x 1 mm). NOTA: Nunca toque em nenhuma borda.</li>
	<li>Descongele o extrato de membrana basal (BME) por instrução de fabricação. Adicione 30 μL/poço de BME no centro de cada poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços. Certifique-se de que a gota de BME forma uma cúpula convexa na parte inferior da placa sem tocar nas bordas. NOTA: Descongele o BME durante a noite em uma geladeira. A BME deve estar no gelo a qualquer momento depois do descongelamento.</li>
	<li>Coloque o tecido no meio da BME. NOTA: Não achate a explanta choroide; geralmente, deixe o tecido se expandir dentro da BME. A orientação do tecido (lado escleral para cima ou para baixo) não afeta o desfecho experimental.</li>
	<li>Incubar a placa a 37 °C por 10 minutos para deixar o gel solidificar.</li>
	<li>Adicione 500 μL do meio/bem clássico completo.</li>
	<li>Mude o meio clássico a cada dois dias (500 μL). O broto choroide pode ser observado após 3 dias com um microscópio. NOTA: Para o tratamento do fator de crescimento, esfuira o tecido por 4h. Diluir um composto experimental em meio reduzido por fator de crescimento (aumento de 1:200 em vez de 1:50).</li>
</ol>3.SWIFT-Choroid método de quantificação informatizada17 (Figura 2)
NOTA: Foi utilizado um método informatizado para medir a área coberta pelo cultivo de vasos. Um plugin macro para o software ImageJ é necessário antes da quantificação (consulte Informações Suplementares para obter mais detalhes).
<ol><li>Abra a imagem choroide com ImageJ e verifique "Imagem | Digite| 8 bits" com escala cinza.</li>
	<li>Vá para "Image | Ajuste | Brilho/Contraste (Ctrl/shift/C)" e otimizar o contraste.</li>
	<li>Use a função varinha mágica para delinear e remover da imagem o tecido coroide que está presente no centro dos brotos (usando a tecla de atalho "F1")(Figura 2A,B). NOTA: Defina a taxa de tolerância da varinha mágica para 20-30%.</li>
	<li>Remova o fundo da imagem com as ferramentas de seleção gratuitas(Figura 2C). Vá para "Image | Ajuste | Limiar (Ctrl/shift/T)". Use a função limiar para definir os brotos microvasculares contra o fundo e a periferia(Figura 2D).</li>
	<li>Clique em "F2" e um resumo aparecerá. Salve uma imagem da área selecionada clicando em "Salvar". Salvo na mesma pasta da imagem original para referência futura.</li>
	<li>Após a medida de um grupo de amostras, copie o registrado para análise de dados. NOTA: Também é possível medir a área (μm²) por "Analisar | Set Scale" usando imagens com barras de escala.</li>
</ol>

<ol><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).</li>
<li>Pemp, B., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+blood+flow+in+diabetes+and+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration.</a> Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).</li>
<li>Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+response+in+retinal+homeostasis+and+inflammatory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778(2020).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyslipidemia+in+retinal+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dyslipidemia in retinal metabolic disorders.</a> EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473(2019).</li>
<li>Daruich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+macular+edema%3A+Beyond+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of macular edema: Beyond the surface.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Acting+FGF21+Inhibits+Retinal+Vascular+Leakage+in+In+Vivo+and+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188(2020).</li>
<li>Maisto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARPE-19-derived+VEGF-containing+exosomes+promote+neovascularization+in+HUVEC%3A+the+role+of+the+melanocortin+receptor+5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5.</a> Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).</li>
<li>Mazzoni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+Inhibitor+Apcdd1+Coordinates+Vascular+Remodeling+and+Barrier+Maturation+of+Retinal+Blood+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels.</a> Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+Mediates+Dietary+Omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acid+Protection+Against+Choroidal+Neovascularization+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+Oxidase+2C+Inhibition+Adds+to+omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Protection+Against+Retinal+and+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).</li>
<li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li>
<li>Bellacen, K., Lewis, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+ring+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visulaized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Aortic ring assay.</a> Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564(2009).</li>
<li>Masson, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Aortic+Ring+Assay%3A+A+New+Approach+of+the+Molecular+Genetics+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis.</a> Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).</li>
<li>Katakia, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+model+for+studying+endothelial+tip+cells%3A+Revisiting+the+classical+aortic-ring+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay.</a> Microvascular Research. 128, 103939(2020).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ex+vivo+murine+retina+angiogenesis+%28EMRA%29+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay.</a> Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).</li>
<li>Shao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+sprouting+assay%3A+an+ex+vivo+model+of+microvascular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis.</a> PLoS One. 8 (7), 69552(2013).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+fatty+acid+receptor+4+activation+protects+against+choroidal+neovascularization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice.</a> Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TWIST1+promotes+pathological+ocular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis.</a> Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+microRNA-150+is+an+intrinsic+suppressor+of+pathologic+ocular+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncEGFL7OS+regulates+human+angiogenesis+by+interacting+with+MAX+at+the+EGFL7%2FmiR-126+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus.</a> Elife. 8, 40470(2019).</li>
<li>Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+angiogenesis+of+cultured+choroidal+tissues+in+streptozotocin-diabetic+Wistar+and+spontaneously+diabetic+GK+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats.</a> Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effects+of+tetrandrine+and+related+synthetic+compounds+on+angiogenesis+in+streptozotocin-diabetic+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).</li>
<li>Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%28epsilon%29-%28carboxymethyl%29lysine+proliferated+CD34%28%2B%29+cells+from+rat+choroidal+explant+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overproduction+of+N%28epsilon%29-%28carboxymethyl%29lysine-induced+neovascularization+in+cultured+choroidal+explant+of+streptozotocin-diabetic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).</li>
<li>Bergers, G., Song, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pericytes+in+blood-vessel+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance.</a> Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).</li>
<li>Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to%3A+Phenotypic+plasticity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells.</a> British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm divulgações financeiras. O método informatizado está disponível gratuitamente para instituições acadêmicas através dos autores.

O ensaio de brotação de choroida ajuda a pesquisa em AMD neovascular9,10,18,19,20. Explantas choroides podem ser isoladas de camundongos, bem como ratos e humanos17,21. A explantação coroide inclui CES, macrófagos e pericítes17. Neste ensaio, a interação entre os CEs choroidal e...

A desregulação da angiogênese choroidal está associada à degeneração macular relacionada à idade neovascular (DM)1. O coroide é um leito microvascular presente sob o epitélio pigmento da retina (RPE). Foi demonstrado que a redução do fluxo sanguíneo no coroide está associada à progressão da AMD2. A intrincada relação entre endotélio vascular, RPE, macrófagos, pericítos e outras células é responsável pela homeostase do tecido3,4,5. Portanto, um ensaio reprodutível modelando microambiente choroidal é fundamental para o estudo da AMD neovascular.
Ensaios ex vivo angiogênese e culturas celulares endoteliais in vitro podem complementar estudos de comportamento microvascular in vivo, para testes de novas drogas e para estudos de patogênese. Células endoteliais humanas como células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs), Células Endoteliais de Veia Umbilical Humana (HUVEC), cérebro animal primário isolado ou CEs da retina são frequentemente utilizadas em estudos in vitro para pesquisa de angiogênese ocular6,7,8. Os HRMECs, em particular, têm sido amplamente utilizados como modelo de neovascularização in vitro choroidal (CNV)9, avaliando a proliferação endotelial, migração, formação tubular e vazamento vascular para avaliar as intervenções6,10. No entanto, as CEs na cultura são limitadas como modelo de CNV devido à falta de interações com outros tipos de células encontradas no coroide e porque a maioria dos CE utilizados nesses ensaios não se originam do coroide. Os ECs de choroidal de rato são difíceis de isolar e manter na cultura.
O ensaio do anel aórtico é amplamente utilizado como modelo de proliferação macro vascular. Brotos vasculares de explantes aórticos incluem CES, pericítes e macrófagos11. O ensaio do anel aórtico modela angiogênese de vaso grande bem12,13,14. No entanto, tem limitações como modelo de neovascularização choroidal, pois os anéis aórticos são um tecido macrovascular que não tem o ambiente microvascular choroidal característico, e brotos de vasos grandes podem diferir de brotos de redes capilares envolvidas na patologia microvascular. Recentemente, um grupo publicou um ensaio ex-vivo retinal15,16. Embora seja adequado para doença neovascular da retina, não é tão apropriado para a neovascularização choroidal como visto na AMD.
O ensaio de broto de choroidal utilizando rpe rato, choroide e tecido escleral explantado foi desenvolvido para melhor modelar CNV. O tecido pode ser facilmente isolado dos olhos de camundongos (ou de outras espécies)17. Este ensaio permite a avaliação reprodutível do potencial pró e anti-angiogênico dos compostos farmacológicos e a avaliação do papel das vias específicas na neovascularização choroidal utilizando tecido de camundongos geneticamente modificados e controles18. Este ensaio de broto de choroidal foi referenciado em muitas publicações subsequentes9,10,18,19,20. Aqui, demonstram-se o método envolvido no uso deste ensaio.

<table><tbody><tr><td>AnaSed (Xilazina)</td><td>AKORN</td><td>59339-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de membrana basal (BME) Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células</td><td>NEST</td><td>704001</td><td>10cm</td></tr><tr><td>Meio clássico completo com soro e sistemas celulares CultureBoost</td><td></td><td>4Z0-500</td><td></td></tr><tr><td>Álcool etílico 200 Prova</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td>uso para 70% </td></tr><tr><td>Microscópio Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ZEISS</td><td>Axio Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>10000 U/mL</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos (24 poços)</td><td>Olympus</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>VetaKet CIII (Cetamina)</td><td>AKORN</td><td>59399-114-10</td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio ex vivo choroid de angiogênese microvascular ocular

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Angiogênese choroicular patológica, uma característica marcante da degeneração macular relacionada à idade, leva à deficiência visual e cegueira. Ensaios de proliferação de células endoteliais (CE) utilizando células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs) ou CEs de retina primária isolada são amplamente utilizados em modelos in vitro para estudar angiogênese retinária. No entanto, isolar as células endoteliais da retina murina pura é tecnicamente desafiador e os CEs da retina podem ter respostas de proliferação diferentes das células endoteliais choroidais e diferentes interações celular/celular. Um ensaio altamente reprodutível ex vivo choroidal como modelo de proliferação microvascular choroidal foi desenvolvido. Este modelo inclui a interação entre vasculatura choroide (CE, macrófagos, pericílitos) e epitélio pigmento da retina (RPE). As explantas de RPE/coroid/scleral do mouse são isoladas e incubadas no extrato de membrana basal reduzida pelo fator de crescimento (BME) (dia 0). O meio é trocado a cada dois dias e o broto de coroide é quantificado no dia 6. As imagens da explanta choroide individual são tiradas com um microscópio de fase invertida e a área de broto é quantificada usando um plug-in macro semi-automatizado para o software ImageJ desenvolvido neste laboratório. Este ensaio reprodutível de broto ex vivo choroidal pode ser usado para avaliar compostos para tratamento potencial e para pesquisas de doenças microvasculares para avaliar caminhos envolvidos na proliferação de micro vasos choroidais usando tipo selvagem e tecido de camundongos geneticamente modificados.

Comparação do crescimento de brotos de coroides por dia
Dissecamos o coroide com esclera, embutido na BME e os cultuamos por 6 dias(Figura 1). Os brotos de coroide em camundongos C57BL/6J do dia 3 ao dia 6 foram examinados com um microscópio e quantificados com SWIFT-Choroid um método de quantificação semi-automatizado no ImageJ. Em um caso representativo, a área de broto choroidal (os vasos que se estendem da explanta, excluindo a própria explant...

Este protocolo apresenta ensaio de brotos de choroide, um modelo ex vivo de proliferação microvascular. Este ensaio pode ser usado para avaliar caminhos envolvidos na proliferação de micro vasos choroidais e avaliar tratamentos medicamentosos usando tipo selvagem e tecido de camundongos geneticamente modificados.

Um Ensaio Ex Vivo Choroid de Angiogênese Microvascular Ocular

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...

Este ensaio de coróide é altamente reprodutível e pertinente à pesquisa de angiogênese coroidal e degeneração macular relacionada à idade, DMRI Pode complementar estudos in vivo do comportamento microvascular. Este ensaio pode ser usado para rastrear compostos como tratamentos potenciais para DMRI neovascular ou para avaliar as vias envolvidas na Neovascularização Coroidal usando tecido de camundongo selvagem e geneticamente modificado. Para começar, adicione cinco mililitros de penicilina, estreptomicina e 10 e cinco mililitros de suplementos disponíveis comercialmente a 500 mililitros de meio clássico completo com soro e, em seguida, alíquota de 50 mililitros do meio, descongele o extrato de membrana basal ou BME durante a noite em uma geladeira a dois a oito graus Celsius.Coloque uma alíquota de meio clássico completo no gelo. Limpe o microscópio de dissecação, fórceps e tesoura com etanol a 70%. Preparar para placas de cultura de células e colocar uma no microscópio de dissecação e a outra no gelo.Em seguida, adicione 10 mililitros de meio clássico completo a cada prato. Mantenha os olhos em meio clássico completo no gelo antes da dissecação. Remova o tecido conjuntivo e o nervo óptico e, em seguida, use uma microtesoura para cortar circunferencialmente 0,5 milímetros posterior ao limbo da córnea.Remova o complexo da córnea da íris, vítreo e para o cristalino. Faça uma incisão de um milímetro perpendicular à borda cortada em direção ao nervo óptico e, para cortar uma faixa circunferencial de um milímetro de largura, separe as regiões central e periférica do complexo. Use uma pinça para descascar a retina do complexo da esclera coróide do EPR.Mantenha a banda coróide periférica em meio clássico completo no gelo. Isole o outro olho e repita o processo para cortar uma segunda faixa. Corte a faixa circular em cinco a seis pedaços quadrados aproximadamente iguais.Adicione 30 microlitros do BME descongelado no centro de cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Certifique-se de que a gota de BME forme uma cúpula convexa na parte inferior da placa sem tocar nas bordas. Coloque o tecido no meio do BME.Não alise a planta X da coróide. Deixe o tecido se expandir dentro do BME. Incube a placa a 37 graus Celsius por 10 minutos para deixar o gel solidificar e, em seguida, adicione 500 microlitros de meio clássico completo em cada poço.Mude o meio clássico a cada dois dias. O brotamento da coróide pode ser observado após três dias com um microscópio. Abra a imagem de brotamento de coróide com a imagem J e verifique a imagem, digite e oito bits com escala de cinza.Em seguida, otimize o contraste selecionando imagem, ajuste, contraste de brilho e ajustando-o. Use a função de varinha mágica para delinear e remover o tecido coróide que está presente no centro dos brotos. Remova o fundo da imagem com as ferramentas de seleção gratuitas.Em seguida, vá para a imagem, ajuste o limiar e use a função de limiar para definir os brotos microvasculares contra o fundo na periferia. Clique em F2 e um resumo aparecerá. Clique em salvar para salvar uma imagem da área selecionada na mesma pasta da imagem original para referência futura.Depois que um grupo de amostras for medido, copie os dados registrados para análise. Este protocolo foi usado para examinar e quantificar o brotamento da coróide em C 57, camundongos J pretos seis do terceiro ao sexto dia. Em um caso representativo, a área de brotação da coroide foi de 0,38, 1,47, 5,62 e 10,09 milímetros quadrados nos dias três, quatro, cinco e seis, respectivamente.Os efeitos da perda de FFAR4 na germinação vascular da coroide foram avaliados usando o ensaio de germinação da coróide em camundongos FFAR4 quatro knockout e FFAR4 do tipo selvagem. A área de brotamento em camundongos knockout para FFAR4 aumentou o crescimento vascular coroidal em comparação com o tipo selvagem FFAR4 no sexto dia. Além disso, o tratamento com um agonista micromolar FFAR4 reduziu a área de brotamento coroidal em comparação com camundongos não tratados no sexto dia.Este ensaio permite a avaliação reprodutível do potencial antiangiogênico de compostos farmacológicos e a variação do papel de vias específicas na Neovascularização Coroidal utilizando tecido de camundongos geneticamente modificados.

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Biology

Biologia

A córnea é o único que carece de tecidos vasculares. No entanto, o crescimento dos vasos sanguíneos e robusta sobrevivência pode ser induzida na córnea de potentes fatores angiogênicos. Portanto, a córnea pode fornecer-nos com uma ferramenta valiosa para estudos angiogênico. Este protocolo demonstra como executar o modelo do rato de ensaio de córnea bolso e como avaliar a angiogênese induzida por fatores angiogênicos usando este modelo.

Um modelo do rato do Ensaio de bolso Córnea para o Estudo da angiogênese

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em microesferas transportadoras modificadas incorporando pericitos para estudar o brotamento endotelial durante os estágios iniciais da angiogênese. O ensaio fornece um modelo experimental in vitro para entender os mecanismos moleculares da angiogênese e o efeito da terapêutica antiangiogenética.

Ensaio de germinação de grânulos para avaliação da angiogênese em estágio inicial: um modelo in vitro baseado em grânulos para estudar o brotamento endotelial na presença de pericitos

Este vídeo demonstra o desenvolvimento de um modelo ex vivo de brotamento coroidal para estudar a angiogênese microvascular ocular. O ensaio envolve a cultura de explantes oculares de camundongos contendo o tecido coróide ligado à esclera e ao epitélio pigmentar da retina sob condições específicas que promovem o brotamento microvascular da coroide.

Ensaio de brotamento de coróide para estudar a proliferação microvascular ocular ex vivo

A retina de murino neonatal fornece um modelo fisiológico bem caracterizado da angiogénese, que permite investigações dos papéis dos diferentes genes ou drogas que modulam a angiogénese...

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

O protocolo descreve o ensaio de microbolsa corneal conforme desenvolvido em ratinhos.

A córnea microbolsa Ensaio: Um modelo de angiogênese no mouse Eye

A angiogênese envolve interações multicelulares e multissistêmicas que precisam ser investigadas em um ambiente fisiologicamente relevante. O objetivo deste estudo é demonstrar a capacidade do modelo de cultura de mesentério de rato em fazer comparações de lapso de tempo de redes microvasculares intactas durante a angiogênese.

A<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Método for Imaging Time-Lapse of cultivadas Rato Mesentéricas microvasculares Networks

Este trabalho apresenta um procedimento abrangente para avaliar em vitro se vasculogênese clássico existe em hemangioblastomas (HBs) e seu papel na HBs. Os resultados destacam a complexidade do HB-neovascularização e sugerem que esta forma comum de angiogênese é apenas um mecanismo complementar no HB-neovascularização.

Um procedimento abrangente para avaliar o desempenho In Vitro da neovascularização de Hemangioblastoma putativo usando o Spheroid brotando do ensaio

Este método descreve a cultura das células endotélias derivadas do iPSC como 40 microvasos 3D perfundidos em uma plataforma microfluídica padronizada. Esta plataforma permite o estudo do sprouting angiogenic gradiente-conduzido em 3D, incluindo a anastomose e a estabilização dos sprouts angiogenic em uma maneira escalável e high-throughput.

Ensaio padronizado e escalável para estudar perfundido 3D Angiogênico Sprouting de células endotelias derivadas do iPSC in vitro

Este ensaio utiliza células-tronco embrionárias de camundongos diferenciadas em corpos embrionários cultivadas em gel de colágeno 3D para analisar os processos biológicos que controlam a angiogênese brotada in vitro. A técnica pode ser aplicada para testar drogas, modelar doenças e estudar genes específicos no contexto de deleções embrionariamente letais.

In vitro Ensaio Tridimensional de Angiogênese Utilizando Células-Tronco Embrionárias de Camundongos para Modelagem de Doenças Vasculares e Testes de Fármacos

Este estudo apresenta o ensaio de migração bidimensional (2D) e o ensaio tridimensional (3D) de brotamento esferóide, juntamente com seus respectivos métodos de análise a jusante, incluindo extração de RNA e imunocitoquímica, como ensaios adequados para estudar a angiogênese in vitro.

Investigando a angiogênese em nível funcional e molecular, aproveitando o ensaio de migração de feridas por arranhões e o ensaio de brotamento de esferóides

A angiogênese germinativa, fundamental para o desenvolvimento e a doença, envolve processos moleculares e mecânicos complexos. Apresentamos um modelo ex vivo 2.5D versátil que analisa o brotamento celular das artérias carótidas suínas, revelando a angiogênese dependente da rigidez e a mecânica celular líder-seguidora distinta. Este modelo auxilia no avanço de estratégias de engenharia de tecidos e abordagens de terapia do câncer.

Modelo 2.5D para caracterização mecânica ex vivo da angiogênese germinada em tecido vivo

Aprenda o ensaio de brotamento de coroide ex vivo para estudar angiogênese microvascular ocular e degeneração macular relacionada à idade em tecidos de camundongo. Este método permite avaliar o potencial antiangiogênico de compostos farmacológicos.

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