Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

O SM FISH quantifica com precisão os níveis e a localização de RNase específica. Este método é particularmente útil para analisar célula a célula e alelo por alelo variação no RNA. A transcrição gênica é um processo essencial na biologia celular, o SM FISH permite a investigação do conteúdo de RNA em resposta a estímulos externos no nível de uma única célula e fornece informações espaciais.

Após o tratamento com agonista do receptor de estrogênio, lave as células com PBS estéril frio com cálcio e magnésio e fixe as células com 500 microlitros de tampão de fixação por 30 minutos no gelo. No final da incubação, lave as células duas vezes com PBS estéril frio com cálcio e magnésio por três minutos antes de adicionar 500 microlitros de etanol a 70% em cada poço. Em seguida, sele a placa de 24 poços com um filme plástico de parafina e coloque a placa em um rotador a quatro graus Celsius por pelo menos quatro e até 16 horas.

Para hibridização de RNA FISH, no final da incubação, lave as células uma vez com 500 microlitros de tampão SSC 2X suplementado com 10% de formamida por cinco minutos em temperatura ambiente em um rotador. Durante a incubação, coloque um pedaço de filme plástico de parafina com o lado não exposto para cima em uma placa de Petri de vidro limpa com um descontaminante de superfície de RNA e coloque toalhas de papel estéreis saturadas de água ao longo das bordas da placa. No final da incubação, coloque gotículas de 30 microlitros uniformemente espaçadas de intron GREB1 recém-preparado e tampão de sonda de éxon GREB1 no lado limpo do filme plástico de parafina e use uma pinça estéril para colocar suavemente uma lamínula de células com o lado da célula voltado para baixo em cada gota sem bolhas.

Depois de selar o prato com filme plástico de parafina, cubra o prato com papel alumínio e incube o prato durante a noite a 37 graus Celsius em uma superfície plana e não rotativa. Na manhã seguinte, use uma pinça para retornar as lamínulas para a placa de 24 poços com o lado da célula para cima por duas lavagens de 15 minutos em 500 microlitros de tampão SSC 2X fresco suplementado com 10% de formamida por lavagem a 37 graus Celsius em um rotador aquecido. Após a segunda lavagem, contra-corar o DNA com um micrograma por mililitro de DAPI em tampão SSC 2X por 10 minutos à temperatura ambiente em um rotador, seguido de uma lavagem de cinco minutos em tampão SSC 2X à temperatura ambiente.

Use uma toalha de papel para remover o excesso de tampão SSC 2X e enxágue as amostras em água sem nuclease para eliminar o excesso de sais. Em seguida, use um meio de montagem não endurecido para montar as lamínulas nas lâminas de vidro e selar as lamínulas com esmalte transparente. Para imagens de amostra, carregue a lâmina com a maior intensidade esperada em uma platina de microscópio de epifluorescência de campo amplo equipada com uma objetiva de óleo de 60 ou 100 vezes em uma câmera sCOMS e coloque uma gota de óleo de imersão na objetiva.

Para aquisição de Zstack, concentre-se na amostra no canal DAPI e selecione a parte superior e inferior do Zstack nas distâncias nas quais os núcleos corados com DAPI ficam fora de foco. Use o slide para otimizar a quantidade de iluminação da fonte de luz e os tempos de exposição para cada canal e adquira imagens de todos os slides em condições que evitem o branqueamento da foto e/ou a saturação de pixels da câmera. Após a aquisição, use 10 ciclos de um algoritmo restaurador agressivo para desconvolver as imagens e salvar todas as imagens de projeção de acordo com a profundidade de bits da câmera usada.

Para análise de imagem, primeiro baixe o Jupiter Notebook do GitHub e instale o Python Anaconda Distribution versão 3.6 ou superior. Abra o prompt do Anaconda e insira o comando de instalação para instalar o SimpleITK para Anaconda. Abra o Anaconda Navigator e inicie o Jupiter Notebook.

Um navegador da Web será aberto mostrando diretórios e arquivos. Navegue pelas estruturas de diretório para acessar o diretório que contém o Jupiter Notebook baixado do GitHub. Em seguida, abra o bloco de anotações e pressione Shift e Enter para executar cada célula.

Neste experimento representativo, as células de câncer de mama aderentes foram tratadas com um agonista do receptor de estrogênio, ou veículo, por 24 horas. Conjuntos de sondas espectralmente separados contra sequências intrônicas e exônicas de GREB1 permitiram a visualização e quantificação simultâneas de mRNA nascente e maduro. É importante ressaltar que o número de alelos transcricionalmente ativos em cada célula que demonstrou fazer parte do curso do tempo de resposta ao estrogênio pode ser marcado.

Contando os pontos sobrepostos de íntrons e éxons, as células tratadas com E2 foram determinadas como tendo uma fração quatro vezes maior de células que exibem dois ou mais alelos GREB1 ativos em comparação com as células tratadas com veículo. Como os íntrons são emendados do mRNA nascente para produzir mRNA maduro que consiste apenas em sequências de éxons, o número de mRNA maduro por célula pode ser contado quantificando o número de manchas verdes. A plotagem desses dados permite que a mudança na distribuição da célula de mRNA GREB1 madura e a mudança na dobra agregada na população de células após o tratamento com E2 sejam observadas.

O C-FISH permite investigar várias espécies de RNA sequencialmente, o MERFISH é uma técnica de código de barras para aumentar massivamente a multiplexação e o iFISH é usado para estudar simultaneamente RNA e proteínas.