Detecção quantitativa de sers de ácido úrico através da formação de nanojunções plasmônicas precisas dentro de Agregados de Nanopartículas de Ouro e Cucurbit[n]uril

Este protocolo oferece um método versátil para detectar e quantificar o ácido úrico com alta sensibilidade. Portanto, é um protocolo para aplicações diagnósticas e clínicas. Este protocolo pode quantificar rapidamente biomarcadores em uma matriz complexa, como fluidos corporais.

Essa técnica pode ser potencialmente estendida para diagnosticar doenças que usam ácido úrico como biomarcador, como gota, hipertensão e doenças cardiovasculares. Também pode ser usado para detectar e quantificar outras substâncias perigosas para monitoramento ambiental. Ao tentar o protocolo pela primeira vez, os pesquisadores podem ter dificuldade em formar agregados estáveis de CB7 e nanopartículas de ouro.

Recomenda-se a mistura de nanopartículas de ouro em soluções CB7 usando sonicação, pois outras técnicas podem afetar a cinética de agregação. Um vídeo mostrando as etapas críticas da adição da mistura CB7 pode aumentar a chance de sucesso e reprodutibilidade para os pesquisadores quando novos no sistema. Para a síntese de sementes de ouro, dissolva 98,5 miligramas de áurico em 10 mililitros de água deionizada em um frasco de vidro para obter uma solução de cloreto áurico de 25 milimolares e 64,5 miligramas de citrato de sódio em pó em 500 microlitros de água deionizada em um frasco de vidro.

Em seguida, diluir um mililitro da solução de cloreto áurico com 99 mililitros de água em um frasco de 250 mililitros com tampa azul para obter uma solução de cloreto áurico 0,25 milimolar e adicionar 99,5 mililitros da solução de cloreto áurico 0,25 milimolar a um frasco de fundo redondo de três gargalos de 250 mililitros equipado com um condensador. Em seguida, aqueça a solução a 90 graus Celsius sob agitação vigorosa por 15 minutos antes de injetar 500 microlitros da solução de citrato de sódio no frasco, continuando a mexer até que a solução fique vermelho rubi. Para iniciar o crescimento semeado das nanopartículas de ouro, transfira 25 mililitros da solução de semente de ouro para um tubo de 50 mililitros e resfrie a solução a 70 graus em um ThermoMixer.

Enquanto a solução está esfriando, encha uma seringa descartável Luer lock de três mililitros com 2,5 mililitros de solução de cloreto áurico 25 milimolar e encha outra seringa descartável Luer lock de três milímetros com 2,5 mililitros de solução de citrato de sódio 60 milimolar. Coloque as seringas em bombas de seringa e use adaptadores Luer-to-MicroTight para conectar tubos PEEK de diâmetro interno de 150 micromolares às seringas. Insira a tubulação no tubo da centrífuga contendo a solução de semente de ouro resfriada no ThermoMixer e ajuste ambas as bombas de seringa para dispensar 167.5 microlitros de solução em 20 minutos.

Defina a velocidade de rotação do ThermoMixer para 600 rotações por minuto e pressione Start na bomba de seringa contendo a solução de cloreto áurico 25 milimolar. Após dois minutos, pressione Start na bomba de seringa contendo a solução de citrato de sódio 60 milimolar. Após 30 minutos, remova uma alíquota da solução de nanopartículas de ouro para análise.

Para preparar uma solução de CB7 0,4 milimolar, adicione 4,65 miligramas de CB7 a um frasco de vidro de 15 mililitros e 10 mililitros de água ao frasco. Depois de tampar bem, sonicar o frasco para injetáveis à temperatura ambiente até que o sólido CB7 esteja completamente dissolvido. Para preparar uma solução de ácido úrico 0,4 milimolar, adicione 2,69 miligramas de ácido úrico a um tubo de centrífuga de 50 mililitros e adicione 40 mililitros de água ao tubo.

Depois de tampar bem, gire a mistura em um ThermoMixer ajustado para 70 graus Celsius e 800 rotações por minuto por duas horas. Quando a solução esfriar à temperatura ambiente, diluir um mililitro da solução de ácido úrico 0,4 milimolar com nove mililitros de água em um frasco de vidro de 15 mililitros para obter uma solução de ácido úrico 0,04 milimolar. Depois de tampar bem, sonicar o frasco para injetáveis durante 30 segundos.

Para preparar os complexos CB7-ácido úrico, adicione 750 microlitros da solução CB7 0,4 milimolar e 750 microlitros da solução de ácido úrico 0,4 milimolar a um tubo de 1,5 mililitro e sonice a mistura por 30 segundos. Em seguida, segure o tubo em temperatura ambiente por 30 minutos para garantir a formação dos complexos hospedeiro-hóspede. Clique no ícone dos assistentes de aplicação de espectroscopia no software do sistema Raman e selecione Raman.

Inicie uma nova aquisição e defina o tempo de integração para 30 segundos, as varreduras para a média para cinco e o vagão para zero. Em seguida, armazene o espectro de fundo e insira o comprimento de onda do laser. Para a formação do substrato SERS, adicione 900 microlitros da solução de nanopartículas de ouro de 40 nanômetros e 100 microlitros de solução pré-formada de complexo de ácido CB7-úrico a um tubo de 1,5 mililitro e sonice até que a solução mude de vermelho rubi para roxo.

Transfira a solução da amostra para uma cubeta semimicro e coloque a cubeta no suporte de amostra Raman. Feche a tampa e inicie a medição. Em seguida, defina o salvamento automático para registrar cinco espectros SERS consecutivos.

Os espectros ultravioleta visível para as nanopartículas de ouro sintetizadas mostram uma mudança dos picos de ressonância plasmônica de superfície localizada de 521 para 529 nanômetros após 10 etapas de crescimento, enquanto os dados dinâmicos de espalhamento de luz mostram uma distribuição de tamanho estreita à medida que o tamanho das nanopartículas aumenta de 25,9 para 42,8 nanômetros. Os tamanhos médios de G0, G5 e G10 medidos a partir de imagens de elétrons de transmissão são de aproximadamente 20, 33 e 40 nanômetros, respectivamente. Nessas análises representativas, complexos hospedeiro-hóspede de CB7 e ácido úrico foram formados com CB7 vazio mediando a formação de nanojunções plasmônicas precisas dentro dos nanoagregados CB7 de nanopartículas de ouro, conforme suportado pelos sinais característicos de ácido úrico no espectro SERS.

Por outro lado, nenhum sinal SERS de ácido úrico pode ser observado na ausência de CB7, ilustrando o papel fundamental do CB7 no desencadeamento da agregação de nanopartículas de ouro. A alta sensibilidade do esquema de detecção apresentado neste protocolo é demonstrada pela observação de sinais SERS claros desde os picos de ácido úrico em 640 e 1130 centímetros recíprocos até o limite de detecção de 0,2 micromolar. Além disso, correlações muito fortes entre a intensidade de SERS e as concentrações logarítmicas de ácido úrico foram obtidas por lei de potência para ambos os picos com regiões lineares encontradas na faixa de 0,2 a 2 micromolares.

O ácido úrico tem baixa solubilidade em água, por isso é necessário garantir que o pó de ácido úrico tenha um efeito macio antes da próxima etapa. A análise avançada de dados pode ser realizada, possibilitando quantificar múltiplos biomarcadores presentes na matriz.