Name: Transplante Sub-Retiniano de Tecido Retiniano Derivado de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Modelo Animal de Grande Porte Felino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprenda a técnica cirúrgica para transplante sub-retiniano de organoides retinianos derivados de células-tronco humanas em modelo felino. Este método permite a entrega direta de tecido ao espaço sub-retiniano para desenvolvimento de terapia celular em doenças degenerativas da retina.

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Este trabalho foi financiado pelo NEI Fast-track SBIR grant R44-EY027654-01A1 e SBIR grant 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones é um co-PI). Os autores gostariam de agradecer à Sra. Janice Querubin (MSU RATTS) por sua ajuda com a anestesia e cuidados gerais para os animais incluídos neste estudo, bem como ajuda com o ambiente cirúrgico e preparação/esterilização dos instrumentos. Os autores gostariam de agradecer à Dra. Paige Winkler pela ajuda em receber os organoides e colocá-los em meios no dia anterior ao implante e pela ajuda no dia do implante. Os autores também são gratos ao Sr. Randy Garchar (LCTX) pelo envio diligente de organoides da retina, montagem do remetente e download de registros de temperatura e estresse G após cada remessa. Este trabalho foi realizado enquanto o autor Igor Nasonkin era empregado pela Biotime (agora Lineage).

Ratnesh K. Singh, Ph.D., François Binette, Ph.D., e Igor O. Nasonkin Ph.D. são funcionários da Lineage Cell Therapeutics, Inc. Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

A implantação de tecido retiniano derivado de hPSC (organoides da retina) no espaço sub-retiniano é uma abordagem experimental promissora para restaurar a visão para doenças degenerativas retinianas em estágio avançado causadas por morte celular PR (cegueira profunda ou terminal). A abordagem apresentada baseia-se em uma terapia experimental previamente desenvolvida e testada com sucesso, baseada no enxerto sub-retiniano de um pedaço de tecido retiniano fetal humano23,24,25<sup class="x...

Milhões de pessoas em todo o mundo são afetadas pela degeneração retiniana (DR) com consequente deficiência visual ou cegueira associada à perda dos fotorreceptores (RPs) sensíveis à luz. A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma das principais causas de cegueira resultante de uma combinação de fatores de risco genéticos e fatores ambientais/estilo de vida. Além disso, mais de 200 genes e loci causaram DR hereditária (IRD)1. A retinose pigmentar (PR), a mais comum DIR, é geneticamente heterogênea, com mais de 3.000 mutações genéticas em aproximadamente 70 genes relatadas2,3,4. A Amaurose Congênita de Leber (LAC), que causa cegueira na infância, também é geneticamente heterogênea5,6. A terapia de aumento gênico foi desenvolvida e está em ensaios clínicos para o tratamento de um pequeno número de IRDs 3,7. No entanto, uma terapia separada deve ser desenvolvida para o tratamento de cada forma genética distinta de IRD e, assim, tratar apenas um pequeno subgrupo de pacientes. Além disso, o aumento gênico depende da presença de uma população de fotorreceptores resgatáveis e, portanto, não é aplicável para degeneração avançada.
Há, portanto, uma necessidade clínica urgente e ainda não atendida para o desenvolvimento de terapias que abordem e tratem as DRs avançadas e a cegueira profunda a terminal. Nas últimas 2 décadas implantes neuroprotéticos foram desenvolvidos e testados em modelos animais de grande porte, como o gato, antes do uso humano 8,9,10,11,12,13,14. Da mesma forma, nos últimos 20 anos, terapias de reposição retiniana utilizando lâminas de retina de mamíferos embrionárias ou mesmo maduras enxertadas sub-retinicamente foram desenvolvidas 15,16,17,18,19,20,21,22 e até testadas com sucesso em pacientes com DR 23,24,25. Ambas as abordagens utilizam a ideia de introduzir novos sensores (fotodiodos fotovoltaicos de silício, no caso de dispositivos neuroprotéticos26,27, e fotorreceptores saudáveis livres de mutação organizados em folhas, no caso de implantação de folhas de retina) em retinas com RPs degenerados. Estudos recentes têm investigado o uso de abordagens baseadas em células-tronco, como o transplante de progenitores retinianos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)28,29, fotorreceptores hPSC 30 e organoides retinianos hPSC31,32,33. Os organoides da retina permitem a formação de tecido retiniano em uma placa e derivação de folhas fotorreceptoras com milhares de RPs livres de mutação, que se assemelham à camada fotorreceptora da retina fetal humana em desenvolvimento 34,35,36,37,38,39,40 . O transplante de tecido retiniano derivado de hPSC (organoides) para o espaço sub-retiniano de pacientes com DR é uma das novas e promissoras abordagens de terapia celular investigativa, sendo perseguida por várias equipes31,32,41,42. Em comparação com o transplante da suspensão celular (de fotorreceptores jovens ou progenitores da retina), folhas transplantadas de fotorreceptores fetais demonstraram resultar em melhora da visão em ensaios clínicos23,24.
O protocolo aqui apresentado descreve, em detalhes, um procedimento de transplante para liberação sub-retiniana de organoides da retina inteira (em vez de bordas organoides33,41) como uma maneira potencialmente melhor de introduzir lâminas retinianas intactas com RPs, para aumentar a sobrevida do enxerto e melhorar a preservação do lençol. Embora procedimentos para introdução de um pedaço plano de retina humana e também de placas de EPR tenham sido desenvolvidos43,44,45, o transplante de enxertos 3D maiores ainda não foi investigado. Os organoides da retina derivados de células-tronco fornecem uma fonte inesgotável de folhas fotorreceptoras para o desenvolvimento de tecnologias de restauração da visão, são livres de restrições éticas e são considerados uma excelente fonte de tecido retiniano humano para terapias focadas no tratamento da DR avançada e cegueira terminal46. O desenvolvimento de métodos cirúrgicos para implante sub-retiniano preciso de organoides da retina com mínima lesão do nicho retiniano do hospedeiro (retina neural, epitélio pigmentado da retina e vasculatura retiniana e coroidal) é um dos passos críticos para o avanço dessa terapia para aplicaçõesclínicas31,32. Modelos animais de grande porte, como gatos, cães, porcos e macacos, têm se mostrado bons modelos para investigar métodos de parto cirúrgico, bem como para demonstrar a segurança de lâminas de tecido implantadas (células do epitélio pigmentado da retina (EPR)) e investigar o uso de organoides 41,44,45,47,48,49,50 . O olho do grande animal tem tamanho de globo semelhante ao humano, bem como anatomia semelhante, incluindo a presença de uma região de alta densidade de fotorreceptores, incluindo cones (a área central), assemelhando-se à mácula humana 6,51,52.
Neste manuscrito, é descrita uma técnica para a implantação de tecido retiniano derivado de hPSC (organoides) no espaço sub-retiniano de modelos de animais grandes felinos (gatos selvagens e CrxRdy/+) que, juntamente com resultados promissores de eficácia32,53, constrói uma base para o desenvolvimento posterior dessa terapia experimental em direção a aplicações clínicas no tratamento de condições de DR.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; filtro de seringa de poros m com membrana PES</td><td>Cameo</td><td>NA</td><td>pode ser encontrado através de vários fornecedores</td></tr><tr><td>Injetor sub-retiniano 23G com cânula extensível de 41 G</td><td>DORC</td><td>1270.EXT</td><td></td></tr><tr><td>250 &micro; L hamilton seringa de bloqueio luer à prova de gás</td><td>Hamilton</td><td>NA</td><td>pode ser encontrado através de vários fornecedores</td></tr><tr><td>6-0 Sutura de seda</td><td>Ethicon</td><td>707G</td><td></td></tr><tr><td>6-0 / 7-0 sutura de poliglactina</td><td>Ethicon</td><td>J570G</td><td></td></tr><tr><td>Maleato de acepromazina 500mg / 5mL (Aceproject)</td> <td>Henry Schein Animal Health</td><td>NA</td><td>pode ser encontrado através de vários fornecedores</td></tr><tr><td>Buprenorfina 0,3 mg / mL</td><td>Par Farmacêutica</td><td>NA</td><td>pode ser encontrada através de vários fornecedores</td></tr><tr><td>cSLO + SD-OCT</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>Spectralis HRA+ OCT</td><td></td></tr><tr><td>Ciclosporina</td><td>Novartis</td><td>NA</td><td>pode ser encontrada através de vários fornecedores</td></tr><tr><td>Dexametasona 2mg/mL (Azium)</td><td>Vetone</td><td>NA</td><td>pode ser encontrada através de vários fornecedores</td></tr><tr><td>Doxiciclina 25mg/5mL</td><td>Cipla</td><td>NA</td><td>pode ser encontrado através de vários fornecedores</td></tr><tr><td>Solução Fatal Plus (solução de pentobarbital)</td><td>Vortech</td><td>NA</td><td>pode ser encontrado através de vários fornecedores</td></tr><tr><td>Gentamicina 20mg/2mL</td><td>Hospira</td><td>NA</td><td>pode ser encontrado através de vários fornecedores</td></tr><tr><td>Capilar de vidro (Thin-Wall, Single-Barrel, Borosilicato padrão (Schott Duran) Tubo de vidro</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150-4</td><td></td></tr><tr><td>Actetato de metilprednisolona 40 mg/mL</td><td>Pfizer</td><td>NA</td><td>pode ser encontrado através de vários fornecedores</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>OCT meio (Tissue-Tek O.C.T. Compound)</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Olympic Vac-Pac Tamanho 23</td><td>Natus</td><td>NA</td><td>pode ser encontrado através de vários fornecedores</td></tr><tr><td>Solução de paraformaldeído 16%</td><td>EMS</td><td>15719</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de fenilefrina 10% Solução oftálmica</td><td>Akorn</td><td>NA</td><td>pode ser encontrado através de vários fornecedores</td></tr><tr><td>Prednisolona 15mg/5mL</td><td>Akorn</td><td>NA</td><td>pode ser encontrado através de vários fornecedores</td></tr><tr><td>Propofol 500mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28)</td><td>Zoetis</td><td>NA</td><td>pode ser encontrado através de vários fornecedores</td></tr><tr><td>RetCam II câmera de fundo de olho de vídeo</td><td>Clarity Medical Systems</td><td>NA</td><td>pode ser encontrado através de vários fornecedores</td></tr><tr><td>Triancinolona 400mg/10 mL (Kenalog-40)</td><td>Bristol -Myers Squibb Company</td><td>NA</td><td>pode ser encontrado através de vários fornecedores</td></tr> Solução <tr><td>oftálmica de tropicamida a 1%</td><td>Akorn</td><td>NA</td><td>pode ser encontrada através de vários fornecedores</td></tr><tr><td>Vitrectomia 23G porta</td><td>Alcon</td><td>Accurus sistemas</td><td></td>Máquina</tr> de <tr><td>vitrectomia</td><td>Alcon</td><td>Accurus</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura vertical vítreo-retiniana de 80 graus com cabo de aperto</td><td>Frimen</td><td>FT170206T</td><td></td></tr></tbody></table>

transplante sub-retiniano de tecido retiniano derivado de células-tronco embrionárias humanas em modelo animal de grande porte felino

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Condições degenerativas retinianas (DR) associadas à perda de fotorreceptores, como degeneração macular relacionada à idade (DMRI), retinose pigmentar (RP) e amaurose congênita de Leber (LCA), causam perda progressiva e debilitante da visão. Há uma necessidade não atendida de terapias que possam restaurar a visão uma vez que os fotorreceptores tenham sido perdidos. O transplante de tecido da retina derivado de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) (organoides) no espaço sub-retiniano de um olho com DR avançada traz folhas de tecido da retina com milhares de fotorreceptores saudáveis livres de mutação e tem um potencial para tratar a maioria/todas as doenças cegantes associadas à degeneração de fotorreceptores com um protocolo aprovado. O transplante de tecido retiniano fetal para o espaço sub-retiniano de modelos animais e pessoas com DR avançada foi desenvolvido com sucesso, mas não pode ser usado como terapia de rotina devido a preocupações éticas e suprimento limitado de tecidos. Modelos animais de degeneração retiniana hereditária de grandes olhos (IRD) são valiosos para o desenvolvimento de terapias de restauração da visão utilizando abordagens cirúrgicas avançadas para transplantar células/tecidos da retina para o espaço sub-retiniano. As semelhanças no tamanho do globo e na distribuição dos fotorreceptores (por exemplo, presença de área central da região semelhante à mácula) e a disponibilidade de modelos de IRD recapitulando de perto o IRD humano facilitariam a rápida tradução de uma terapia promissora para a clínica. Apresenta-se aqui uma técnica cirúrgica de transplante de tecido retiniano derivado de hPSC para o espaço sub-retiniano de um modelo animal de grande porte, permitindo avaliar esta abordagem promissora em modelos animais.

Este procedimento permite a implantação bem-sucedida e reprodutível de organoides da retina derivados de hPSC no espaço sub-retiniano de um modelo animal de olho grande (demonstrado aqui usando 2 exemplos: gatos selvagens com fotorreceptores (RPs) saudáveis e gatos CrxRdy/+ com RPs e retina degeneradas). Usando as etapas indicadas na Figura 1 , prepare e carregue os organoides da retina derivados da hPSC na cânula de vidro borossilicato do dispositivo de injeção ...

Apresentamos aqui uma técnica cirúrgica para transplante de tecido retiniano derivado de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) no espaço sub-retiniano de um modelo animal de grande porte.

Transplante Sub-Retiniano de Tecido Retiniano Derivado de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Modelo Animal de Grande Porte Felino

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

O protocolo atual mostra em detalhes a liberação sub-retiniana de todos os organoides da retina em um modelo animal de grande porte, com o objetivo de desenvolver abordagens de terapia celular para degeneração retiniana. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a entrega de organoides diretamente para o tecido alvo, a retina. A técnica visa tratar condições degenerativas retinianas cegantes avançadas, como degeneração macular relacionada à idade, retinose pigmentar ou amaurose congênita de Leber.Quem demonstrará o procedimento será o Dr. Peterson Jones. Para o implante sub-retiniano dos organoides, use a tesoura de tenotomia Stevens para realizar uma cantotomia lateral de 0,5 a 1 centímetro em um gato anestesiado de jejum noturno de quatro meses de idade e coloque um espéculo de pálpebra de Barraquer de tamanho adequado na incisão para manter as pálpebras abertas com um assistente cirúrgico irrigando regularmente a córnea com BSS durante todo o procedimento. Use pinça de amarração corneana de Castroviejo 0,5 e um pequeno hemostático de mosquito para segurar suavemente a conjuntiva bulbar próxima ao limbo.Coloque duas suturas de seda 6-0 na conjuntiva imediatamente adjacente ao limbo nas posições 4 e 8 horas para segurar o olho no olhar primário e retrair a terceira pálpebra. Aperte as extremidades das suturas com pequenos hemostáticos de mosquito para facilitar sua manipulação e coloque outra sutura na posição das 12 horas no limbo parcialmente através da espessura do limbo, tomando cuidado para não penetrar no olho. Amarre frouxamente a sutura, cortando a extremidade curta, e coloque uma sutura de permanência na conjuntiva imediatamente adjacente ao limbo na posição das 4 horas para segurar o olho e o olhar primário.Refletir a conjuntiva bulbar entre 10 e 2 horas, e usar tesoura de tenotomia para incisar a conjuntiva a dois a três milímetros do limbo. Neutralizar a conjuntiva e limpar a cápsula de Tenon para expor a esclera nos locais de duas e 10 horas do porto de vitrectomia a três a cinco milímetros do limbo. Use paquímetros para identificar os locais de esclerotomia, evitando os grandes vasos esclerais que podem ser proeminentes no gato.Planejando uma região de três milímetros no orifício de instrumento das 10 horas para um cirurgião destro, pré-colocar pontos de padrão cruzado de poliglactina 6-0 ou 7-0 sem amarrar nos locais das esclerotomias propostas. Uma vez que as suturas estejam no lugar, peça ao assistente que segure as suturas de 12 horas para ajudar a manter o globo na posição e use pinça de Castroviejo 0,12 milímetro para segurar o tecido próximo ao local da esclerotomia. Usa um trocarte para introduzir uma porta de vitrectomia de calibre 23 através da esclera nas posições de 2 e 10 horas inclinada em direção ao nervo óptico para evitar o contato com a lente, e usa pinças de amarração para empurrar suavemente a porta de irrigação para determinar se as pontas podem ser visualizadas dentro do vítreo.Peça ao assistente que coloque uma lente de vitrectomia irrigadora Machemer na córnea para permitir a visualização do segmento posterior do olho, e um cortador de sonda de vitrectomia de calibre 23 através da porta do instrumento para realizar uma vitrectomia parcial por núcleo. Em seguida, introduza a agulha de uma seringa de um mililitro contendo um mililitro de solução de triancinolona na porta do instrumento e injete de 250 a 500 microlitros da suspensão de cristal. Quando a solução tiver sido entregue, avance a sonda de vitrectomia através da porta do instrumento para perto da cabeça do nervo óptico com a porta voltada para longe da superfície da retina.Use alto vácuo para ajudar a desprender a face vítrea da retina, insira o injetor através da porta do instrumento em direção à superfície da retina e extruda a ponta da cânula. Pressione suavemente a ponta da superfície da retina e peça ao assistente que dê um leve empurrão rápido no êmbolo da seringa para iniciar o descolamento de retina, reduzindo a pressão de injeção para permitir um aumento lento do descolamento de retina até que o tamanho desejado seja alcançado. Use uma cânula de calibre 41 do injetor para aumentar ligeiramente o descolamento até que a tesoura de retina possa ser introduzida e remova a porta escleral das 10 horas.Em seguida, use uma faca de fenda reta de 2.850 milímetros orientada em direção ao nervo óptico para evitar tocar a lente para ampliar a esclerotomia neste local. Faça a retinotomia na bolha longe do nervo óptico para evitar danificar as fibras nervosas da retina originárias da região transplantada e evite cortar os principais vasos da retina para reduzir o risco de hemorragia. Para implantar os organoides, insira um capilar de vidro carregado de organoides através da esclerotomia alargada em direção ao local da retinotomia e use a ponta do capilar para abrir levemente a retinotomia para permitir o acesso à abertura da bolsa sub-retiniana.Peça ao assistente que pressione lentamente o êmbolo do injetor novamente para injetar os organoides na bolsa sub-retiniana. A BSS deve proceder organoides, os órgãos, e liberar a retinotomia aberta. Quando todos os organoides tiverem sido entregues, deixe o capilar de vidro no lugar por alguns segundos antes de remover lentamente o capilar do olho, tomando cuidado para evitar qualquer liberação repentina de líquido.Quando o capilar tiver sido removido, fechar a esclerotomia com a sutura pré-colocada em padrão cruzado. Peça ao assistente que retire a porta de infusão, amarre rapidamente a sutura da esclerotomia e feche a peritomia com as suturas de poliglactina em um padrão contínuo simples. Fechar a cantotomia lateral com fio de poliglactina 6-0 e suturas cutâneas de figura oito para realizar o canto lateral e utilizar suturas simples de pele interrompida para fechar o restante da ferida.Em seguida, administrar o coquetel pós-cirúrgico apropriado de esteroides e antibióticos. A carga organoide retiniana derivada de células-tronco pluripotentes humanas pode ser confirmada dentro da cânula de vidro do dispositivo de injeção e durante a cirurgia por visualização direta. A presença dos organoides no espaço sub-retiniano pode ser confirmada no pós-operatório por exame oftalmológico e fundoscopia.Antes da eutanásia, a oftalmoscopia confocal a laser de varredura e a tomografia de coerência óptica de domínio espectral também podem ser realizadas para avaliar a posição dos organoides. Essas técnicas podem ser usadas para demonstrar a persistência de organoides da retina no espaço sub-retiniano entre a retina neural e o epitélio pigmentado da retina do olho receptor. Análises histológicas e imuno-histoquímicas podem ser usadas para ilustrar a sobrevivência dos gráficos xenogênicos no espaço sub-retiniano de um grande olho em um animal imunossuprimido.Somente aqueles especializados em cirurgia vitreorretiniana, como oftalmologistas veterinários treinados ou cirurgiões vitreorretinianos familiarizados com as diferenças de espécie no olho do gato em comparação com o olho humano devem realizar este procedimento. A técnica apresentada neste vídeo deve ser aplicável a outros modelos animais de grande porte que são utilizados para traduzir técnicas cirúrgicas vitreorretinianas para as clínicas.

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