Name: Otimização do Crescimento de Cristal para Cristalização Macromolecular de Nêutrons (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Aprenda a otimizar o crescimento de cristais de macromoléculas usando o sistema automatizado OptiCrys com cristalização por diálise controlada por temperatura. Este método avança a biologia estrutural.

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A MBS reconhece o suporte do LABEX VALO GRAL no âmbito do contrato 2015. NJ reconhece o Programa Internacional de Pesquisa de Doutorado (Irtelis) do CEA para a Bolsa de Doutorado. Os autores reconhecem o financiamento do Programa de Pesquisa e Inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção de Marie Skłodowska-Curie número 722687. Os autores também são gratos ao Dr. Esko Oksanen (ESS, Lund) e ao Dr. Jean-Luc Ferrer (IBS, Grenoble) por conversas e insights úteis. O IBS reconhece a integração ao Instituto de Pesquisa Interdisciplinar de Grenoble (IRIG, CEA).

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<li>Budayova-Spano, M., Koruza, K., Fisher, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+crystal+growth+for+neutron+protein+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Large crystal growth for neutron protein crystallography.</a> Methods in Enzymology. 634, 21-46 (2020).</li>
<li>Budayova-Spano, M., Dauvergne, F., Audiffren, M., Bactivelane, T., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+methodology+and+an+instrument+for+the+temperature-controlled+optimization+of+crystal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (3), 339-347 (2007).</li>
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<li>Astier, J. P., Veesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+temperature+to+crystallize+proteins%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Crystal+Growth+and+Design%22%5BJournal%5D)">Using temperature to crystallize proteins: A mini-review.</a> Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).</li>
<li>Budayova-Spano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preliminary+neutron+diffraction+study+of+rasburicase%2C+a+recombinant+urate+oxidase+enzyme%2C+complexed+with+8-azaxanthin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3A+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).</li>
<li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).</li>
<li>Grimsley, G. R., Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+Determination+of+Protein+Concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric Determination of Protein Concentration.</a> Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).</li>
<li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3AStructural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 254-265 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Diferentes variáveis físicas, químicas e biológicas influenciam a cristalização proteica, afetando a solubilidade da proteína21. Entre essas variáveis, a temperatura e a composição química da solução de cristalização são utilizadas aqui em combinação com a técnica de diálise para melhorar e cultivar grandes cristais de alta qualidade de biomacromléculas para estudos de difração de nêutrons. Usando o conhecimento de diagramas de fase, a cristalização torna-se mais previsível. Embora a triagem de diferentes condições de cristalização em uma abordagem serial também seja possível, o principal objetivo do uso das abordagens racionais apresentadas é separar e controlar a cinética da nucleação e crescimento cristalino.
Semelhante a todos os estudos de cristalização, amostras de proteína pura e homogênea de alta qualidade e soluções de cristalização sem poeira aumentam a taxa de sucesso do experimento. Filtração e centrifugação de soluções são etapas essenciais nos protocolos descritos. Conhecendo as propriedades fisicoquímicas das proteínas estudadas, como o peso molecular (para escolher a membrana de diálise apropriada), o ponto isoelétrico e a solubilidade proteica são cruciais para o projeto de um experimento de crescimento cristalino ideal. Além disso, deve-se considerar a estabilidade da proteína em diferentes temperaturas ou com diferentes produtos químicos para evitar a perda de amostras e aumentar a probabilidade de sucesso. Considerando a faixa de temperatura do OptiCrys (233,0-353,0 ± 0,1 K), uma ampla gama de proteínas pode ser cristalizada usando-a. Mas vale ressaltar que as proteínas que são principalmente termoestabilidade, como proteínas de fontes termofílicas, seriam as mais beneficiadas em experimentos de crescimento de cristais de grande volume controlados pela temperatura oferecidos por este instrumento.
Usando uma câmara de diálise de baixo volume (ao usar botões OptiCrys) ou microdiálise e triagem de várias temperaturas e condições de cristalização (por exemplo, grades de concentração precipitante ou pH), é possível obter informações sobre a localização do limite da zona metastável (equilíbrio cinético entre nucleação e zonas metastáveis). Isso é inestimável ao projetar um experimento de crescimento cristalino bem sucedido especialmente para novos candidatos a proteínas na cristalização. Sem essas informações, os experimentos podem começar a partir de uma área do diagrama de fase com alta supersaturação, muito longe do limite da zona metastável para controlar facilmente a nucleação cristalina. Embora a dissolução do precipitado proteico possa ser tentada, por exemplo, aumentando a temperatura no caso da solubilidade direta, para proteínas com termestabilidade reduzida, manter a amostra em alta temperatura por um período maior de tempo pode tornar a precipitação proteica irreversível. Assim, a melhor estratégia consiste em utilizar uma condição inicial com menor supersaturação localizada perto do limite de metaestabilidade, onde a nucleação pode ser controlada e a precipitação proteica evitada. Em consonância com isso, a cristalização pré-triagem diminui a chance de ter uma proteína precipitada na câmara de diálise e aumenta a taxa de sucesso do experimento.
Depois de projetar um experimento, preparar câmaras de diálise (OptiCrys) ou botões de microdiálise é outro passo importante. Impedir a formação de bolhas de ar na câmara/botão de diálise aumenta a chance de cristalização bem sucedida, especialmente quando pequenos volumes são usados. A presença de bolhas de ar na câmara de diálise também pode alterar a cinética do processo de cristalização e reduzir a reprodutibilidade do experimento (porque a superfície de contato proteína/solução foi modificada). Não só a solução de cristalização de proteínas, mas também a solução de cristalização pode afetar o sucesso do experimento. Usando novos tubos de 50 mL para o sistema de bombeamento cada vez que se quer iniciar um novo experimento e lavar tubos após cada experimento diminui a chance de contaminação e evita a criação de cristais de sal no aparelho.
O uso de botões de microdiálise é uma alternativa quando o OptiCrys não está disponível. As estratégias de otimização da cristalização e monitoramento do crescimento cristalino mencionados acima, devem ser realizadas manualmente. Normalmente, isso requer estar fora de uma incubadora termoregulada, o que pode ser problemático quando a regulação da temperatura é um passo crítico na metodologia descrita. Isso não facilita a alteração da composição química das soluções de cristalização, nem o monitoramento do crescimento de cristais por imagem, de modo que o processo de crescimento de cristais não pode ser controlado em tempo real.
O conhecimento do diagrama de fase é a base do uso do banco de cristalização, OptiCrys, para cultivar sistematicamente cristais grandes e de alta qualidade de forma automatizada. O controle de parâmetros físico-químicos como temperatura, concentração precipitante e pH durante a cristalização move o equilíbrio proteína-solução em uma trajetória cinética bem definida ao longo do diagrama de fase. Isso é complementado pelo uso de uma membrana de diálise para ajustar o transporte de massa e criar um gradiente controlado na câmara de cristalização que afeta o tamanho e a qualidade dos cristais. Portanto, o uso de dados termodinâmicos e trajetórias cinéticas é essencial para controlar o processo de cristalização para cultivar cristais de alta qualidade. Graças ao OptiCrys, diagramas de fase sistemáticas em um espaço multidimensional podem ser estudados com uma abordagem serial usando significativamente menos material do que antes. Para demonstrar essa metodologia, fornecemos aqui um estudo de caso com uma proteína modelo, a lise de ovo de galinha branca. Utilizando e dominando o protocolo aqui apresentado pode-se adaptá-lo para sistemas de proteínas reais5,14,17,18.

Compreender a relação estrutura-função das proteínas e o mecanismo das vias fisiológicas muitas vezes depende de conhecer as posições dos átomos de hidrogênio (H) e como a carga é transferida dentro de uma proteína1,2. Uma vez que os átomos de hidrogênio dispersam os raios-X fracamente, suas posições só podem ser determinadas com dados de difração de raios-X de alta resolução (>1 Å)3,4. Por outro lado, a cristalografia de nêutrons pode ser usada para obter uma posição precisa dos átomos de hidrogênio em macromoléculas biológicas como hidrogênio e deutério (H2, isótopo de hidrogênio) os átomos têm comprimentos de dispersão de magnitude aproximadamente igual como oxigênio, nitrogênio e carbono5. No entanto, o fluxo de nêutrons de fontes de nêutrons disponíveis é mais fraco que o dos feixes de raios-X, por isso isso deve ser compensado muitas vezes por2,3. Isso pode ser conseguido trocando H por H2 e/ou aumentando o volume de cristais para reduzir a dispersão incoerente de hidrogênios e aumentar a relação sinal-ruído de imagens de difração.
Existem várias abordagens de cristalização (o diagrama de fase esquemática correspondente é mostrado na Figura 1) para a obtenção de cristais de grande e alta qualidade tanto para a cristalografia biomolecular de raios-X quanto para o biomolecular de nêutrons6. Na difusão de vapor, uma gotícula preparada a partir de uma mistura de uma proteína e uma solução de cristalização é equilibrada ao longo do tempo, através da evaporação de água ou outras espécies voláteis, contra um reservatório contendo uma maior concentração de precipitante da mesma solução de cristalização. O aumento da concentração de proteína e precipitante na gotícula leva à supersaturação necessária para a nucleação espontânea, seguida pelo crescimento cristalino nesses núcleos6,7. Embora a difusão de vapor seja a técnica mais utilizada para o cultivo de cristais4,o processo de cristalização não pode ser precisamente controlado8. No método de difusão de interface livre, a solução de cristalização se divide em uma solução proteica concentrada, direcionando lentamente o sistema para a supersaturação. Este método pode ser considerado como um método de lote com uma taxa de mistura lenta6,9,10,11,12. No método do lote, a proteína é rapidamente misturada com uma solução de cristalização que leva à supersaturação rápida e, por sua vez, nucleação uniforme com muitos cristais3,7. Este método representa aproximadamente um terço de todas as estruturas atualmente depositadas no Protein Data Bank. O método de diálise também é usado para o cultivo de cristais proteicos de alta qualidade e bem difração. No método de diálise, moléculas de precipitantes difusam de um reservatório através de uma membrana semi-permeável em uma câmara separada com a solução proteica. A cinética do equilíbrio depende de vários fatores, como temperatura, tamanho dos poros de membrana, e o volume e concentração de amostras de proteínas e agentes de cristalização6.
Diagramas de fase de cristalização podem ser usados para descrever diferentes estados de uma proteína em função de diferentes variáveis físicas ou químicas3. Conforme ilustrado na Figura 1,cada técnica de cristalização pode ser visualizada como utilizando uma trajetória cinética diferente para alcançar a nucleação e zonas metastáveis de tal diagrama6,10,13. Isso fornece informações sobre a solubilidade da proteína e a concentração proteica na qual se observa um equilíbrio termodinâmico entre cristal e solução, encontrando assim as condições ideais para a nucleação e o crescimento3,14. Em um diagrama de fase bidimensional, a concentração proteica é traçada em função de uma variável e as outras variáveis são mantidas constantes15. Em tal diagrama de fase, quando a concentração proteica está abaixo da curva de solubilidade, a solução está na região subsaturada e não ocorre nucleação ou crescimento cristalino. Acima desta curva está a zona de supersaturação onde a concentração proteica é maior do que o limite de solubilidade3,14. Isso é ainda dividido em três regiões: a zona metastável, a zona de nucleação espontânea e a zona de precipitação. Na zona metastável, a supersaturação não é suficiente para que a nucleação ocorra dentro de um tempo razoável, mas o crescimento de cristais semeados pode ocorrer. A agregação e precipitação são favorecidas na zona de precipitação, onde a supersaturação é muito alta14,15.
Quando a supersaturação suficiente para a nucleação espontânea for alcançada, os primeiros núcleos aparecerão10. O crescimento dos cristais leva a uma redução na concentração proteica até que o limite de solubilidade seja atingido. Enquanto a supersaturação permanecer nas proximidades da curva de solubilidade, não haverá mudança significativa no tamanho dos cristais. No entanto, tem-se demonstrado que as variações na temperatura e na composição química da solução de cristalização (por exemplo, a concentração de precipitantes) afetarão a solubilidade proteica e podem levar ao início de um crescimento cristalino adicional8,13,16.
Como a diálise é vantajosa para o crescimento de cristal de boa qualidade, o banco de cristalização OptiCrys ilustrado na Figura 2,foi projetado e desenvolvido em nosso laboratório para controlar a cristalização de forma totalmente automatizada8. Para isso, foi escrito um software com o LabVIEW que permite o controle e o monitoramento da temperatura de uma instalação de diálise de reservatórios em contato com elementos Peltier, através de um controlador eletrônico e um refrigerador. O mesmo software também regula automaticamente a composição química da solução de cristalização (por exemplo, a troca de agentes de cristalização) utilizando um sistema fluido multicanal. Além disso, uma câmera digital e um microscópio invertido são usados para visualizar e registrar o processo de cristalização. Duas câmaras de cristalização com volumes de 15 μL e 250 μL estão disponíveis para o cultivo de cristais para diferentes propósitos. Como o processo de cristalização é reversível, a triagem para diferentes condições é possível com apenas alguns microliters da solução proteica, desde que a amostra não seja danificada8. Como resultado, o uso deste método minimiza a quantidade de material proteico utilizado.
A partir do trabalho anterior8,é evidente que durante o processo de crescimento do cristal, observações in situ precisam ser realizadas em intervalos de tempo regulares. Estes podem variar de alguns segundos a vários dias, dependendo do evento sob observação (precipitação, nucleação ou crescimento cristalino).
A otimização do crescimento de cristal com OptiCrys é baseada em diagramas de fase de concentração precipitantes de temperatura. No caso de proteínas com solubilidade como função direta da temperatura, é possível fazer uso do regime de salgadinho18. É aí que o aumento da força iônica da solução, que pode ser visualizada usando diagramas de fase proteica-precipitante, diminui a solubilidade da proteína. Da mesma forma, proteínas com solubilidade inversa podem fazer uso do regime de salgagem18. A nucleação ocorre na zona de nucleação, nas proximidades da zona metastável, e o crescimento cristalino ocorre então na zona metastável do diagrama de fase até que a concentração proteica atinja o limite de solubilidade. Como mostrado na Figura 3A,com temperatura constante de composição química pode ser diminuída para manter a solução de cristalização na zona metastável para evitar novas nucleações. Os cristais crescem até que o segundo equilíbrio cristal/solução seja alcançado e, depois disso, não se observa mais aumento no tamanho dos cristais. A temperatura é diminuída várias vezes até que os cristais atinjam o tamanho desejado. Na Figura 3B,em temperatura constante, o aumento da concentração precipitante mantém a solução na zona metastável. Este processo pode então ser repetido várias vezes para obter cristais grandes. Alterar a temperatura e manipular as condições da solução de cristalização, controlando os níveis de supersaturação, são duas ferramentas poderosas para separar a nucleação e o crescimento de cristais controlados com precisão e automaticamente pelo OptiCrys5,8,14.
Exemplos de cristais proteicos cultivados pela cristalização controlada pela temperatura, ou cristalização controlada pela temperatura e precipitação, bem como dados relativos de difração obtidos estão disponíveis na literatura e PDB. Entre eles estão γ-cristalina humana E, lectina PA-IIL, pirofosfatase inorgânica da levedura, oxidase útero, anidratose carbonic humana II, YchB quinasase e lactato desidrogenase5,14,17,18.
Embora o OptiCrys tenha sido comercializado pelo NatX-ray, existem muitos laboratórios que não têm acesso a este instrumento ou à abordagem serial que oferece. A alternativa para esta técnica é usar botões de microdiálise plástica disponíveis comercialmente com vários volumes. Utilizando estes, a temperatura e a composição química podem ser ajustadas e variadas manualmente. A inspeção de botões de microdiálise não pode ser feita in situ e deve ser feita manualmente com um microscópio óptico. O controle de temperatura pode ser alcançado mantendo a amostra em uma incubadora controlada pela temperatura livre de vibração. É essencial manter a temperatura constante para garantir que os experimentos de cristalização sejam reprodutíveis. Variação significativa na temperatura também pode levar a danos ou destruição de cristais5.
Aqui fornecemos um protocolo detalhado descrevendo a preparação da amostra e o uso de software de controle para o crescimento de cristais grandes e de alta qualidade adequados para cristalografia de proteína de nêutrons. Este procedimento passo a passo foi projetado para aproveitar o diagrama de fase de cristalização, a fim de selecionar uma posição inicial e caminho cinético para controlar o tamanho e a qualidade dos cristais gerados. Além disso, é apresentado um protocolo detalhado para o cultivo de cristais com botões de microdiálise que usa a mesma lógica para obter cristais grandes e de alta qualidade.

<table><tbody><tr><td>200 &micro; l Botão de diálise</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-330</td><td>Botão de diálise</td></tr><tr><td>24 placas de poços</td><td>Jena Bioscience</td><td>CPL-132</td><td>Placa de cristalização</td></tr><tr><td>2-Switch</td><td>FLUIGENT</td><td>2SW001</td><td>Switch</td></tr><tr><td>30 &mu; l Botão de diálise</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-324</td><td>Botão de diálise</td></tr><tr><td>50 mL Corning Tubos de centrífuga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430828-500EA</td><td>Tubos de centrífuga</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Licozima química de clara de ovo de galinha</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td> Discos de membrana de diálise em <td>pó liofilizado</td></tr><tr><td>6-8 kDa MWCO Spectrum</td><td></td><td>132478</td><td>Membrana de diálise</td></tr><tr><td>Tubo de membrana de diálise 6-8 kDa MWCO</td><td>Spectrum</td><td>132650T</td><td>Membrana de diálise</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>Minispin</td><td>Centrífuga de bancada</td></tr><tr>Unidade<td>de fluxo</td><td>FLUIGENT FLUIGENT</td><td>FLU-XL</td><td>Medidor de vazão</td></tr><tr><td>Flowboard</td><td>FLUIGENT</td><td>FLB</td><td></td></tr><tr><td>Flowboard Sistema de controle de fluxo microfluídico EZ</td><td>FLUIGENT</td><td>EZ-01000002</td><td>Controlador de pressão/vácuo</td></tr><tr><td>MilliporeSigma 0.22 &micro; m filtros de seringa</td><td>Millipore</td><td>GSWP04700</td><td>0,22 &mu; m filtro de tamanho de poro</td></tr><tr><td>M-Switch</td><td>FLUIGENT</td><td>MSW002</td><td>Válvula rotativa</td></tr><tr><td>Opticrys</td><td>NatX-ray</td><td>PRT008</td><td>Bancada de cristalização</td></tr><tr><td>Corrediças de cobertura de círculo siliconizado</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-231</td><td>Corrediças de vidro</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio &ge; 99%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>Quadro de distribuição química</td></tr><tr><td></td><td>FLUIGENT</td><td>SWB002</td><td>Central</td></tr><tr><td>Incubadora termorregulada</td><td>Memmert</td><td>IPP30</td><td>Incubadora termorregulada</td></tr></tbody></table>

otimização do crescimento de cristal para cristalização macromolecular de nêutrons

Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

O uso da cristalografia macromolecular de nêutrons (NMX) está se expandindo rapidamente com a maioria das estruturas determinadas na última década graças à construção de novas linhas de vigas NMX e ao aumento da disponibilidade de software de refinamento de estrutura. No entanto, as fontes de nêutrons atualmente disponíveis para NMX são significativamente mais fracas do que fontes equivalentes para cristalografia de raios-X. Apesar dos avanços neste campo, cristais significativamente maiores sempre serão necessários para estudos de difração de nêutrons, particularmente com a tendência de estudar macromoléculas e complexos cada vez maiores. Melhorias adicionais nos métodos e instrumentação adequados ao cultivo de cristais maiores são, portanto, necessárias para o uso do NMX para expandir.
Neste trabalho, introduzimos estratégias racionais e um banco de crescimento cristalino (OptiCrys) desenvolvido em nosso laboratório que combina observação em tempo real através de uma câmera de vídeo montada em microscópio com controle automatizado preciso de soluções de cristalização (por exemplo, concentração precipitante, pH, aditivo, temperatura). Em seguida, demonstramos como esse controle da temperatura e da composição química facilita a busca por condições ideais de cristalização usando proteínas solúveis do modelo. O conhecimento completo do diagrama da fase de cristalização é crucial para a seleção da posição inicial e do caminho cinético para qualquer experimento de cristalização. Mostramos como uma abordagem racional pode controlar o tamanho e o número de cristais gerados com base no conhecimento de diagramas de fase multidimensional.

Nas Seções 2.3 e 2.4, são apresentados três exemplos de crescimento otimizado de cristais, mostrando uso do instrumento e um design experimental para o cultivo de cristais grandes. Para esta demonstração, temos usado a lysozyme como uma proteína modelo, embora experimentos de crescimento de cristais tenham sido realizados com sucesso com muitos outros sistemas proteicos usando este método (ver acima). Usando e dominando o protocolo aqui apresentado pode-se adaptá-lo para outros candidatos à proteína.
Na seção 2.3 demonstramos que estratégias de cristalização racional estabelecidas poderiam ser benéficas no cultivo de cristais com volumes suficientes de dispersão para cristalografia de proteínas de nêutrons. Aqui, demonstramos que as estratégias racionais de otimização propostas também permitem a geração de uma população uniforme de cristais de qualquer tamanho específico necessário para abordagens de determinação da estrutura a jusante.
Esses dois experimentos são projetados para enfatizar a importância dos diagramas de fase no controle da nucleação e crescimento de cristais. Aqui, o controle da temperatura e da composição química das soluções de cristalização em combinação com o monitoramento do processo de cristalização em tempo real são utilizados para estudar o diagrama de fase qualitativa. Usando este método, a nucleação e o crescimento cristalino podem ser otimizados racionalmente de forma reversível. O uso de tal abordagem serial também reduz a quantidade de proteína e o tempo necessário para controlar o tamanho e a qualidade dos cristais.
No método de diálise, uma solução proteica é separada de uma solução de cristalização por uma membrana semi-permeável6 (Figura 5). Essa membrana de diálise permite que pequenas moléculas como aditivos, tampão e íons passem pela membrana, mas não macromoléculas como as proteínas6,20. Este recurso permite que a solução de cristalização seja modificada durante o curso do experimento6. A troca da solução pode ser feita manualmente, por exemplo, em botões de microdiálise, ou de forma automatizada usando um instrumento desenvolvido para este fim, OptiCrys8.
No primeiro conjunto de experimentos, botões de microdiálise foram usados para a cristalização da lise branca de ovo de galinha. Os botões de microdiálise foram imersos em soluções de cristalização com diferentes concentrações de sal. Neste simples experimento de rede de cristalização, a única variável é a concentração precipitante, enquanto a temperatura é mantida constante (293 K). Como mostrado na Figura 4,pequenas variações na concentração de sal induzem uma mudança no tamanho e número de cristais observados, permitindo a investigação do diagrama da fase de cristalização. Na Figura 4, painel 1, a solução de cristalização contém 0,7 M NaCl e um número limitado de cristais maiores apareceram nos botões. Ao aumentar a concentração de sal de 0,7 para 1,2 M, a supersaturação aumenta e a solução na zona de nucleação se afasta da zona metastável(Figura 4, painéis 1 a 6). Como resultado, o número de cristais aumenta e seu tamanho diminui.
No primeiro experimento com um instrumento totalmente automatizado que permite a cristalização da diálise controlada pela temperatura, OptiCrys (Figura 9), o experimento de crescimento de cristal foi adaptado para gerar um grande crescimento de cristal. O experimento foi lançado a uma temperatura inicial de 295 K com uma solução de cristalização contendo 0,75 M NaCl e 0,1 M Na acetato tampão pH 4. Nessas condições experimentais, a solução de cristalização atingiu a zona de nucleação nas proximidades da zona metastável do diagrama de fase(Figura 9, seta 1). Como resultado, apenas alguns núcleos foram gerados durante a primeira fase do experimento. Para crescer ainda mais os cristais selecionados (mostrados na Figura 9),o fluxo de trabalho de otimização do crescimento cristalino foi impulsionado para a zona metastável por uma temperatura variada assim que o equilíbrio da solução cristalina foi atingido.
Cada vez que o equilíbrio entre cristal e solução era atingido, a temperatura era reduzida, primeiro para 291 K, depois para 288 K e finalmente para 275 K, para manter a solução de cristalização na zona metastável. O resultado deste experimento é um único cristal grande adequado tanto para raios-X macromoleculares quanto para cristalografia de nêutrons.
Para a maioria das proteínas, o diagrama de fase quantitativa precisa (ou apenas um diagrama qualitativo) ainda não foi obtido devido à falta de dispositivos experimentais capazes de medir com precisão a concentração proteica (ou apenas de observar/detectar o processo de cristalização em tempo real) durante os experimentos de cristalização18. Como resultado, muitas vezes não é possível projetar o experimento de tal forma que a cristalização começa na área ideal do diagrama de fase, nas proximidades da zona metastável.
Portanto, um estudo de otimização de cristalização deve ocorrer antes que o experimento dedicado ao crescimento de um cristal de grande volume seja realizado. Neste estudo, utilizando variações de temperatura (em composição química constante) por um lado e variações na composição química (em temperatura constante) por outro, são necessárias para identificar a zona metastível e delinear as condições ideais para iniciar um grande experimento de crescimento cristalino.
Para isso, dois outros experimentos são apresentados que foram adaptados para demonstrar a reversibilidade dos experimentos de cristalização de diálise controlados pela temperatura com optiCrys para nucleação, crescimento de cristais, dissolução e re-crescimento. O fluxo de trabalho de otimização do crescimento cristalino foi controlado para que uma população uniforme de menos cristais de lisezina maiores fosse cultivada, utilizando variação de temperatura ou concentração precipitada.
No segundo experimento com optiCrys, a composição química da solução de cristalização foi mantida constante durante todo o experimento (0,9 M NaCl em 0,1 M CH3COONa pH 4) com temperatura variável. A temperatura inicial foi fixada em 291 K. Os resultados deste experimento são resumidos na Figura 10. Devido à alta supersaturação, um grande número de cristais pequenos apareceu na câmara de cristalização(Figura 10, painéis 1 e 2). De acordo com o conceito de solubilidade proteica direta, aumentando gradualmente a temperatura para 313 K, todos os cristais foram dissolvidos(Figura 10, painéis 3, 4 e 5). Finalmente, ao baixar a temperatura para 295 K, a segunda nucleação foi iniciada nas proximidades da zona metastável e permitiu a formação controlada de um menor número de núcleos. Um crescimento ainda mais cristalino resultou na geração uniforme de uma população de cristais maiores (Figura 10, painel 7).
Como mostrado na Figura 11, a variação da composição química da solução de cristalização, a uma temperatura constante de 291 K, também pode ser usada para obter uma população uniforme de cristais maiores. Semelhante ao experimento anterior, a condição inicial era de 0,9 M NaCl em 0,1 M CH3COONa pH 4. A concentração de NaCl foi então reduzida gradualmente de 0,9 M para zero para dissolver os cristais (Figura 11, painéis 4 e 5). Neste ponto, o NaCl foi completamente substituído por uma solução tampão de 0,1 M CH3COONa pH 4. A redução da concentração de sal mantém a solução na zona subsaturada do diagrama de fase, o que leva à dissolução dos cristais. Em seguida, uma nova solução de cristalização com menor resistência iônica, a 0,75 M NaCl em 0,1 M CH3COONa pH 4, foi injetada na câmara do reservatório. Nesta concentração precipitante, os primeiros núcleos apareceram(Figura 11, painel 6) após 90 minutos. O número de cristais gerados foi menor e os cristais atingem um volume maior(Figura 11, painel 7) do que antes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3.jpg"> Figura 1: Diagrama de fase esquemática. Trajetórias cinéticas para três técnicas de cristalização são representadas em um regime de salga. Cada método alcança nucleação e cristalização de forma diferente, visualizado por uma via cinética diferente através do diagrama de fase para alcançar a nucleação e zonas metastáveis. A curva de solubilidade separa regiões de subsaturação e supersaturação. A supersaturação é dividida em três zonas: metastável, nucleação e precipitação. Na zona de nucleação, a nucleação espontânea ocorre enquanto na zona metastável ocorre o crescimento do cristal. Esta Figura é adaptada de Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig1v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig02.jpg"> Figura 2: Representação esquemática do banco de cristalização (OptiCrys). A fonte de luz LED está localizada em cima da célula de fluxo de diálise controlada pela temperatura. Um microscópio invertido e a câmera digital são mostrados no canto superior direito da imagem com a seta vermelha. O círculo vermelho representa a localização da tubulação do refrigerador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig03.jpg"> Figura 3: Diagrama de fase de cristalização de proteínas bidimensionais esquemática em função da temperatura (A) e concentração precipitante (B). (A) No caso de uma proteína com solubilidade direta, a diminuição da temperatura mantém a solução de cristalização na zona metastável. A variação da temperatura pode ser repetida várias vezes para controlar o processo de crescimento do cristal até que sejam obtidos cristais com o volume desejado. (B) Alterar a concentração da solução precipitante também pode ser usada para manter a solução de cristalização na zona metastável para o cultivo de cristais. Esta Figura é adaptada de Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig04.jpg"> Figura 4: Cristais de lise obtidos utilizando o método de diálise. Este experimento foi realizado a uma temperatura constante de 293 K em 0,1 M de tampão de acetato de sódio pH 4. O aumento da concentração de NaCl de 0,7 M para 1,2 M aumenta a taxa de nucleação e resulta em um número maior de cristais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig05.jpg"> Figura 5: Visão geral do processo de cristalização da proteína pelo método de diálise. (A) Adicionando a proteína à câmara do botão de diálise, (B) uma forma de cúpula é criada na parte superior da câmara. (C) Um aplicador é usado para transferir o o-anel para o sulco do botão de diálise, a fim de fixar a membrana de diálise no lugar. (D) O botão de diálise está pronto para imersão na solução do reservatório. (E) A solução de cristalização passa pela membrana semipermeável e os cristais começam a se formar dentro da câmara. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig06.jpg"> Figura 6: Visão esquemática da configuração de diálise fluindo controlada pela temperatura. (A) A amostra de proteína é adicionada à câmara de diálise. (B) A membrana de diálise é fixada na caixa de dormir com um anel O usando um aplicador. (C) A câmara de ultracâmara é virada e fixada no topo da câmara de diálise. As setas brancas indicam onde os parafusos são colocados na caixa. (D) A câmara do reservatório é virada no sentido horário (E) e fixada em cima da câmara. (F) A câmara do reservatório é coberta por uma tampa hermética com conectores para um sistema de bombeamento e (G) a célula de fluxo é colocada no suporte de latão. Esta Figura é adaptada de Junius et al. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig07.jpg"> Figura 7: Preparação e injeção da solução de cristalização no reservatório pelo sistema fluido (A). Os tubos que contêm sal e água estão conectados ao controlador de pressão/vácuo (B) e à válvula rotativa (C). Usando a pressão, o controlador de pressão/vácuo cria um fluxo constante dos líquidos dos tubos para a válvula rotativa. Cada líquido que passa pelo medidor de fluxo (D) e o interruptor é injetado no tubo de mistura (F). Uma vez que todos os líquidos tenham sido adicionados ao tubo de mistura, o interruptor por algumas modificações injeta a solução final do tubo de mistura para o reservatório (G). O líquido flui através do sistema na direção das setas no diagrama marcado em ordem ascendente (de 1 a 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2.jpg"> Figura 8: Visão de manutenção do software de supervisão. Esta visão é usada para controlar diferentes parâmetros como temperatura, luz, solução de cristalização e zoom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig8v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig09.jpg"> Figura 9: O diagrama de fase em função da temperatura (as imagens selecionadas devem ser rastreadas em ordem ascendente). Um único cristal de lysozyme grande é obtido alterando sistematicamente a temperatura de 295 K para 275 K. A cada passo, o crescimento do cristal é interrompido ao atingir a curva de solubilidade. Reduzir a temperatura mantendo a solução na zona metastável reinicia o crescimento do cristal. As imagens têm diferentes níveis de ampliação. Esta Figura é adaptada de Junius et al. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig10.jpg"> Figura 10: Otimização do crescimento do cristal na composição química constante usando controle de temperatura (imagens selecionadas devem ser rastreadas em ordem ascendente). Iniciar o processo de nucleação na zona de nucleação a 291 K, longe da zona metastável, resulta na formação de inúmeros cristais. Aumentar a temperatura para 313 K, em seguida, dissolve os cristais até que nenhum núcleo visível seja visto na câmara de diálise. Finalmente, a diminuição da temperatura para 295 K reinicia o processo de nucleação pela segunda vez levando a um número limitado de cristais maiores. Esta Figura é adaptada de Junius et al. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61685/61685fig11.jpg"> Figura 11: Otimização do crescimento do cristal à temperatura constante usando variações na concentração precipitante (imagens selecionadas devem ser rastreadas em ordem ascendente). A diminuição da concentração precipitada de 0,9 M para 0 M dissolve os cristais obtidos durante o primeiro evento de nucleação. O processo de cristalização é reiniciado pela injeção do mesmo precipitante, mas com menor resistência iônica, 0,75 M, o que leva à formação de alguns cristais maiores. Esta Figura é adaptada de Junius et al. 8,18<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61685/61685fig11large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Estudos estruturais de biomacromolecules por cristalografia requerem cristais de alta qualidade. Aqui demonstramos um protocolo que pode ser usado pelo OptiCrys (um instrumento totalmente automatizado desenvolvido em nosso laboratório) e/ou botões de microdiálise para o crescimento de grandes cristais de alta qualidade com base no conhecimento do diagrama de fase de cristalização.

Otimização do Crescimento de Cristal para Cristalização Macromolecular de Nêutrons

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

Existem diferentes abordagens de cristalização para a obtenção de cristais de grande e alta qualidade tanto para a cristalografia de raios-X quanto para o cristalismo de nêutrons. Uma dessas abordagens é o uso do método de diálise. Nesta técnica, a solução proteica é separada de uma solução precipitante por uma membrana semi-permeável.As moléculas precipitantes se difundem através da membrana na câmara de proteínas. Quando a supersaturação correta para uma nucleação espontânea é alcançada, os primeiros núcleos aparecerão. Aqui, demonstraremos um protocolo que pode ser usado pelo OptiCrys um instrumento totalmente automatizado desenvolvido em nosso laboratório que usa cristalização de diálise controlada por temperatura, e nossos botões de microdiálise para o crescimento de grandes cristais de alta qualidade para cristalografia macromolecular natural com base no conhecimento do diagrama de fase de cristalização.Para um botão de micro diálise com certa pipeta de volume microliter 35 microliters de solução de lise na câmara de diálise. Este volume extra cria uma forma ligeiramente de cúpula em cima da câmara de diálise e impede a formação de bolhas de ar. Pegue um aplicador e coloque o elástico ou anel na extremidade dele.Coloque a membrana na parte superior da câmara e fixe-a transferindo o elástico ou anel do aplicador para o sulco do botão de diálise. Transfira o botão para o poço que contém a solução de cristalização. Cubra o poço com um deslizamento de tampa de vidro ou um pedaço de fita.Mantenha a amostra em 293 Kelvin em uma incubadora reguladora térmica livre de vibração. Sabendo que a cristalização da diálise oferece vantagens do ponto de vista do crescimento cristalino, o banco de cristalização chamado OptiCrys foi projetado e desenvolvido em nosso laboratório para oferecer um controle combinado totalmente automatizado da temperatura e composição química do experimento de cristalização biomolecular. A otimização do crescimento do cristal pelo OptiCrys é baseada nos diagramas de fase de concentração precipitantes de temperatura.A nucleação ocorre na zona de nucleação nas proximidades da zona metastável e o crescimento cristalino ocorre então na zona metastável após o diagrama de fase, até que a concentração proteica atinja a curva de solubilidade representando o equilíbrio termodinâmico entre solução e cristais. Ao diminuir a temperatura em caso de proteína com solubilidade direta ou aumentando a concentração precipitante em caso de salgamento, a solução de cristalização permanece na zona metastável e não ocorre nucleação. Os cristais crescem até que o equilíbrio da segunda solução cristalina alcance e, depois disso, não é observado mais aumento no tamanho dos cristais.Diminuir a temperatura ou aumentar a concentração precipitada é repetido várias vezes até que os cristais atinjam o tamanho desejado. Adicione a solução proteica à câmara de diálise da configuração de fluxo controlado pela temperatura, cubra a câmara sobre com a membrana de diálise e fixe a membrana com o elástico ou anel. Vire a câmara e coloque-a em cima da câmara de diálise.Pressione-o suavemente e lentamente para remover todo o ar preso entre duas peças, fixar o reservatório em sua posição, aparafusando-o suavemente em cima da câmara. Adicione a solução de cristalização à câmara do reservatório e cubra-a pela tampa hermética. Transfira este conjunto e inseri-lo no suporte mamário do banco de cristalização OptiCrys Crystal growth é um software de supervisão do Cristalização Bench OptiCrys.Ele inclui quatro interfaces gráficas ou visualizações diferentes. A visão inicial contém botões para navegar para as outras visualizações. O objetivo da interface de configuração é definir um cenário de experimento que pode ser executado automaticamente na exibição do teste.A última vista é a visão de manutenção. Para reiniciar um experimento, a visão de manutenção deve estar aberta onde todos os parâmetros essenciais para o funcionamento suave dos experimentos de cristalização são encontrados. Aumente a luminosidade da seção de luz, a luz pode aumentar de zero, sem luz para 100 brilho máximo.Para controlar e monitorar a temperatura, a seção reguladora de temperatura é usada. Clique no botão para ligá-lo. Coloque a temperatura na seção de ponto de configuração e pressione enter.Abaixo deste botão, há dois gráficos. O vermelho mostra a final, a temperatura da ordem e o gráfico amarelo mostra a temperatura atual. Misturando soluções de estoque, uma injeção da solução de cristalização para a câmara do reservatório é controlada pela seção Palm.Adicione a concentração da solução de estoque na primeira etapa. Em seguida, encontre a concentração final de cada nova solução de garoupador e adicione-as à seção de concentração final. Depois de pressionar o botão de cálculo, descubra que o volume da solução de estoque será calculado e adicionará no painel de volume na frente de cada painel de concentração.Pressione o botão de preparação de lançamento e aguarde até que a nova solução premier esteja pronta. Para trocar a solução de cristalização, clique no botão Entrada de solução. Para interromper o processo, pressione o botão Stop Distribution.No lado direito da seção de microscópio, existem vários painéis para registro de informações importantes de cada experimento de crescimento de cristal. Adicione o nome das proteínas correspondentes, o peso molecular e a condição de cristalização nesta seção. Defina um nome para seus experimentos simplesmente digitando-o no nome da pasta.A partir da seção nb imagens, selecione o número de imagens que devem ser tiradas durante o experimento. Adicione o número das imagens e, a partir do painel à direita, escolha a escala do temporizador. Clique no botão pasta para abrir a pasta.Nesta pasta, há um arquivo de texto contendo todas as informações que você definiu anteriormente para o seu experimento. Imagens prontas para qualquer tratamento adicional também são salvas nesta pasta. O zoom do microscópio também pode ser variado automaticamente.Altera o zoom usando o botão mais e menos na parte superior da seção microscópio para aumentar ou diminuir a ampliação, respectivamente. Existem três maneiras diferentes de medir o tamanho do cristal. Para medir o comprimento ou largura, use o vetor de largura.Dependendo da forma cristalina, as ferramentas específicas da parte esquerda da seção de microscópio podem ser escolhidas. Como um retangular ou polígono. Os valores aparecerão na seção de medida.No primeiro conjunto de experimentos, os botões de microdiálise foram imersos nas soluções de cristalização com diferentes concentrações de sal. Neste simples experimento de rede de cristalização, a única variável é a concentração precipitante. enquanto a temperatura é mantida constante.Pequenas variações na concentração de sal permitem investigar o diagrama da fase de cristalização aumentando a concentração de sal de 0,7 para 1,2 aumentos de supersaturação molar e a solução na zona de nucleação está se afastando da zona metastável. Consequentemente, observa-se uma variação de tamanho e número de cristais com o aumento do número de cristais e seu tamanho diminuindo. No primeiro experimento com OptiCrys sob a condição experimental dada, uma vez que o equilíbrio na câmara de diálise alcance, a solução de cristalização está na zona de nucleação nas proximidades da zona metastável do diagrama de fase de cristalização.Como resultado, apenas alguns núcleos são gerados durante a primeira fase do experimento. A fim de manter o crescimento de cristais na zona metastável e controlar o processo de crescimento de cristal, a temperatura foi alterada em intervalos de tempo diferentes. Cada vez que o equilíbrio da solução cristalina era concluído, a temperatura era variada.Portanto, a temperatura diminuiu para 291 Kelvin, 288 Kelvin e finalmente 275 Kelvin para manter o crescimento do cristal selecionado na zona de metastável. O resultado deste experimento é um único cristal grande, com o volume necessário para a cristalografia macromolecular natural. Os dois próximos experimentos demonstram a reversibilidade dos experimentos de diálise controladas pela temperatura para nucleação, crescimento cristalino, dissolução e recrescimento.No segundo experimento com o OptiCrys a composição química da solução de cristalização foi mantida constante durante o experimento e a temperatura variou. A temperatura inicial foi fixada em 291 Kelvin. Por causa da alta supersaturação, um grande número de pequenos cristais apareceu na câmara de cristalização.De acordo com o conceito de solubilidade direta da proteína, aumentando gradualmente a temperatura para 313 Kelvin todos os cristais foram dissolvidos. Finalmente, baixando a temperatura para 295 Kelvin, a segunda nucleação iniciou-se nas proximidades da zona metastável e permitiu controlar o processo de nucleação resultando na formação de menor número de núcleos. Um crescimento mais cristalino permitiu gerar a população uniforme de cristais maiores.Neste experimento, alterar a composição química da solução de cristalização a temperatura constante leva a obter uma população uniforme de cristais maiores. A condição de cristalização foi semelhante ao experimento anterior. A dissolução dos cristais foi alcançada reduzindo gradualmente a concentração de NaCl de 0,9 molar para zero.A redução da concentração de sal mantém a solução na zona subsaturada do diagrama de fase que leva à dissolução dos cristais. Em seguida, a nova solução de cristalização com menor resistência iônica do que anteriormente foi injetada na câmara do reservatório. Nesta concentração precipitante o menor número de cristais aparecem e os cristais atingem um volume maior do que antes.Aqui fornecemos um protocolo detalhado descrevendo a preparação da amostra e ajustando o software de controle para o cultivo de cristais de grande e alta qualidade para a cristalografia macromolecular natural usando um instrumento totalmente automatizado desenvolvido em nosso laboratório. Este procedimento passo a passo foi projetado e beneficiado com o conhecimento do diagrama de fase de cristalização, a fim de separar a nucleação e o crescimento cristalino. Além disso, um protocolo para o cultivo de cristais com padrões de microcitose também é apresentado usando botões de macrocitose como alternativa quando o OptiCrys não está disponível.Além das estratégias que mencionei para o OptiCrys alterando a composição química da solução de cristalização e temperatura e tirar imagens deve ser feita manualmente. Utilizando a vibração térmica regulada para a incubadora para manter a temperatura constante é necessário, o que é um passo crítico na metodologia demonstrada.

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