Isolamento de Fluidos Proximais para Investigar o Microambiente Tumoral do Adenocarcinoma Pancreático
5 de novembro de 2020
O suco pancreático é uma fonte preciosa de biomarcadores para o câncer de pâncreas humano. Descrevemos aqui um método para o procedimento de coleta intraoperatória. Para superar o desafio de adotar esse procedimento em modelos murinos, sugerimos uma amostra alternativa, o líquido intersticial tumoral, e descrevemos aqui dois protocolos para seu isolamento.
O método descrito aqui para isolar o fluido proximal em humanos e em camundongos pode ser aplicado para estudar o microambiente do câncer de pâncreas para identificar novos biomarcadores da doença. Usando este protocolo simples, é possível traduzir achados clínicos de suco pancreático para modelos murinos de PDAC para realizar estudos mecanicistas. O suco pancreático é um fluido corporal amplamente inexplorado que se mostrou promissor como fonte de biomarcadores preciosos para ajudar no diagnóstico pré-operatório e no perfil do paciente.
Demonstrarei a primeira parte do protocolo, e Marialuisa Barbagallo, pós-doutoranda do nosso laboratório, demonstrarei a segunda parte do protocolo. Estime a localização do ducto pancreático usando medições adquiridas durante a imagem. Em seguida, palpe a superfície anterior do pâncreas para identificar sua localização precisa.
Segure a cabeça pancreática no duodeno por baixo e eleve-a com a mão esquerda, marcando a localização do ducto pancreático com o primeiro dedo. Use a mão direita para inserir uma seringa de três mililitros com uma agulha de calibre 25 no pâncreas, logo distal ao polegar esquerdo. Decida a profundidade de penetração e o grau de inclinação da agulha com base nas medições pré-operatórias e na percepção de ter penetrado na parede do ducto.
Retire o suco com a seringa. Se não for possível recuperar o suco, reposicione a agulha na tentativa de canular o ducto pancreático. Assim que o suco pancreático for recuperado, mova-o para fora do campo estéril e transfira-o para um tubo de ensaio a vácuo EDTA de três mililitros.
Mantenha o tubo a quatro graus Celsius até que a amostra seja transferida para o laboratório. Para processar o suco pancreático, centrifugue-o a 400 G e quatro graus Celsius por 10 minutos para remover quaisquer células ou detritos. Recupere o sobrenadante, aliquota-o e armazene-o a 80 graus Celsius até novas análises.
Para isolar o fluido intersticial tumoral ou TIF, por centrifugação, corte o tumor ao meio, enxágue as duas partes em PBS e seque-as suavemente em papel de filtro, movendo-se o mais rápido possível para evitar a evaporação do tumor. Transfira imediatamente o tumor para um filtro de células de náilon de 20 micrômetros, afixado a um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugue o tubo a 400 G por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Recupere o TIF do fundo do tubo, alicote e congele-o imediatamente em gelo seco. Armazene a 80 graus Celsius até uma análise mais aprofundada. Para isolar o TIF usando eluição, corte o tumor em pequenos pedaços com uma tesoura ou bisturi e enxágue-os cuidadosamente com PBS frio.
Transfira os pedaços do tumor para um tubo de 1,5 mililitro e adicione 500 microlitros de PBS com um coquetel de inibidores de protease para evitar a degradação dos analitos. Incube o tecido por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro e execute uma série de etapas de centrifugação a quatro graus Celsius para remover quaisquer células da amostra.
Recuperando o sobrenadante após cada centrifugação e transferindo-o para um novo tubo. Após a última centrifugação, alíquota e congelamento imediatos Armazene-o a 80 graus Celsius até uma análise mais aprofundada.
Este protocolo foi usado para obter o suco pancreático de pacientes com PDAC e outras doenças pancreáticas benignas. Depois de filtrar os amplos sinais de RMN das macromoléculas, os sinais de metabólitos de pequeno peso molecular eram aparentes. A análise supervisionada de OPLS-DA mostrou que o perfil metabólico no suco pancreático foi capaz de discriminar entre pacientes com PDAC e não PDAC com uma precisão de 82,4% Curiosamente, a análise metabolômica realizada em amostras de plasma dos mesmos pacientes não produziu o mesmo poder discriminativo.
Para demonstrar que o conteúdo do fluido intersticial do tumor reflete de forma confiável as mudanças no microambiente tumoral, duas linhagens de células cancerígenas pancreáticas com taxas glicolíticas opostas foram injetadas por via subcutânea em camundongos. Após a excisão dos tumores, as concentrações de glicose e lactato foram quantificadas. O fluido intersticial tumoral de tumores altamente glicolíticos continha menos glicose e mais lactato em comparação com tumores de baixo glicolítico.
Neste estudo, realizamos análises metabolômicas. No entanto, esses fluidos proximais são adequados para muitas outras aplicações a jusante, como espectrometria de massa e perfil de microRNA.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para a coleta intraoperatória de suco pancreático, uma fonte valiosa de biomarcadores para o câncer de pâncreas. Além disso, introduz uma amostra alternativa, o fluido intersticial tumoral, juntamente com protocolos para seu isolamento em modelos murinos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oncologia
- Descoberta de biomarcadores
Contexto
- O suco pancreático é uma fonte pouco explorada de biomarcadores.
- Ele tem potencial para auxiliar no diagnóstico pré-operatório.
- Compreender o microambiente do câncer pancreático é fundamental.
- Traduzir descobertas de estudos em humanos para modelos murinos pode aprimorar a pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Isolar suco pancreático e fluido intersticial tumoral para identificação de biomarcadores.
- Fornecer protocolos aplicáveis em modelos humanos e murinos.
- Facilitar estudos mecanicistas do câncer pancreático.
Métodos Utilizados
- Coleta intraoperatória de suco pancreático.
- Isolamento do fluido intersticial tumoral.
- Técnicas de imagem para localizar o ducto pancreático.
- Palpação do pâncreas para identificação precisa.
Resultados Principais
- Protocolos demonstrados para o isolamento de fluidos.
- Destacou o potencial do suco pancreático como fonte de biomarcadores.
- Mosou a viabilidade de traduzir achados clínicos para modelos murinos.
- Fornecer uma base para futuros estudos mecanicistas.
Conclusões
- O suco pancreático e o líquido intersticial tumoral são promissores para a pesquisa de biomarcadores.
- Os protocolos podem aprimorar a compreensão do câncer pancreático.
- São necessários mais estudos para explorar todo o potencial desses fluidos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de fluido proximal permite a investigação direta do microambiente do adenocarcinoma pancreático, oferecendo um caminho para a descoberta de biomarcadores que una observações clínicas e estudos mecanicistas pré-clínicos. Ao fornecer métodos tecnicamente acessíveis para a coleta de suco pancreático e fluido intersticial tumoral em sistemas humanos e murinos, o protocolo apóia esforços de validação de alvos e desenvolvimento de ensaios centrados em alterações microambientais. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta, fornecendo fluidos relevantes para a doença que refletem as interações entre células estromais e tumorais, orientando decisões de avanço ou interrupção em programas de descoberta de fármacos para câncer pancreático.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao isolar fluidos que concentram biomarcadores do microambiente tumoral.
- Valor Operacional: Fornece um sistema relevante para a doença, destinado à validação funcional de alvos, utilizando biomarcadores de fluidos proximais.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação mecanicista por meio da análise comparativa de fenótipos tumorais glicolíticos mediante a quantificação de glicose e lactato no fluido intersticial tumoral (TIF).
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara fluidos biológicos validados para aplicações posteriores, como espectrometria de massa e perfilagem de microRNA.
- Valor Operacional: Oferece protocolos padronizados e reprodutíveis de isolamento (centrifugação e eluição) adequados para escalabilidade de ensaios.
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas de metabólitos que permitem a detecção de biomarcadores prontos para triagem com poder discriminatório (82,4% de acurácia na OPLS-DA).
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Estabelece continuidade em sistemas relevantes para doenças ao traduzir achados de suco pancreático humano para modelos murinos de LIT.
- Valor Operacional: Facilita a validação pré-clínica mediante o isolamento de LIT a partir de modelos de tumores subcutâneos que refletem alterações no microambiente.
- Valor Estratégico: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao vincular perfis de biomarcadores líquidos ao fenótipo tumoral.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos líderes, permitindo o perfilhamento do microambiente que orienta estudos mecanicistas e campanhas de triagem guiadas por biomarcadores.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao isolar fluidos que refletem as interações estroma-tumorais no CPDA.
- Triagem: Permite a preparação para ensaios por meio do isolamento padronizado de FIT e suco pancreático, gerando saídas quantitativas de metabólitos e ácidos nucleicos.
- Análises: Fornece biomarcadores mensuráveis (glicose, lactato, metabólitos) para análise comparativa entre condições e triagem fenotípica.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à continuidade pré-clínica, demonstrando que o FIT reflete o estado glicolítico do tumor em modelos murinos.
- Reutilização em Escala: Estabelece uma capacidade reutilizável de isolamento de fluidos proximais em sistemas humanos e murinos, reduzindo barreiras na transposição de modelos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da detecção de biomarcadores microambientais e validação de alvos no CPDA.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio de técnicas simples de centrifugação e eluição para o isolamento de LIT.
- Valor Estratégico: Melhoria nas decisões de prosseguimento ou interrupção ao associar biomarcadores líquidos ao fenótipo tumoral, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco com base em perfis líquidos discriminativos de biomarcadores (precisão de 82,4% no CPDA versus não-CPDA).
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em manuseio cirúrgico de fluidos e dissecção de tumores para isolamento de fluidos proximais.
- Exige equipamento de centrifugação (400 G, 4°C) e manuseio estéril de fluidos para processamento de suco pancreático e TIF.
- Exige padronização entre equipes cirúrgica, de patologia e analítica para manter a integridade das amostras.
- Envolve considerações de adaptação para o isolamento de TIF murino por centrifugação ou eluição, com base no tamanho do tecido e na aplicação posterior.
- Inclui limitações práticas, como a dificuldade técnica na coleta de suco pancreático murino, exigindo o uso de TIF como substituto.
