Triagem In Vivo CRISPR/Cas9 para avaliar simultaneamente a função genética na pele do rato e na cavidade oral

Este protocolo é significativo porque permite que os pesquisadores investiguem simultaneamente as funções supressoras de tumor de centenas de genes no câncer de cabeça e pescoço por uma fração do custo de um modelo convencional de camundongo nocaute. Esta técnica é flexível e pode ser adaptada para cobrir a expressão de genes para estudar sua função na pele. O protocolo de biblioteca CRISPR direcionado também pode ser aplicado para outros tipos de câncer.

Coloque o animal anestesiado com o lado ventral para cima no estágio de cirurgia aquecida e use fita cirúrgica para manter as patas no lugar. Aplique o tubo de anestesia do cone nasal para um suprimento constante de isoflurano e oxigênio até que a cirurgia seja concluída. Para confirmar a gravidez E9.5, aplique uma pequena quantidade de creme depilatório no abdômen e espalhe-o sobre uma área quadrada de três por três centímetros usando um aplicador com ponta de algodão.

Após dois a três minutos, remova suavemente o creme com gaze ou lenço de papel e limpe a área com PBS e etanol 70%. Usando a sonda de ultrassom e o gel, verifique se o camundongo prenhe está no dia embrionário E9.5. Isso também pode ser feito no dia anterior em E8.5 para economizar tempo no dia da cirurgia.

Remova o gel de ultrassom e limpe a área usando BPS e depois etanol 70%. Injete mais com analgésico subcutâneo. Em seguida, você fórceps e tesouras estéreis para fazer uma incisão vertical na pele.

Use uma pinça romba para separar a pele ao redor da incisão do peritônio. Em seguida, você esteriliza uma pinça e uma tesoura para cortar o peritônio. Usando uma pinça romba, puxe suavemente o chifre do útero esquerdo e direito e conte os embriões.

Reinsira a maioria dos cornos uterinos, mas deixe a extremidade distal de um corno uterino contendo três embriões exposta. Usando uma pinça romba, empurre e puxe suavemente o útero com os três embriões, através da abertura na membrana de silicone da placa de Petri modificada. Estabilize a placa de Petri usando cubos de massa de modelar.

Estabilize o útero com os três embriões dentro da placa de Petri, usando um molde de silicone. Em seguida, alise o tampão de silicone na lateral dos embriões usando uma ferramenta cega. Encha a placa de Petri com PBS estéril e lave a membrana de silicone no fundo da placa de Petri, com a barriga da mãe grávida, evitando assim qualquer vazamento.

Mova a cabeça do ultrassom para a placa de Petri, aproximadamente 0,5 centímetros acima do embrião superior e ajuste o estágio para que a cavidade amniótica se torne claramente visível na visualização do ultrassom. Alinhe cuidadosamente a agulha do injetor na placa de Petri modificada. Usando o micromanipulador, coloque a ponta da agulha a cinco milímetros do embrião superior e, em seguida, alterne a agulha para frente e para trás para se mover para o plano onde sua ponta parece mais brilhante na imagem de ultrassom.

Usando o micromanipulador, empurre a agulha através da parede uterina para a cavidade amniótica. Injete 62 nanolitros do lentivírus com a biblioteca de sgRNA a uma velocidade de injeção lenta. Pressione o botão Injetar oito vezes para um total de 496 nanolitros por embrião.

Repita o mesmo procedimento para os outros dois embriões. Em seguida, levante a cabeça do ultrassom e remova o tampão de silicone. Empurrou suavemente os dois primeiros dos três embriões para o abdômen do camundongo usando um cotonete estéril.

Retire os próximos três embriões e empurre o terceiro embrião injetado anteriormente. Repita o procedimento de injeção até que o número desejado de embriões seja injetado, certificando-se de não exceder 30 minutos de anestesia. Quando terminar, levante a cabeça do ultrassom, remova o micromanipulador com a agulha, aspire o PBS e remova a placa de Petri.

Usando lenços estéreis, absorva qualquer PBS que possa ter se acumulado na cavidade abdominal. Feche a incisão peritoneal usando suturas absorvíveis. Em seguida, use dois grampos para fechar a incisão na pele abdominal.

Em seguida, as leituras de sequenciamento de geração de DNA amplificado por PCR de células transduzidas por plasmídeo e biblioteca lentiviral devem mostrar uma alta correlação. Se as leituras de sgRNA do DNA do plasmídeo não mostrarem representação igual de sgRNAs, então o procedimento de preparação e concentração viral deve ser repetido com cuidado. Os resultados da injeção guiada por ultrassom de lentivírus portador de Cre recombinase em filhotes de camundongos confete E9.5 Lox-STOP-Lox no dia pós-natal P0 são mostrados aqui.

Embora o alto título de vírus resulte em maior cobertura da pele do camundongo, também resultaria na transdução de vários sgRNAs para a mesma célula. Este gráfico mostra leituras de sequenciamento de última geração de DNA amplificado por PCR, de células transduzidas por plasmídeo e biblioteca lentiviral, bem como leituras de quatro tumores representativos. Os guias de sgRNA direcionados aos supressores de tumor ADAM10 e RIPK4 são enriquecidos nas amostras de tumor em comparação com o pool de plasmídeos ou células infectadas.

Realizar a cirurgia em E9.5 é fundamental. Lembre-se de verificar a gravidez com ultrassom, nove dias após a montagem do cruzamento e identificar o ponto de tempo embrionário em cada camundongo fêmea. Uma vez que os filhotes nascem, as células transduzidas podem ser isoladas e extensivamente perfiladas usando as mais recentes técnicas de perfil genético, como sequenciamento de RNA de célula única.