Name: Preparação de células progenitoras adiposas adiposas de tecidos adiposos epidímicos do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Aprenda a isolar células progenitoras adiposas de tecido adiposo epididímico de camundongo usando FACS. Este método garante alta viabilidade e pureza celular para análises downstream sensíveis como sequenciamento de RNA single-cell.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Reconhecemos a Instalação de Citometria do Núcleo de Análise celular da Clínica Mayo clinic para assistência com a triagem FACS.

Todos os procedimentos experimentais em animais foram realizados sob aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Clínica Mayo.
1. Preparação da solução 
<ol><li>Prepare a solução de colagenase 2% (w/v) dissolvendo a colagemnase II 2 g na solução de sal balanceada (HBSS) de 100 mL da Hanks. Alíquota de 200 μL cada para cada uso.</li>
	<li>Prepare o meio de neutralização misturando 84 mL F-12 médio, 15 mL de serum de cavalo e penicilina/estreptomicina de 1 mL.</li>
	<li>Prepare o tampão de citometria de fluxo dissolvendo 500 mg de albumina de soro bovino (BSA) e 400 μL de 0,5 M EDTA em 100 mL da linha salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS).</li>
</ol>2. Dissecção da almofada de gordura epidídica e dissociação tecidual
<ol><li>Eutanize humanamente (luxação isoflurane/cervical) de um rato macho. Neste protocolo, foi usado um rato FVB de quatro meses de idade.</li>
	<li>Aplique/pulverize 70% de etanol no abdômen e exponha a cavidade abdominal inferior usando tesoura limpa e fórceps.</li>
	<li>Localizar almofada de gordura epidídica (proximal/ligada a testículos). Segure a junção entre testículos e almofada de gordura epidídica com fórceps contundentes e puxe suavemente para liberar a almofada de gordura epidídica.</li>
	<li>Remova os testículos cortando usando uma tesoura e incubar a almofada de gordura epidídica em 5 mL de HBSS suplementada com 3% de BSA em um tubo cônico de 50 mL em temperatura ambiente por 15 minutos.</li>
	<li>Centrifugar a 150 x g por 7 min a 4 °C.</li>
	<li>Pegue a almofada de gordura epidímica flutuante do tubo cônico de 50 mL e pique finamente o tecido usando uma tesoura limpa.</li>
	<li>Adicione 200 μL de solução de colagenase 2% em 3,8 mL de HBSS em um tubo de cultura de 13 mL. Adicione o tecido picado e incubar em uma incubadora rotativa a 5 rpm por 1h a 37 °C. Em vez de uma incubadora rotativa, a incubadora de cultura celular a 37 °C pode ser usada alternativamente com agitações ocasionais.</li>
	<li>Transfira o conteúdo inteiro para um tubo cônico de 50 mL e adicione 10 mL de meio de neutralização. Misture suavemente invertendo o tubo 2-3 vezes.</li>
	<li>Prepare outro tubo cônico de 50 mL equipado com um coador de células de 70 μm. Filtre o tecido digerido no novo tubo usando o coador celular.</li>
	<li>Transfira o fluxo para um tubo cônico de 15 mL e centrífuga a 350 x g por 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Remova cuidadosamente as pelotas de células supernascidas e resuspendas com 5 mL de DPBS. Centrifugar a 350 x g por 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o supernascimento e adicione 50 μL de tampão de citometria de fluxo. Misture bem por pipetar suavemente e mantenha as células no gelo. Devido ao volume das pelotas celulares e à pequena quantidade de supernanato residual, o volume total de células no tampão de citometria de fluxo será superior a 50 μL (aproximadamente 100 μL).</li>
</ol>3. Rotulagem de anticorpos e fluorescência ativada de classificação celular (FACS)
<ol><li>Depois de misturar bem as células com tubulação suave, transfira 54 μL da suspensão celular para um tubo de microcentrifuge de 1,7 mL. Adicione 6 μL de reagente de bloqueio fcr e misture bem por pipetar suavemente. Incubar a 4 °C por 10 min. Salve as células restantes depois de tomar 54 μL e mantenha-as no gelo para usar como um controle não manchado na etapa 3.5 e passo 3.6.</li>
	<li>Durante a incubação na etapa 3.1, prepare um coquetel de anticorpos combinando anticorpos de 11 μL cada um de anticorpos anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC e anticorpos anti-CD45-FITC em um tubo de microcentrifuuge. Misture bem com tubos suaves e mantenha no gelo protegido da luz.</li>
	<li>Após a incubação com o reagente de bloqueio fcr por 10 minutos, adicione 40 μL do coquetel de anticorpos e misture bem por pipetação suave. Incubar a 4 °C por 10 min.</li>
	<li>Adicione 500 μL de tampão de citometria de fluxo suplementado com 1 μg/mL de DAPI nas células manchadas. Misture bem por células de tubulação suaves e filtros usando um tubo de ensaio de 5 mL com tampa de encaixe do filtro celular. Mantenha células no gelo.</li>
	<li>Adicione 500 μL de tampão de citometria de fluxo às células remanescentes na etapa 3.1 e misture bem por tubulação suave. Células filtradoras usando um tubo de ensaio de 5 mL com tampa de encaixe do filtro celular. Mantenha essas células no gelo e use como um controle não manchado na etapa seguinte.</li>
	<li>Leve as células manchadas e o controle não manchado para análise ou instrumento de classificação FACS.<ol>
<li>Identifique e isole a população APC+/FITC-/DAPI- com estratégias de gating mostradas na Figura 1. Essas células representam células viável sca1+/Ter119-/CD31-/CD45. Detritos e agregados de células são esgotados usando parcelas para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC). Em seguida, o DAPI- população é fechada, seguido de gating de APC+/FITC- população. Os controles não manchados devem ser usados para auxiliar na definição de parâmetros de gating.</li>
		<li>Colete as células em 500 μL de tampão de citometria de fluxo em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL. Seguindo em frente, todos os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis para minimizar uma contaminação. Aproximadamente 50.000 – 100.000 células são coletadas de um rato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conte células usando um hemócito para avaliar a viabilidade celular. Uma vez que os agregados celulares podem interferir com novas análises a jusante, a presença de agregados celulares também é avaliada para garantir uma presença mínima (<5% do número celular viável) desses agregados.</li>
</ol>

<ol><li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li>
<li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+obesity+in+man%3A+cellular+character+of+the+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li>
<li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li>
<li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li>
<li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+as+a+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li>
<li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment%3A+going+back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li>
<li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561(2019).</li>
<li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li>
<li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636(2018).</li>
<li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501(2019).</li>
<li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li>
<li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li>
<li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li>
<li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219(2020).</li>
<li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057(2018).</li>
<li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li>
<li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li>
<li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) está rapidamente ganhando tração como uma ferramenta poderosa para estudar simultaneamente diversas populações celulares no nível único celular. Devido aos altos custos associados à preparação da amostra e ao sequenciamento de alto rendimento, é imperativo otimizar as entradas celulares (alta viabilidade e pureza) para aumentar a probabilidade de sucesso experimental. Alguns protocolos de preparação celular dependem da remoção de células mortas e detritos usando lavagen...

O tecido adiposo desempenha um papel fundamental no metabolismo energético. O excesso de energia é armazenado na forma de lipídios, e o tecido adiposo é capaz de expansão ou retração significativa, dependendo do estado nutricional e da demanda energética. A expansão do tecido adiposo pode resultar de um aumento no tamanho do adipócito (hipertrofia) e/ou de um aumento no número de adipócitos (hiperplasia); este último processo fortemente regulado pela proliferação e diferenciação das células progenitorasadiposas 1,2. Durante a obesidade, o tecido adiposo se expande excessivamente, e a disfunção tecidual – incluindo hipóxia, inflamação e resistência à insulina – muitas vezes desenvolve3,4. Essas complicações são fatores de risco para muitas doenças crônicas, incluindo hipertensão arterial, diabetes, doenças cardiovasculares, acidente vascular cerebral e câncer5. Assim, limitar a expansão descontrolada do tecido adiposo e mitigar as patologias do tecido adiposo são prioridades de pesquisa biomédica. Durante a expansão do tecido adiposo, as células-tronco derivadas do tecido adiposo residente (ASCs) proliferam e diferenciam-se sequencialmente em pré-adipócitos (células progenitoras comprometidas) e, em seguida, em adipócitos maduros6. Estudos recentes de sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) mostram que essas populações de células progenitoras adiposas (APC) (ASCs e preadipócitos) apresentam heterogeneidade molecular e funcional substancial7,8,9,10,11,12. Por exemplo, as ASCs apresentam uma capacidade de diferenciação adipogênica reduzida, ao mesmo tempo em que apresentam maiores capacidades de proliferação e expansão, em comparação com os pré-apócitos7. Outras diferenças moleculares são relatadas nas populações asc e pré-doença, embora a relevância funcional dessas diferenças ainda não esteja clara7. Juntos, esses dados destacam a complexidade do pool de células progenitoras adiposas e ressaltam a necessidade de desenvolver e padronizar ferramentas para melhor entender e manipular essas populações celulares críticas.
Este protocolo detalha o isolamento de populações de células progenitoras de alta viabilidade Sca1+ adiposas de blocos de gordura epidídica de camundongos que são adequados para análises sensíveis a jusante, incluindo estudos unicelulares (scRNA-sequenciamento) e cultura celular. O isolamento e dissociação de almofadas de gordura epidídica foi realizado como descrito anteriormente7,13 com pequenas modificações que melhoram a viabilidade de APCs isolados. Em suma, células dissociadas de almofadas de gordura epidídimo são manchadas com anticorpos contra Sca1, um marcador para ambos os ASCs e preadipócitos6,7, e outros marcadores de linhagem (Lin): Ter119 (células eritróides), CD31 (células endoteliais) e CD45 (leucócitos). As células Viável Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- são então classificadas por fluorescência ativada de classificação celular (FACS). É importante ressaltar que este protocolo foi validado pelo isolamento e análise bem-sucedidos de células progenitoras viáveis Sca1+/Lin- adiposas relatadas em um estudo recente de sequenciamento de RNA de célula única que identificou subpopulações funcionalmente heterogêneas dentro de ASCs e preadipócitos7.

<table><tbody><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,7 mL</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de cultura de 13 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-809-216</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 15 mL</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ensaio de 5 mL com tampa de pressão do filtro de células</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 mL</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; filtro de células m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31-FITC anticorpo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-519</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-FITC anticorpo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-491</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sca1-APC anticorpo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-833</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter119-FITC anticorpo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-908</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-500</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>F-12 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>Reagente bloqueador FcR</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hanks (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solução de iodeto de propídio</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de células progenitoras adiposas adiposas de tecidos adiposos epidímicos do rato

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesidade e distúrbios metabólicos, como diabetes, doenças cardíacas e câncer, estão todos associados à dramática remodelação do tecido adiposo. As células progenitoras adiposas residentes em tecido (APCs) desempenham um papel fundamental na homeostase tecidual e podem contribuir para a patologia do tecido. O uso crescente de tecnologias de análise celular única – incluindo sequenciamento de RNA unicelular e proteômica unicelular – está transformando o campo de células-tronco/progenitora, permitindo uma resolução sem precedentes de mudanças individuais de expressão celular no contexto de mudanças populacionais ou teciduais. Neste artigo, fornecemos protocolos detalhados para dissecar tecido adiposo epidímico do camundongo, isolar células derivadas de tecido adiposo único e realizar a triagem celular ativada de fluorescência (FACS) para enriquecer para Sca1+/CD31 viável-/CD45-/Ter119- APCs. Esses protocolos permitirão que os pesquisadores preparem APCs de alta qualidade adequados para análises a jusante, como sequenciamento de RNA de célula única.

Camundongos FVB machos de quatro meses de idade foram usados neste experimento. Após a exclusão de detritos e dobras utilizando lotes FSC/SSC, células viáveis (DAPI- população) foram fechadas, seguidas pela seleção de APC+/FITC- população (Figura 1). Os portões DAPI, APC e FITC foram desenhados com base no controle não manchado. As estratégias de gating são mostradas na Figura 1.
Após 1h de triagem, a ...

Apresentamos um método simples para isolar células progenitoras adiposas altamente viáveis de almofadas de gordura epidímica do rato usando a triagem celular ativada por fluorescência.

Preparação de células progenitoras adiposas adiposas de tecidos adiposos epidímicos do rato

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Este protocolo torna possível isolar células progenitoras adiposas de alta qualidade do tecido adiposo epididimal de camundongo para análise sensível a jusante. Esta técnica produz células progenitoras adiposas altamente viáveis e foi validada em um recente estudo de sequenciamento de RNA de célula única. Depois de sacrificar o camundongo macho, localize a almofada de gordura do epidídimo e puxe-a suavemente com uma pinça romba para deliberá-la.Use uma tesoura para remover os testículos e incubar a almofada de gordura epididimal em cinco mililitros de HBSS suplementado com 3% BSA em um tubo cônico de 50 mililitros por 15 minutos. Após a incubação, centrifugar o tubo a 150 x g durante sete minutos a quatro graus Celsius. Remova a almofada de gordura do epidídimo flutuante do tubo cônico e pique-a finamente com uma tesoura limpa.Adicione 200 mililitros de solução de 2% de colagenase a 3,8 mililitros de HBSS em um tubo de cultura de 13 mililitros. Em seguida, adicione o tecido picado e incube-o em uma incubadora rotativa a cinco RPM por uma hora a 37 graus Celsius. Transfira todo o conteúdo para um tubo cônico de 50 mililitros e adicione 10 mililitros de meio de neutralização.Misture delicadamente invertendo o tubo duas a três vezes. Prepare outro tubo cônico de 50 mililitros equipado com um filtro de células de 70 micrômetros e filtre o tecido digerido no novo tubo. Transfira o fluxo para um tubo de 15 mililitros e centrífugas a 350 x g por 10 minutos a quatro graus Celsius.Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular com cinco mililitros de DPBS. Em seguida, centrifugue o tubo por mais 10 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante e adicione 50 microlitros de tampão de citometria de fluxo.Misture as células pipetando suavemente e mantenha-as no gelo. O volume total das células no tampão de citometria de fluxo será de aproximadamente 100 microlitros. Depois de misturar as células, transfira 54 microlitros da suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro.Adicione seis microlitros de reagente bloqueador de FCR e pipete delicadamente para misturar. Em seguida, incube o tubo a quatro graus Celsius por 10 minutos. Mantenha as células restantes no gelo para usar como controle não corado.Durante a incubação, prepare um coquetel de anticorpos combinando 11 microlitros de anticorpos anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC e anti-CD45-FITC em um tubo de microcentrífuga. Pipete suavemente a mistura e mantenha-a no gelo protegida da luz. Após a incubação com o reagente bloqueador FCR, adicione 40 microlitros do coquetel de anticorpos e misture bem com pipetagem suave.Incube as células a quatro graus Celsius por mais 10 minutos. Adicione 500 microlitros de tampão de citometria de fluxo suplementado com um micrograma por mililitro de DAPI nas células da coloração. Misture bem e filtre as células usando um tubo de ensaio de cinco mililitros com uma tampa de pressão do filtro de células.Em seguida, mantenha as células no gelo. Adicione 500 microlitros de tampão de citometria de fluxo às células não coradas e misture pipetando suavemente. Use um tubo de ensaio de cinco mililitros com uma tampa de pressão do filtro de células para filtrar as células e mantê-las no gelo.Transporte as células coradas e o controle não corado para o instrumento de análise ou classificação FACS. Identifique e isole a população APC-positiva, FITC negativa e DAPI-negativa usando as estratégias de gating descritas no manuscrito do texto. Use os controles não manchados para ajudar na configuração de parâmetros de gating.Após a exclusão de detritos e dupletos usando gráficos FSC-SSC, as células viáveis foram fechadas seguidas pela seleção da população APC-positiva e negativa para FITC. As comportas DAPI, APC e FITC foram desenhadas com base no controle não corado. Os resultados a seguir mostram o isolamento de células progenitoras adiposas de camundongos FVB machos de quatro meses de idade.Após uma hora de triagem, a qualidade do isolamento foi avaliada quantitativamente por análise de citometria de fluxo, que demonstrou que as células mantiveram alta viabilidade e pureza. A análise sensível a jusante pode ser realizada após este protocolo, como sequenciamento de RNA de célula única, PCR quantitativo em tempo real e citometria de fluxo. Isso permitirá uma caracterização mais aprofundada das células progenitoras adiposas.As células progenitoras adiposas são populações heterogêneas que requerem mais estudos unicelulares. Este método permite isolar as células adequadas para estudos de células únicas.

preparation-adipose-progenitor-cells-from-mouse-epididymal-adipose

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar e cultivar células-tronco derivadas do tecido adiposo do arco periaórtico murino marcadas com fluorescência (ADSCs) do tecido adiposo do arco periaórtico murino. Após o isolamento, os NCADSCs são detectados, classificados usando classificação de células ativadas por fluorescência e, posteriormente, cultivados em uma placa, promovendo a proliferação celular.

Isolando células-tronco derivadas de tecido adiposo do tecido adiposo periaórtico murino

Aqui, relatamos um método para o isolamento das populações de células progênitentes de adipócitos (APC) do tecido de tecido adiposo perivascular (PVAT) usando a classificação celular celular ativada por magnética (MCS). Este método permite um maior isolamento de APC por grama de tecido adiposo quando comparado à Classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).

Expansão e adipogênese Indução de progenitores de adipócitos do tecido adiposo perivascular isolado pela classificação de células ativadas magnéticas

A diferenciação dos adipócitos brancos e bege de tecido adiposo vascular progenitores tem potencial para melhoria metabólica em obesidade. Descrevemos os protocolos para um CD34 + CD31 + isolamento de células endoteliais de gordura humana e uma subsequente em vitro expansão e diferenciação em adipócitos brancos e bege. Diversas aplicações a jusante são discutidas.

Isolamento, expansão e indução de Adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de tecido adiposo humano de Omental e subcutâneo

Este protocolo descreve a abordagem técnica para isolar subpopulações de células estromais adipogênicas e fibroinflamatórias de depósitos de tecido adiposo branco intra-abdominal murino (WAT) por classificação de células ativadas por fluorescência ou separação de esferas imunomagnéticas.

Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos

Este relatório descreve um protocolo para o isolamento simultâneo de preadipócitos primários marrons e brancos de camundongos recém-nascidos. Células isoladas podem ser cultivadas na cultura e induzidas a se diferenciar em adipócitos brancos e marrons totalmente maduros. O método permite a caracterização genética, molecular e funcional das células de gordura primárias na cultura.

Isolamento e diferenciação de preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos

Este protocolo descreve o isolamento de pré-adipócitos de camundongos da gordura subcutânea, sua diferenciação em adipócitos maduros e a indução de resistência à insulina. A ação da insulina é avaliada pela fosforilação/ativação de membros da via de sinalização da insulina através do western blot. Este método permite a determinação direta da resistência/sensibilidade à insulina em adipócitos primários.

Adipócitos diferenciados de camundongos em cultura primária: um modelo de resistência à insulina

Os pré-adipócitos são isolados da fração vascular estromal do tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos e diferenciados em células que acumulam gotículas lipídicas, expressam marcadores moleculares e mostram a morfologia mitocondrial de adipócitos marrons maduros. Essas células são posteriormente analisadas por imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão.

Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos

O tecido adiposo é uma excelente fonte de células-tronco mesenquimais. Aqui, trazemos a extração, cultivo e caracterização passo a passo de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) do tecido adiposo epididimal de camundongos suíços.

Isolamento, expansão in vitro e caracterização de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo epididimal de camundongos

O tamanho e a fragilidade dos adipócitos maduros limitaram as técnicas e ferramentas disponíveis para seu estudo e isolamento. Aqui, é descrito um protocolo para o isolamento de adipócitos murinos maduros, que pode ser facilmente adaptado para diferentes depósitos adiposos e dietas de camundongos.

Isolamento e cultura de adipócitos murinos primários de camundongos magros e obesos

Gerando pluripotentes induzidas de células-tronco (IPSC) produz linhas de linhas de diferentes potencial de desenvolvimento, mesmo quando eles passam por testes padrão pluripotência. Aqui nós descrevemos um protocolo para produzir ratos derivadas inteiramente de iPSCs, que define as linhas iPSC como possuindo pluripotência...

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Aprenda a isolar células progenitoras adiposas de tecido adiposo epididímico de camundongo usando FACS. Este método garante alta viabilidade e pureza celular para análises downstream sensíveis como sequenciamento de RNA single-cell.

Preparação de células progenitoras adiposas adiposas de tecidos adiposos epidímicos do rato

Explorar mais vídeos