Name: Mudanças de temperatura incremental para reprodução e desova máxima em Astyanax mexicanus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Aprenda a estimular a desova máxima em Astyanax mexicanus usando um regime de temperatura incremental. Este protocolo laboratorial permite obter embriões transparentes para estudos de biologia do desenvolvimento e evolução.

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Agradecemos a David Martasian, Diedre Heyser, Amy Parkhurst, Craig Foote e Mandy Ng por contribuições valiosas para o laboratório Jeffery A. mexicanus culture facility. A pesquisa no laboratório Jeffery é atualmente apoiada pela concessão do NIH EY024941.

Este procedimento foi aprovado pelas diretrizes de Cuidados Institucionais de Animais da Universidade de Maryland, College Park (Atualmente IACUC 469 #R-NOV-18-59; Projeto 1241065-1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61708/61708fig1.jpg"> Figura 1. Calendários durante uma semana de reprodução e uma semana sem reprodução. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61708/61708fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
1. Segunda-feira
<ol><li>Às 9h10, realize testes de água e etapas 1.1.1-4 abaixo.<ol>
<li>Grave as temperaturas da sala, do tanque e do reservatório usando um termômetro.</li>
		<li>Registre os níveis de amônia, nitrato e nitrato com um kit de teste colorimétrico.</li>
		<li>Regisso o pH do sistema de monitoramento, bem como o kit de teste colorimétrico.</li>
		<li>Registosos do monitor carboy e do monitor do sistema principal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A partir das 10:00, alimente todos os peixes.<ol>
<li>Alimente todos os peixes no sistema adulto com flocos de tetra, esmagando os flocos nos tanques com peixes jovens. Alimente apenas tantos flocos quanto um tanque de peixe pode consumir completamente em 3-5 minutos, cerca de uma "pitada de dedo".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verifique a incubadora usada para abrigar dedos de embriões em desenvolvimento e troque a água, se necessário.<ol>
<li>Abra a incubadora de embriões e verifique os níveis de água em todos os reservatórios. Se eles estão ficando sem água, adicione água do sistema. Verifique as configurações de temperatura da incubadora. Levante os embriões a 73-77 °F (23-25 °C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alimentação ao vivo limpa.<ol>
<li>Para limpar as larvas, remova as bacias de Tupperware descobertas contendo suas culturas da geladeira de alimentação ao vivo e despeje o excesso de água acima dos aglomerados de vermes na pia. Usando água destilada, suspenda e enxágue os vermes repetidamente até que a água de derramamento esteja limpa.</li>
		<li>Adicione água limpa suficiente para que os aglomerados de vermes estejam cerca de metade cobertos. Substitua os vermes restantes na geladeira de alimentação ao vivo, descobertos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alimente peixes.<ol>
<li>Pelo menos 30 minutos após a primeira alimentação, alimente os peixes nos tanques em que a reprodução é desejada com flocos de gema de ovo, vermes negros, ou ambos. Adicione um "dedo" de flocos de gema por tanque. Adicione aglomerados de vermes-negros suficientes para permitir que cada peixe no tanque consuma cerca de 5-10 vermes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Às 10:00 às 13:00, a temperatura da água é de 74 °F.</li>
	<li>Esfregue os tanques de reprodução conforme necessário e coloque as redes de reprodução.</li>
	<li>Limpe os tanques e coloque as redes pelo menos uma hora após a última alimentação. Limpe todos os tanques em que as redes são colocadas de antemão. Coloque as redes de reprodução cuidadosamente para não interferir com o fornecimento de ar para o tanque.</li>
</ol>2. Terça-feira
<ol><li>Recolhe os embriões e lava todas as redes de reprodução.<ol>
<li>Às 9:10 am, remova as redes de reprodução do fundo dos tanques do sistema adulto. Enxágue suavemente os embriões em uma rede portátil usando a mangueira presa ao carboy, e inverta a rede portátil em uma tigela de água limpa do sistema para expulsar os embriões.</li>
		<li>Colete e lave cada conjunto de embriões e, em seguida, coloque em uma tigela de água limpa do sistema contendo 0,00003% azul de metileno (água azul). Se houver um número excepcionalmente grande de embriões de um único tanque, separe-os em várias tigelas. A concentração de embriões vivos deve ser de cerca de 100 por 200 mL de água azul em cada dedo.</li>
		<li>Estime o tempo de fertilização encenando os embriões sob um microscópio usando a tabela de tempo de desenvolvimento A. mexicanus publicada17.</li>
		<li>Monitore as tigelas contendo embriões com frequência. Remova embriões e detritos mortos ou deformados, como alimentos não comidos ou fezes, com uma pipeta Pasteur. Troque a água azul em dedos com frequência.</li>
		<li>Coloque as tigelas em uma incubadora por 5-7 dias. Neste momento, a gema tem sido usada e a alimentação de culturas com camarão de salmoura viva é necessária para o desenvolvimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pegue dados de desova.<ol>
<li>Para cada tanque que derruba embriões, regisse as seguintes informações.<ol>
<li>Regissua a data e o número do tanque.</li>
			<li>Regisso número aproximado de embriões caiu (Figura 2): Alto (500+) Médio (200-500) Baixo (&lt;200)</li>
			<li>Registo da qualidade dos embriões caiu (Figura 2): Alta (&gt;75% viva) Médio (25-50% vivo) Baixo (&lt;25% vivo)</li>
			<li>Estime o tempo original de desova consultando a tabela de encenação astyanax mexicanus 17.</li>
			<li>Regissu o recorde da temperatura que o sistema foi definido quando o peixe desovar.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alimente todos os peixes.</li>
	<li>Coloque a temperatura da água em 76 °F.</li>
	<li>Prepare a transmissão ao vivo.</li>
	<li>Alimente peixes #2.</li>
	<li>Colher alimentos e detritos em excesso de tanques e esfregar antes de repor redes.</li>
</ol>3. Quarta-feira
<ol><li>Repita as etapas 2.1-2.2. Colete embriões e lave todas as redes de reprodução.</li>
	<li>Pegue dados de desova como antes.</li>
	<li>Faça testes de água como antes.</li>
	<li>Alimente todos os peixes.</li>
	<li>Coloque a temperatura da água em 78 °F.</li>
	<li>Prepare a transmissão ao vivo.</li>
	<li>Verifique os embriões na incubadora.<ol>
<li>Limpe e troque a água dos embriões em dedos que eventualmente serão usados para repor o estoque geral de reprodução de adultos. Use água do sistema tratado com azul de metileno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alimente peixes de novo.</li>
	<li>Limpe os tanques conforme necessário e reinicie as redes.</li>
</ol>4. Quinta-feira
<ol><li>Repita as etapas 2.1-2.2. Coletar embriões e lavar e armazenar redes de reprodução.</li>
	<li>Pegue dados de desova como antes.</li>
	<li>Coloque a temperatura da água em 76°F.</li>
	<li>Limpe a transmissão ao vivo.</li>
	<li>Limpe todos os tanques individuais.</li>
	<li>Verifique os embriões na incubadora.</li>
	<li>Alimente peixes #2.</li>
</ol>5. Sexta-feira
<ol><li>Alimente todos os peixes.</li>
	<li>Afina a temperatura da água para 74 °F.</li>
	<li>Limpe a transmissão ao vivo.</li>
	<li>Verifique os embriões na incubadora.</li>
</ol>Sábado, 6.
<ol><li>Alimente peixes.</li>
</ol>Domingo, 7.
<ol><li>Alimente peixes.</li>
</ol>

<ol><li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavefish+as+a+model+system+in+evolutionary+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cavefish as a model system in evolutionary developmental biology.</a> Developmental Biology. 231, 1-12 (2001).</li>
<li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+model+systems+in+evo-devo%3A+cavefish+and+mechanisms+of+microevolution%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Emerging model systems in evo-devo: cavefish and mechanisms of microevolution.</a> Evolution & Development. 10, 265-272 (2008).</li>
<li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+development+in+the+cavefish+Astyanax%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution and development in the cavefish Astyanax.</a> Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).</li>
<li>Protas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+cavefish+reveals+molecular+convergence+in+the+evolution+of+albinism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism.</a> Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).</li>
<li>Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C. J., Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regressive+evolution+in+the+Mexican+cave+tetra%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus.</a> Current Biology. 17, 452-454 (2007).</li>
<li>O'Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+genetic+analysis+of+retinal+degeneration+in+the+blind+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish.</a> PLoS ONE. 8 (2), 57281(2013).</li>
<li>Yoshizawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+genetic+architecture+underlies+the+emergence+of+sleep+loss+and+prey-seeking+behavior+in+the+Mexican+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish.</a> BMC Biology. 13, 15(2015).</li>
<li>Elliot, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Astyanax+caves+of+Mexico.+Cavefishes+of+Tamaulipas%2C+San+Luis+Potosi%2C+and+Guerrero%5BTitle%5D)+AND+%22Association+for+Mexican+Cave+Studies+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The Astyanax caves of Mexico. Cavefishes of Tamaulipas, San Luis Potosi, and Guerrero.</a> Association for Mexican Cave Studies Bulletin. 26, 1(2018).</li>
<li>Luo, S., Wu, B., Xiong, X., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+hardness+and+calcium%3Amagnesium+ratio+of+water+during+early+stages+of+rare+minnows+%28Gobiocypris+rarus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of total hardness and calcium:magnesium ratio of water during early stages of rare minnows (Gobiocypris rarus).</a> Comparative Medicine. 66, 181-187 (2016).</li>
<li>Balasch, J. C., Tort, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+the+stress+responses+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Netting the stress responses in fish.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 62(2019).</li>
<li>Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBorowsky%2C+R+%22Determining+the+sex+of+adult+Astyanax+mexicanus%22">Determining the sex of adult Astyanax mexicanus</a>. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).</li>
<li>Paschos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+clocks%2C+feeding+time%2C+and+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Circadian clocks, feeding time, and metabolic homeostasis.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 112(2015).</li>
<li>Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+control+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Circadian control of the immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 13, 190-198 (2013).</li>
<li>Williams, M. B., Watts, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+basis+and+future+directions+of+zebrafish+nutrigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Current basis and future directions of zebrafish nutrigenomics.</a> Genes & Nutrition. 14, 34(2009).</li>
<li>Harper, C., Wolf, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+effects+of+the+stress+response+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Morphologic effects of the stress response in fish.</a> ILAR Journal. 50, 387-396 (2009).</li>
<li>Neubauer, P., Andersen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+performance+in+fish+is+explained+by+an+interplay+between+physiology%2C+behavior+and+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Conservation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Thermal performance in fish is explained by an interplay between physiology, behavior and ecology.</a> Conservation Physiology. 7 (1), 025(2019).</li>
<li>Hinaux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+staging+table+for+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Developmental staging table for Astyanax mexicanus.</a> Zebrafish. 8 (4), (2011).</li>
<li>Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBorowsky%2C+R+%22In+vitro+fertilization+of+Astyanax+mexicanus%22">In vitro fertilization of Astyanax mexicanus</a>. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).</li>
<li>Simon, V., Hyacinthe, C., Rétaux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+behavior+in+the+blind+Mexican+cavefish+and+its+river-dwelling+conspecific%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific.</a> PLoS One. 14 (2), 0212591(2019).</li>
<li>Harvey, B. J., Carolsfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Breeding+in+Tropical+Fish+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Development+Research+Centre%22%5BJournal%5D)">Induced Breeding in Tropical Fish Culture.</a> International Development Research Centre. , (1993).</li>
<li>Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+a+lens+survival+pathway+including+sox2+and+aA-crystallin+in+the+evolution+of+cavefish+eye+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">The role of a lens survival pathway including sox2 and aA-crystallin in the evolution of cavefish eye degeneration.</a> EvoDevo. 5, 28(2014).</li>
<li>Krishnan, J., Rohner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavefish+and+the+basis+for+eye+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cavefish and the basis for eye loss.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 5 (372), 20150487(2017).</li>
<li>Bilandžija, H., Abraham, L., Ma, L., Renner, K., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+changes+controlled+by+catecholaminergic+systems+explain+recurrent+loss+of+pigmentation+in+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society%22%5BJournal%5D)">Behavioral changes controlled by catecholaminergic systems explain recurrent loss of pigmentation in cavefish.</a> Proceedings of the Royal Society. 285, (2018).</li>
<li>Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+using+TALENs+in+blind+Mexican+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish.</a> PLoS ONE. 1093, 0119370(2015).</li>
<li>Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+mutagenesis+confirms+the+role+of+oca2+in+melanin+pigmentation+in+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus.</a> Developmental Biology. 441, 313-318 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Astyanax mexicanus é um novo modelo biológico que gera com frequência e pode ser criado facilmente no laboratório1,2. Como estamos interessados nos mecanismos de desenvolvimento que estão por trás de mudanças evolutivas em peixes das cavernas A. mexicanus, a produção e o uso de embriões é vital para nossos objetivos de pesquisa. O objetivo principal de manter um estoque adulto de peixes é a produção de embriões e frituras jovens para uso em expe...

O teleost Astyanax mexicanus tem uma forma de habitação superficial (peixes superficiais) e muitas diferentes cavernas cegas (peixes das cavernas)formam 1,2. Os peixes das cavernas evoluíram na escuridão perpétua e sob limitações alimentares, resultando no aparecimento de novos traços construtivos e regressivos3. Os traços construtivos incluem aumentos no gosto e tamanho da mandíbula, órgãos sensoriais da linha lateral e reservas de gordura. Os traços regressivos incluem a perda ou redução da pigmentação de melanina, olhos e comportamentos, como sono, escolaridade e agressão. Um atributo do sistema Astyanax é a fertilidade completa entre as duas formas, permitindo o uso de mapeamento de traço quantitativo loci (QTL) para determinar a região genômica(s) associada à evolução construtiva e regressiva4,5,6,7. A. mexicanus oferece um sistema vantajoso para estudar o desenvolvimento porque pode ser induzido a desovar com frequência em laboratório. Os embriões de A. mexicanus são translúcidos, ligeiramente maiores que os de zebrafish, produzidos em grandes quantidades, e se desenvolvem em adultos sexualmente maduros em aproximadamente 8-12 meses. Seu período de capacidade máxima de desova é de cerca de 5 anos. Este protocolo descreve o fluxo de trabalho necessário em uma instalação de cultura A. mexicanus durante uma semana típica de reprodução e inclui os detalhes da manutenção do sistema de peixes e o regime de controle de temperatura para desova máxima.
A. mexicanus é um peixe tropical que vive em rios originários de calcários (peixes superficiais) e em piscinas em cavernas de calcário (peixes-caverna)8. O calcário dissolve-se para produzir água dura, e A. mexicanus prospera em água dura. Peixes adaptados a condições de água dura podem tolerar uma série de condições salgadas, mas geralmente se reproduzem em específicas9. A indução do comportamento de desova é realizada por uma combinação de fatores. Como os peixes são a sangue frio e dependem de seu ambiente para manter a homeostase, seu metabolismo é sensível às mudanças ambientais e eles reagem mais rapidamente aos estressores10. A. mexicanus deve ser cultivado em sistemas aquáticos sob condições cuidadosamente reguladas de fluxo de água, pH, condutividade, pressão osmótica, iluminação e temperaturas da água.
No laboratório Jeffery, os peixes são mantidos em dois sistemas de água corrente: (1) um "sistema de bebês" para peixes adultos jovens antes da maturidade sexual e (2) um sistema adulto (ou principal) para adultos sexualmente maduros e reprodutores. O "sistema baby" consiste em tanques de 8 L e 15 L fornecidos com água corrente. O "sistema de bebês" é semeado por jovens jovens metamorfosizados cultivados a partir de larvas em tanques menores (1-10 L), nos quais a água é trocada semanalmente. Larvas, fritas e juvenis são extremamente dependentes de alimentos e devem ser alimentadas com comida viva (camarão salgado) uma vez por dia para garantir uma alta taxa de sobrevivência. Jovens jovens do "sistema de bebês" são colocados no sistema adulto após cerca de 1-1,5 anos. Em um primeiro momento, são alimentados com flocos de tetra pulverizados, e após um crescimento adicional são transferidos para o regime regular de alimentação de adultos. A maturidade sexual pode ser avaliada pelo volume abdominal em mulheres, e os métodos para determinar o sexo foram descritos11. No sistema adulto, a água é trocada automaticamente em tanques de 42 L 3 vezes por período de 24 horas. O sistema adulto é monitorado diariamente por inspeção visual e leituras automáticas de temperatura, pH e condutividade de sondas. O pH ideal é em torno de 7,4 e pode variar entre 6,8-7,5, a temperatura base do sistema é de 72/73 °F, e a condutividade ideal varia entre 600-800 mS. Leituras automáticas são exibidas em uma tela controladora, e verificações visuais da pressão da água são lidas em medidores de fluxo distribuídos por todo o sistema. Verificações independentes sobre a qualidade da água são feitas semanalmente testando a temperatura e medindo parâmetros de qualidade da água para pH, amônia e nitrato usando um teste colorimétrico. Os níveis de amônia e nitrato são mantidos em ou perto de zero, adicionando bactérias benéficas (por exemplo, Ciclo Nutafin) ao sistema. A iluminação da sala é controlada por um temporizador ajustado a períodos de luz e 10 horas escuras de 14 horas. Além dos parâmetros gerais de qualidade da água mencionados acima, as seguintes considerações precisam de atenção especial durante uma semana de reprodução.
A primeira consideração é o fotoperóuodo, pois os peixes (até mesmo peixes-caverna em laboratório) dependem de ciclos de luz para definir seu relógio circadiano. Os ritmos circadianos podem afetar tudo, desde a reprodução e alimentação até a saúde do sistema imunológico12,13 e devem ser consistentes para o máximo de benefícios para a saúde. Os peixes são mantidos em um sistema de água corrente em um fotoperíodo escuro de 14 horas e luz. Os peixes superficiais geralmente começam a desovar uma hora após o sistema ter sido escurecido, e a luz introduzida durante este período pode interferir e terminar a desova. A desova de peixes cegos das cavernas é menos perturbada pela luz. Em comparação com a desova de peixes superficiais, a desova de peixes das cavernas é adiada, geralmente começando de quatro a cinco horas após o sistema ter sido escurecido.
A segunda consideração é a nutrição. Peixes adultos são normalmente alimentados com uma dieta de tetra flocos uma vez por dia. Antes da desova, os peixes são alimentados com uma dieta rica em proteínas complementada com quantidades extras de flocos de tetra e outros alimentos: flocos de gema de ovo e ocasionalmente vermes-pretos da Califórnia vivos(Lumbriculus variegatus) para compensar a perda de proteínas devido à produção de ovos durante o ciclo anterior de desova. Durante a semana de reprodução, os peixes são alimentados duas vezes por dia, uma pela manhã e outra à tarde/noite. A alimentação de peixes apenas uma vez por dia, mas com uma única porção muito grande de alimentos deve ser evitada, pois isso pode causar desnutrição14.
A terceira consideração é o espaço. Os requisitos do espaço baseiam-se na massa corporal média de um adulto, bem como em considerações comportamentais, como se os peixes têm comportamento de escolaridade ou comportamento agressivo. Tanques superlotados ou sub-aglomerados podem levar a uma maior agressão e estresse constante, tornando os peixes vulneráveis a ferimentos de seus companheiros de tanque e relutantes em participar na desova15. Normalmente abrigamos 10-20 peixes por tanque 42 L.
A quarta consideração é a temperatura. Como mencionado acima, os peixes são animais de sangue frio e dependem do meio ambiente para manter a temperatura corporal. Como a temperatura tem um efeito direto nos processos metabólicos, mudanças de temperatura podem desencadear alterações comportamentais em peixes16. Este programa de reprodução consiste em ciclos de duas semanas de temperatura: a primeira semana introduz um pico de temperatura para 78 °F, e a próxima semana mantém uma temperatura estática de 72 °F. Durante a primeira semana (de reprodução), redes de reprodução com bordas plásticas são colocadas no fundo dos tanques todas as noites. As redes de reprodução servem como uma barreira entre os peixes nos tanques e os ovos desovados, que de outra forma seriam consumidos. A temperatura é elevada de 2 °F por dia para uma máxima de 78 °F até o meio da semana, e a desova é induzida de acordo com o ciclo de luz nas primeiras 2-3 noites desta semana. A temperatura é então reduzida em incrementos de 2 °F para 72 °F durante os demais dias da semana, e a temperatura base é mantida até o início da próxima semana de reprodução. A reprodução geralmente é estimulada não mais do que duas vezes por mês para permitir que o peixe se recupere.
No geral, este método permite a desova de grandes quantidades de embriões da mais alta qualidade durante um período mais longo de tempo.

<table><tbody><tr><td>Blackworms</td><td>Eastern Aquatics, Lancaster, PA</td><td>Nenhum</td><td></td></tr><tr><td>Redes de reprodução</td> Ovos de artêmia <td>feitos sob medida</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>AquaCave Lake Forest, IL.</td><td>Nenhum</td><td></td></tr><tr><td>kit de teste colorimétrico</td><td>Petco</td><td>SKU:11916</td><td>API Kit de teste de pH de água doce</td></tr><tr><td>Flocos de gema de ovo</td><td>Pentair, Minneapolis, MN</td><td>Nenhum</td><td></td></tr><tr><td>Fingerbowls</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>741004</td><td>pratos de cultura, 4,5 pol, 250 mL</td></tr><tr><td>Redes portáteis</td><td>Qualquer incubadora de pet shop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>para embriões</td><td>Fisher Scientific</td><td>51-029-321HPM</td><td>405 L</td></tr><tr><td>Sais marinhos oceânicos instantâneos</td><td>Spectrum Brands, Blacksburg, VA</td><td>Nenhum</td><td></td></tr><tr><td>Azul de Metileno</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20</td><td>5.75 pol.</td></tr><tr><td>Solução de imersão líquida</td><td>Qualquer Pet Store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutrafin Cycle</td><td>Amazon</td><td>Nenhum</td><td>Impulso bacteriano</td></tr><tr><td>Geladeira para alimentação ao vivo</td><td>Qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termômetro</td><td>Qualquer fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetra Tropical Crisps</td><td>Spectrum Brands, Blacksburg, VA</td><td>Nenhum</td><td></td></tr></tbody></table>

mudanças de temperatura incremental para reprodução e desova máxima em astyanax mexicanus

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

O tetra mexicano, Astyanax mexicanus,é um sistema modelo emergente para estudos em desenvolvimento e evolução. A existência de morfas de superfície de olhos (peixes superficiais) e cavernas cegas (peixes-caverna) nesta espécie apresenta uma oportunidade para interrogar os mecanismos subjacentes à evolução morfológica e comportamental. Os peixes das cavernas desenvolveram novos traços construtivos e regressivos. As mudanças construtivas incluem aumentos nas papilas gustativas e mandíbulas, órgãos sensoriais de linha lateral e gordura corporal. As mudanças regressivas incluem perda ou redução de olhos. pigmentação de melanina, comportamento de escolaridade, agressão e sono. Para interrogar experimentalmente essas mudanças, é crucial obter um grande número de embriões gerados. Desde que os peixes originais da superfície de A. mexicanus e peixes das cavernas foram coletados no Texas e no México na década de 1990, seus descendentes têm sido rotineiramente estimulados a procriar e desovar um grande número de embriões bimestriamente no laboratório Jeffery. Embora a reprodução seja controlada pela abundância e qualidade dos alimentos, ciclos claro-escuros e temperatura, descobrimos que as mudanças de temperatura incrementais desempenham um papel fundamental no estímulo à desova máxima. O aumento gradual da temperatura de 72 °F para 78 °F nos primeiros três dias de uma semana de reprodução fornece dois ou três dias consecutivos de desova com números máximos de embriões de alta qualidade, que é seguido por uma diminuição gradual da temperatura de 78 °F para 72 °F durante os últimos três dias da semana de desova. Os procedimentos mostrados neste vídeo descrevem o fluxo de trabalho antes e durante uma semana de reprodução laboratorial para desova estimulada pela temperatura incremental.

Nós geralmente criamos e desoríamos os descendentes de peixes superficiais originalmente coletados em Nacimiento del Rio Choy em San Luis Potosi, México (peixe superficial rio Choy) e San Solomon Springs em Balmorhea State Park, Texas (peixes de superfície do Texas) e peixes-caverna derivados de Cueva de El Pachón (peixe da caverna Pachón) em Tamaulipas, México, e Cueva de los Sabinos (los Sabinos peixe das cavernas) e Sotano de la Tinaja (peixe da caverna Tinaja) em San Luis Potosi México.
Ao...

Este artigo descreve as condições básicas de laboratório e protocolos para um regime de temperatura incremental para estimular a desova máxima no tetra mexicano Astyanax mexicanus, que é um modelo emergente para estudos de desenvolvimento e evolutivos.

Mudanças de temperatura incremental para reprodução e desova máxima em Astyanax mexicanus

The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, is an emerging model system for studies in development and evolution. The existence of eyed surface (surface fish) ...

Assim como o Astyanax mexicanas é um peixe pequeno. É nativa do nordeste do México e sul do Texas. O importante é que ele existe de duas formas.Uma forma é um peixe que habita a superfície que tem olhos grandes e pigmentação, e a outra forma é um peixe que habita cavernas que perdeu os olhos e perdeu sua pigmentação. Eles ainda são capazes de desovar, de hibridizar uns com os outros, para que possam ser usados em uma análise genética avançada para estudar genética e desenvolvimento. Também possuem grandes embriões transparentes, e podem ser usados para estudar biologia comparativa do desenvolvimento.Então eles têm sido usados por muitos anos agora como um sistema para entender a evolução do desenvolvimento. Vários dias antes da desova ser desejada, começamos a alimentar melhor os peixes. Também aumentamos a temperatura gradualmente, de tal forma que, no momento em que queremos que eles desovam, eles se submeterão a cerca de dois ou três dias de desova excessiva, produzindo um grande número de embriões fertilizados que se desenvolvem bem e através dos estágios larvais para adultos.Depois de alimentar os peixes às 10:00 da .m. com uma pitada de flocos de Tetra, verifique a incubadora que será usada para abrigar tigelas de dedos de embriões em desenvolvimento e troque a água se necessário. Verifique o nível de água em todos os reservatórios e adicione água do sistema a todos os reservatórios que estão ficando sem água.Em seguida, coloque a incubadora a 23 graus Celsius Pelo menos 30 minutos após a primeira alimentação, alimente os peixes nos tanques de reprodução com uma pitada de flocos de gema de ovo, aglomerados de vermes negros suficientes para permitir que cada peixe no tanque consuma cerca de cinco a 10 vermes ou ambos. Pelo menos uma hora após a segunda alimentação, esfregue os tanques de reprodução conforme necessário e cuidadosamente montou redes de reprodução sem interferir no suprimento de ar do tanque. Na manhã seguinte, remova as redes de reprodução dos fundos dos tanques do sistema adulto entre 9:00 e 10:00 da manhã.m.e use a mangueira presa ao para enxaguar suavemente os embriões em uma rede portátil. Inverta a rede em uma tigela de água limpa do sistema e transfira cerca de 100 embriões por tigela de dedo em 200 mililitros de água limpa do sistema suplementada com 0,00003% azul de metileno. Encenou os embriões sob um microscópio leve para estimar o tempo de fertilização de acordo com o cronograma de desenvolvimento da A-mexicanas.Após a encenação, coloque as tigelas de dedo em uma incubadora por cinco a sete dias e alimente as culturas com camarão de salmoura vivo. Para cada tanque que derrubou embriões, regisque a data e o número do tanque e regisse o número e a qualidade dos embriões caiu. Regisso tempo médio de desova de acordo com a tabela de encenação e registo da temperatura do sistema no momento em que o peixe desova.Monitore as tigelas de dedos dos embriões ao longo do dia, usando uma pipeta de pastagem para remover quaisquer embriões e detritos mortos ou deformados, como alimentos não comidos ou fezes, e mudando a água azul conforme necessário. Às 13:00.m. alimentam os peixes nos tanques de reprodução como demonstrado e definem a temperatura da água para 24 graus Celsius.Em seguida, remova qualquer excesso de alimentos e detritos dos tanques e esfregue os tanques antes de redefinir as redes. Na quarta e quinta-feira, repita a coleta e avaliação do embrião, conforme demonstrado para terça-feira. Alimente os peixes e coloque a água na temperatura apropriada.Verifique os embriões na incubadora e substitua a água da tigela de dedo por água tratada do sistema tratado de metileno fresco. Em seguida, limpe os tanques de reprodução conforme necessário e reinicie as redes. Na sexta-feira, após a alimentação dos peixes, atearam 23 graus Celsius e verificar os embriões na incubadora.No sábado e domingo, alimente os peixes. Neste número, são mostrados os dados de reprodução de julho de 2017 a março de 2020 para os peixes de superfície rio choy e texas e os peixes-caverna Los Sabinos, Tinaha e Pachon. Os dados foram analisados por semana de reprodução e o número médio de embriões coletados por dia durante uma única semana de reprodução.Os dados indicam que a reprodução foi contínua ao longo do ano em peixes da superfície do Rio Choy e texas e em peixes-caverna pachon. A quantidade e a qualidade da maioria dos peixes da superfície do Rio Choy estavam entre baixo e alto, enquanto a quantidade e a qualidade da maioria dos peixes superficiais do Texas e peixes-caverna pachon estavam entre baixo e médio. A ocorrência de desova não foi contínua em tinaja ou los sabinos peixes da caverna, com a desova sendo baixa ou inexistente durante o final do verão até o outono nestes peixes.Embora os menores níveis de desova tenham sido registrados para os peixes das cavernas de Los Sabinos, a qualidade dos embriões foi a melhor. No geral, este peixe superficial exibiu uma melhor quantidade de desova e qualidade do que os peixes-caverna. Usando este sistema, podemos desovar centenas, na verdade milhares de ovos bimestariamente, e esses ovos são então usados, esses embriões são então usados para muitos propósitos diferentes.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

mutagénese de direccionamento de genes é agora possível em uma ampla gama de microrganismos utilizando técnicas de edição genoma. Aqui, nós demonstramos um protocolo para mutagénese gene alvo usando ativador de transcrição como nucleases efetoras (TALENS) em Astyanax mexicanus, uma espécie de peixe que inclui peixes de superfície e cavefish.

Genoma Edição na<em&gt; Mexicanus Astyanax</em&gt; Usando Transcrição Activator-like Effector nucleases (TALENS)

Uma série de métodos básicos para permitir o estudo da ecologia reprodutiva de peixes mantidos em aquários são descritos. Estes são protocolos úteis para a coleta de peixe usando SCUBA, transporte de peixes vivos e observação do comportamento reprodutivo de peixes selvagens capturados em aquários.

Métodos Básicos para o Estudo da Ecologia Reprodutiva do Peixe em Aquário

Estudos de longo prazo são essenciais para a compreensão do processo de evolução e os mecanismos de adaptação. Em geral, estes estudos requerem compromissos para além do tempo de vida dos pesquisadores. Aqui, um poderoso método é descrito que avança dramaticamente a coleta de dados do estado-da-arte para gerar dados longitudinais em sistemas naturais.

Ressurreição de dormentes Daphnia magna: protocolo e aplicações

Neste trabalho, descrevemos um bioensaio agudo, crônico e várias gerações para estudar os efeitos dos estressores único e combinadas sobre o turquesa killies Nothobranchius furzeri. Este protocolo é projetado para estudar traços de história de vida (mortalidade, crescimento, fecundidade, peso) e crítico máximo térmico.

Protocolo para aguda e crônica de ensaios toxicológicos do turquesa Killifish Nothobranchius furzeri

Neste protocolo, demonstramos como Astyanax mexicanus adultos se reproduzem, levantar as larvas e executar toda a montagem imuno-histoquímica na pós larval peixe para comparar os fenótipos de superfície e caverna morfotipos.

Levantando o Tetra mexicano Astyanax mexicanus para análise dos fenótipos Post-larval e imuno-histoquímica toda a montagem

Descrevemos abordagens para a manipulação de genes no sistema modelo evolucionista Astyanax mexicanus. São descritas três técnicas diferentes: transgênese mediada por Tol2, alvo de manipulação do genoma usando CRISPR/Cas9 e nocaute de expressão usando morpholinos. Essas ferramentas devem facilitar a investigação direta de genes subjacentes a variação entre as formas de superfície - e caverna-moradia.

Manipulação de função do Gene em Cavefish mexicano

Aqui, apresentamos métodos para estudo da elevado-produção de uma série do mexicano cavefish comportamentos e coloração vital de um sistema de mechanosensory. Esses métodos usam scripts de software livre e sob medidos, fornecendo um método prático e econômico para os estudos de comportamentos.

Acompanhamento comportamental e Neuromast imagem de Cavefish mexicano

Este protocolo permite a visualização da expressão gênica em embrionárias Astyanax cavefish. Esta abordagem foi desenvolvida com o objetivo de maximizar o sinal de expressão do gene, minimizando a coloração de fundo específico.

Hibridização In Situ de Embriões Inteiros de Astyanax

A fertilização in vitro é uma técnica comumente utilizada com uma variedade de organismos modelo para manter as populações de laboratório e produzir embriões sincronizados para aplicações a jusante. Aqui, apresentamos um protocolo que implementa esta técnica para diferentes populações do peixe Tetra mexicano, Astyanax mexicanus.

Coleção gamete e fertilização in vitro de Astyanax mexicanus

Este objetivo deste protocolo é produzir axolotos quiméricos com membros dianteiros haploides derivados de tecido doador mutagenizado de Cas9 usando técnicas de enxerto de tecido embrionário.

Geração de Axolotis Quiméricos com Membros Haploides Mutantes através de enxerto embrionário

O presente protocolo ilustra o uso de componentes comercialmente disponíveis para gerar um gradiente térmico estável e linear. Tal gradiente pode então ser usado para determinar o limite térmico superior de organismos planctônicos, particularmente larvas de invertebrados.

Determinação de limites térmicos para zooplâncton usando um bloco de calor

Aprenda a estimular a desova máxima em Astyanax mexicanus usando um regime de temperatura incremental. Este protocolo laboratorial permite obter embriões transparentes para estudos de biologia do desenvolvimento e evolução.

Mudanças de temperatura incremental para reprodução e desova máxima em Astyanax mexicanus

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