Combinando Hibridização In Situ por Fluorescência Multiplex com Imunohistoquímica Fluorescente em Seções Cerebrais de Camundongos Frescos Congelados ou Fixos
25 de junho de 2021
Este protocolo descreve um método para combinar hibridização in situ fluorescente (FISH) e imunohistoquímica de fluorescência (IHQ) em cortes frescos congelados e fixos de camundongos em cérebros, com o objetivo de obter sinais de FISH multimarcados e IHC de fluorescência. IHQ teve como alvo proteínas citoplasmáticas e ligadas à membrana.
Este protocolo combina fluorescência, RNAscope, hibridização in situ e imunohistoquímica usando preparações cerebrais frescas congeladas ou fixas. Esta técnica permite flexibilidade ao demonstrar uma combinação de métodos de hibridização in situ altamente sensíveis e imunohistoquímica para visualização espacial de alvos de RNA e proteínas em um mesmo espécime tecidual. Este método é aplicável para marcação multiplex em cortes de tecido cerebral, auxiliando na investigação da organização espacial e significado funcional de RNAm e proteínas dentro de populações neuronais heterogêneas em neurociência.
Este protocolo concentra-se principalmente nas etapas de processamento de tecido fresco congelado e tecido fixado com paraformaldeído. Para começar a seccionar o tecido cerebral recém-congelado, fixe-o no mandril de criostato pré-resfriado e corte seções coronais de 14 micrômetros de espessura. Monte a seção em uma lâmina de microscopia de vidro carregada.
Transfira o slide montado para uma caixa de slides. Em seguida, transporte a caixa para o congelador de 80 graus Celsius negativos em gelo seco. Para fixação do tecido, filtrar a solução preparada de paraformaldeído.
Resfriar a 4 graus Celsius. Traga a lâmina montada do congelador de 80 graus Celsius negativos sobre gelo seco e mergulhe-a imediatamente na solução de paraformaldeído pré-refrigerada por 15 minutos, Execute a desidratação do tecido fresco congelado para garantir que a lâmina de vidro esteja completamente seca. Depois de remover o cérebro de uma montagem fixa de profusão transcárdica, usando um micrótomo vibratório, corte cortes de tecido de 30 micrômetros de espessura.
Conservar as secções cortadas em solução crioprotetora. No dia do ensaio de FISH, transferir a seção de flutuação livre para uma placa de cultura celular de 12 poços contendo PBS 0,1 molar e agitá-la a 90 a 100 RPM em um agitador de plataforma giratória para lavar o crioprotetor. Em seguida, usando um pincel, monte a seção plana em uma lâmina de microscopia de vidro para evitar o descolamento durante as lavagens e seque ao ar por pelo menos duas horas.
Usando uma caneta de barreira hidrofóbica, desenhe uma barreira hidrofóbica ao redor da seção para conter os reagentes FISH. Após o pré-processamento, o tecido é incubado em solução de protease e hibridizado com sondas RNAscope por duas horas, de acordo com as diretrizes do fabricante. Em seguida, são realizadas as etapas de amplificação sequencial e imunohistoquímica por fluorescência.
Comece preparando uma câmara de proteção contra luz umidificada para incubar lâminas. Em banho-maria, aqueça o tampão de lavagem 50X e as sondas a 40 graus Celsius por 10 minutos. Uma vez resfriado à temperatura ambiente, prepare um litro de tampão de lavagem 1X a partir da concentração de estoque de 50X.
Prepare a mistura de sonda conforme descrito no manuscrito do texto. Para o tratamento com proteinases, adicionar proteinase 3 ao corte de tecido e incubá-lo à temperatura ambiente por 30 minutos. Para lavar a proteinase, mergulhe suavemente a lâmina em PBS 0,1 molar à temperatura ambiente, evitando o deslocamento da secção.
Para hibridização, adicionar a mistura de sonda sobre a seção de tecido. Coloque-o na câmara pré-aquecida umedificada. Em seguida, incube-o por duas horas a 40 graus Celsius.
Enxaguar a seção de tecido com tampão de lavagem duas vezes por dois minutos. Para amplificação do sinal, usando um frasco conta-gotas, adicione uma solução de amplificação para cobrir a seção de tecido e incubar conforme descrito no texto. Adicione a solução de bloqueio à secção do tecido e incube durante uma hora à temperatura ambiente para evitar a ligação inespecífica.
Deslize o slide para remover o excesso de buffer de bloqueio após a incubação. Agora, incube a seção com anticorpos primários durante a noite a 4 graus Celsius. No dia seguinte, lave a lâmina três vezes com 1X TBS.
Adicionar o anticorpo secundário e incubar as secções durante duas horas à temperatura ambiente. Examine a lâmina sob um microscópio de epifluorescência equipado com uma câmera. Adquira imagens representativas com ampliação de 20 vezes e salve-as como arquivos TIF.
No presente estudo, a qualidade tecidual, a integridade e a ausência de contaminação bacteriana foram confirmadas pela ausência de marcação DAPI. A marcação de sondas de controle positivo visando ubiquitina C, peptidilprolil isomerase B e RNA polimerase IIA mRNA confirmou a integridade do RNA. Em preparações recém-congeladas para distinguir neurônios positivos de RNAm de GalR1 dentro do NTS, marcadores neuroquímicos adicionais foram usados.
O transportador vesicular ligado à membrana estava claramente marcado. Em contraste, proteínas citoplasmáticas como tirosina hidroxilase e GFP expressas sob o controle do promotor PHOX2B foram fracamente observadas e descritas como floculentas por não possuírem um contorno claro. A marcação com sonda GalR1 FISH do mRNA citoplasmático de GalR1 foi puntiforme e claramente observada.
Para confirmar que a qualidade imunoistoquímica depende da localização subcelular da proteína, diferentes proteínas nucleares e citoplasmáticas foram marcadas em paralelo com FISH nos mesmos cortes teciduais. A GFP citoplasmática PHOX2B apresentou aspecto floculante. Já o sinal da proteína nuclear PHOX2B foi claro, o que confirmou a marcação imunológica de maior qualidade quando combinada com FISH.
Quando realizada em cortes fixos congelados em combinação com FISH, a imuno-histoquímica foi confiável, independentemente da localização subcelular. Os neurônios positivos para RNAm de GlyT2 estavam localizados ventralmente ao NTS e não dentro do NTS. Os neurônios positivos para mRNA GlyT2 e PHOX2B mRNA positivo não colocalizaram.
Uma subpopulação de neurônios NTS PHOX2B positivos para mRNA foi imunorreativa à tirosina hidroxilase, e nenhum continha mRNA de GlyT2. O RNAscope permite a visualização e análise da distribuição de RNA na resolução de uma única molécula em células e tecidos. Ele capacita a pesquisa em novas espécies de RNA, mecanismos de doenças, padrões de expressão gênica, diversidade de neurônios e interações celulares.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para combinar hibridização fluorescente in situ (FISH) e imunohistoquímica por fluorescência (IHC) em seções de cérebro de camundongo frescas congeladas e fixadas. A técnica permite a visualização espacial de alvos de RNA e proteína simultaneamente, auxiliando na investigação de populações neuronais.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia molecular
- Imunohistoquímica
Contexto
- O estudo investiga a organização espacial de mRNA e proteínas em populações neuronais heterogêneas.
- A combinação de FISH e IHC permite marcação multiplex em seções de tecido cerebral.
- Seu objetivo é aprimorar a compreensão da expressão gênica e da localização proteica no cérebro.
- O protocolo é aplicável tanto a tecidos frescos congelados quanto a tecidos fixados com paraformaldeído.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método confiável e flexível de detecção simultânea de RNA e proteína.
- Aprimorar a investigação da distribuição de mRNA e da localização proteica em células neuronais.
- Validar a qualidade da marcação imunohistoquímica quando combinada com FISH.
Métodos Utilizados
- Seções cerebrais frescas congeladas e fixadas com paraformaldeído foram utilizadas como plataforma principal.
- O modelo biológico envolveu tecido cerebral de camundongo, com foco em sinais de RNA e proteína em neurônios.
- O método inclui etapas críticas como corte, fixação, hibridização e amplificação do sinal.
- Protocolos detalhados de incubação e lavagem foram seguidos para garantir resultados claros.
Resultados Principais
- As sondas de controle positivo confirmaram a integridade do RNA, enquanto foram observados diferentes graus de nitidez do sinal nas proteínas.
- O estudo demonstrou a capacidade de diferenciar entre sinais citoplasmáticos e nucleares em neurônios.
- Foram relatadas indicações de populações neuronais distintas e suas expressões de RNA/proteína.
- A combinação de FISH e IHC mostrou-se confiável para a visualização de múltiplos alvos dentro das mesmas seções.
Conclusões
- O protocolo permite a exploração avançada da diversidade e interação de neurônios no tecido cerebral.
- Este estudo fornece uma estrutura para futuras investigações sobre mecanismos neuronais e potenciais modelos de doenças.
- O método aprofunda nossa compreensão da dinâmica molecular e celular na neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A combinação de FISH multiplex com IHC por fluorescência permite que a pesquisa e desenvolvimento biofarmacêuticos resolvam a coexpressão espacial de alvos de RNA e proteínas em populações neuronais heterogêneas, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta de fármacos em neurociência. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva ao vincular assinaturas moleculares a fenótipos celulares, orientando decisões de avanço ou interrupção no estágio inicial da descoberta. A aplicabilidade do método a tecidos frescos congelados e fixados oferece flexibilidade de fluxo de trabalho para a investigação de alvos em modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da identificação de RNAs mensageiros de baixa abundância (por exemplo, receptor de galanina 1) e transcritos de alta abundância dentro de núcleos cerebrais definidos imuno-histoquimicamente.
- Valor Operacional: Apoia a desconsideração de riscos biológicos por meio da marcação simultânea de RNA e proteína, esclarecendo o engajamento do alvo e a modulação da via em circuitos neuronais.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao distinguir subpopulações neuronais com base em assinaturas neuroquímicas, reduzindo a ambiguidade na seleção de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente mediante a confirmação da integridade do RNA por meio de sondas controle positivo (ubiquitina C, peptidilprolil isomerase B, polimerase de RNA II A).
- Valor Operacional: Permite a padronização do ensaio por meio de condições otimizadas de incubação com protease e hibridização, melhorando a reprodutibilidade entre preparações de tecidos frescos congelados e fixados.
- Valor de Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma para detecção multiplex de RNA e proteína, auxiliando na avaliação confiável de compostos em campanhas de triagem fenotípica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Aprimora o alinhamento translacional de biomarcadores ao visualizar a organização espacial da expressão de mRNA e proteínas em núcleos do tronco encefálico relevantes para doenças (por exemplo, NTS).
- Valor Operacional: Garante a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, mantendo a qualidade da IHC após o FISH, especialmente para alvos ligados à membrana.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta a tomada de decisões ao revelar a ausência de colocalização entre neurônios positivos para mRNA de GlyT2 e neurônios positivos para mRNA de PHOX2B, refinando modelos mecanicistas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao contínuo de descoberta, desde a identificação do alvo até a otimização do fármaco líder, permitindo a validação espacial de alvos moleculares em populações neuronais antes da triagem fenotípica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao resolver a distribuição de RNA em neurônios identificados imunohistoquimicamente, reduzindo a ambiguidade mecanicista.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de fluxos de trabalho padronizados de FISH-IHC, garantindo leituras espaciais reprodutíveis para avaliação da resposta a compostos.
- Análises: Gera dados espaciais quantitativos por meio da detecção de sinal de fluorescência, permitindo a comparação dos níveis de expressão de RNA e proteína entre condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao validar a expressão de alvos em preparações de tecidos fixados, apoiando modelos de doenças alinhados a biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade reutilizável de perfilagem espacial em diversos programas de descoberta em neurociência, maximizando o investimento em infraestrutura.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva por meio da visualização direta da coexpressão RNA-proteína, reduzindo falsos positivos na validação de alvos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade por meio de etapas otimizadas de protease e hibridização, minimizando a variabilidade na marcação multiplex.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de riscos em alvos por meio de resolução subcelular, reduzindo a desistência em fases tardias devido a incompatibilidade biológica.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao identificar subpopulações neuronais com perfis distintos de RNA-proteína, orientando a seleção de indicações.
Considerações sobre a Implementação
- Exige especialização em microscopia de fluorescência, manipulação de sondas de RNA e otimização de anticorpos para controlar a especificidade do sinal.
- Depende de ambientes livres de RNase, ferramentas de corte em criostato ou microtomo e sistemas de imagem de fluorescência com conjuntos de filtros apropriados.
- Necessita padronização entre equipes nos tempos de incubação com protease e nos protocolos de validação de anticorpos para garantir qualidade consistente da IHC após FISH.
- Requer adaptação conforme a localização subcelular da proteína, já que alvos citoplasmáticos podem precisar de extensa solução de problemas, enquanto proteínas ligadas à membrana mantêm especificidade.
- Limitado pelos desafios no manejo de tecidos em preparações fixadas-congeladas, embora a qualidade da IHC seja superior quando otimizada com RNAscope.
