Medição de distribuições 3-dimensionales cAMP em células vivas usando imagens e análises hiperespectrais de FRET 4-Dimensional (x, y, z e λ) Hiperespectrais
27 de outubro de 2020
Devido à relação sinal-ruído inerente (SNR) de sensores baseados em transferência de energia de ressonância (FRET) Fӧrster, a medição dos sinais cAMP tem sido desafiadora, especialmente em três dimensões espaciais. Aqui, descrevemos uma metodologia hiperespectral de imagem e análise de FRET que permite a medição da distribuição cAMP em três dimensões espaciais.
Este protocolo é significativo, pois fornece um método para medir e visualizar sinais FRET ou AMP cíclico em três dimensões espaciais em células individuais. As distribuições de AMP cíclico podem ocorrer axialmente e lateralmente e é importante adquirir dados de imagem de AMP cíclico FRET em três dimensões para amostrar essas distribuições. No dia da imagem, os Tyrodes quentes tamponam a 37 graus Celsius em banho-maria e montam uma lamínula com as células transfectadas de interesse em uma câmara celular.
Prenda a parte superior da câmara com uma junta de montagem para evitar vazamentos e use um limpador de tarefas delicadas para remover qualquer excesso de meio ou células aderentes da parte inferior da lamínula. Adicione 800 microlitros de tampão de trabalho e quatro microlitros de etiqueta nuclear de cinco milimolares à câmara celular e agite suavemente a câmara por cinco a 10 segundos. Em seguida, cubra a câmara celular com papel alumínio por uma incubação de 10 minutos em temperatura ambiente.
Para obter imagens das células, selecione a objetiva de imersão em água 60X em um microscópio confocal equipado com um detector espectral e adicione uma gota de água à objetiva. Coloque a câmara de células carregada no microscópio stage e ajuste o botão do filtro para selecionar o conjunto de filtros apropriado. Selecione o modo de campo amplo de fluorescência e use as oculares para selecionar um campo de view contendo células que expressam o sensor AMP cíclico FRET.
Abra o software de imagem, selecione o modo confocal e desbloqueie o botão de intertravamento do laser. Abra o menu de configurações A1. Marque as caixas correspondentes às linhas de laser de 405 e 561 nanômetros e defina essas detecções espectrais para SD, a resolução para 10 e os canais para 32.
Selecione os valores de comprimento de onda inicial e final para definir a faixa de comprimento de onda. Abra o menu Configurações A1 para selecionar o ícone de salto de compartimentalização. Selecione a caixa número 15 e clique em OK. Defina as intensidades do laser para oito por cento para o laser de 405 nanômetros e para dois por cento para o laser de 561 nanômetros.
Defina o ganho do detector para 149 e o raio do orifício para 2.4 unidades de disco Airy. Defina a velocidade de varredura para 25 quadros espectrais por segundo e selecione a direção de varredura unidirecional. Defina a contagem como quatro e o tamanho da varredura como 1024 por 1024.
Para definir os parâmetros de aquisição da pilha z, clique em Exibir, Controle de aquisição e Aquisição ND e insira o destino e o nome do arquivo na janela pop-up para salvar o arquivo ND. Clique na caixa z-series e clique em Ao vivo na janela Configurações do A1 Plus para abrir uma janela de visualização ao vivo. Ajuste o botão de foco para focar nas células enquanto olha na janela de visualização.
Ajuste o botão de foco no microscópio para selecionar a parte superior da célula e clique em Superior na janela ND Acquisition para definir a posição atual como a parte superior. Ajuste o botão de foco no microscópio para selecionar a parte inferior da célula e clique em Inferior para definir a posição atual como a parte inferior. Insira um micrômetro para o tamanho do passo.
Selecione Superior inferior para a direção do z-scan e clique em executar para adquirir uma pilha z. Quando a aquisição da pilha z estiver completa, use uma pipeta para adicionar suavemente o reagente de interesse à câmara sem perturbar as células. Após 10 minutos, altere o nome do arquivo e adquira uma segunda imagem z-stack.
Após a geração de imagens, crie novas pastas com os mesmos nomes de arquivo que as imagens espectrais da pilha z e abra o arquivo de imagem espectral de interesse. Clique em Arquivo, Importar/Exportar e Exportar Documento ND. Na janela pop-up, selecione a pasta recém-criada, TIFF para o tipo de arquivo, Imagem mono para cada canal e mantenha a profundidade de bits.
Clique em exportar para exportar os arquivos individuais para a pasta e abrir o software de separação espectral linear. Abra a separação linear. m e clique em Executar.
Procure e selecione a pasta que contém a sequência de arquivos TIFF exportada e clique em OK para abrir a janela de comprimento de onda e z-slice. Copie o nome do arquivo do primeiro arquivo sem o z-slice e o número do canal da pasta e cole-o na primeira etapa da caixa Digite o nome da imagem, insira o número de canais na caixa Insira o número de bandas de comprimento de onda e o número de z-slices na caixa Insira o número de Z Slices e clique em OK. Em seguida, na janela pop-up, navegue e selecione o Comprimento de onda. mat e clique em Abrir.
Navegue e selecione o arquivo Library. mat na nova janela pop-up e clique em Abrir novamente para iniciar a desmistura da fatia. Para calcular a eficiência do FRET, abra o multiFRRCF.
m e insira o número de tentativas experimentais a serem analisadas na caixa Quantas pastas refatiar. Clique em OK. Navegue para selecionar as pastas não misturadas e clique em OK novamente. Na nova janela pop-up, defina o fator de escala para 12,4, o limite para 56, a frequência X, Y e Z para cinco, cinco e um, respectivamente, e o algoritmo de suavização para gaussiano.
Em seguida, clique em Executar para executar as medições e o refatiamento do FRET. Para mapear a eficiência do FRET para níveis de AMP cíclicos, abra o Mapping_FRET. Efficiency_to_cAMP_concentration. m e clique em Executar.
Navegue até a primeira imagem FRET em tons de cinza e selecione-a e clique em OK. Em seguida, abra as imagens AMP cíclicas FRET para inspecionar a distribuição dos sinais AMP cíclicos em três dimensões. Nessas imagens, podem ser observadas visualizações tridimensionais de dados de imagem hiperespectral brutos de cor falsa adquiridos por microscopia confocal no início e 10 minutos após o tratamento com forscolina. Nesta análise, um fluoróforo aceptor foi completamente fotodestruído, permitindo a obtenção de assinaturas espectrais do doador e do aceptor com estequiometria um-para-um.
Células não transfectadas marcadas com um corante nuclear foram utilizadas para obter o espectro puro do fluoróforo do corante. A combinação dos espectros do doador, do aceitador e dos fluoróforos de corante nuclear permite a criação de uma biblioteca de três componentes. Aqui, as fontes de três assinaturas espectrais de fundo podem ser observadas.
Embora esses sinais sejam distribuídos de maneira não uniforme dentro da amostra e não possam ser simplesmente subtraídos, adicionar as assinaturas espectrais desses sinais à biblioteca espectral e usar a separação linear para separar os sinais fornece uma abordagem para remover esses sinais de confusão dos sinais doadores e aceitadores antes de calcular suas eficiências FRET. A biblioteca espectral de seis componentes pode então ser usada para realizar a separação espectral linear para cada fatia na imagem axial. Aqui, as mudanças na eficiência do FRET e nos níveis cíclicos de AMP em diferentes fatias do plano XY podem ser observadas, permitindo uma comparação entre as condições basais e as condições 10 minutos após o tratamento com forscolina.
Essa técnica também pode ser usada para quantificar a eficiência do FRET de outros repórteres em três dimensões em células e tecidos.
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Visão Geral
Este estudo aborda os desafios de medir sinais de cAMP em três dimensões espaciais utilizando sensores baseados em transferência de energia por ressonância de Förster (FRET). Apresenta uma nova metodologia de imagem FRET hiperspectral que permite a visualização e a medição da distribuição de cAMP dentro de células individuais.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Sinalização por AMP cíclico
- Tecnologia de imagemagem por FRET
- Dinâmica celular em três dimensões
Contexto
- Baixa relação sinal-ruído (SNR) em sensores FRET tradicionais
- Importância das medições tridimensionais de AMPc
- Aplicações em vias de sinalização celular
Métodos Utilizados
- Imagem hiperespectral para análise de FRET
- Microscopia confocal para imageamento
- Técnicas de separação espectral linear
Resultados Principais
- Medição bem-sucedida da distribuição de cAMP em três dimensões
- Visualização das respostas celulares ao tratamento com forskolina
- Utilidade demonstrada da separação linear para separação de sinais
Conclusões
- Esta metodologia fornece uma estrutura robusta para o estudo da dinâmica do cAMP com alta resolução.
- Ela aprimora a compreensão das vias de sinalização na biologia celular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O mapeamento espacial preciso da dinâmica de mensageiros secundários é essencial para reduzir os riscos na validação de alvos nas vias de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) e ciclase adenilato. Essa abordagem de FRET hiperspectral permite a resolução tridimensional de sinais de AMPc, reduzindo a ambiguidade mecanicista em estudos de compartimentalização subcelular. O método aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta ao associar padrões espaciais de AMPc a respostas celulares funcionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a resolução da compartimentalização do cAMP em três dimensões espaciais.
- Valor Operacional: Oferece validação funcional de alvos por meio da visualização de padrões de sinalização específicos a vias em células vivas.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao correlacionar distribuições espaciais de cAMP com desfechos fenotípicos após perturbação farmacológica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera leituras quantitativas e com resolução espacial da eficiência de FRET adequadas para formatos de triagem de alto conteúdo.
- Reprodutibilidade: Utiliza a separação espectral linear para minimizar autofluorescência e interferência espectral, aumentando a confiabilidade do sinal entre réplicas.
- Escalabilidade: Compatível com adaptação para placas de múltiplos poços, permitindo a triagem de efeitos de compostos sobre a dinâmica subcelular de cAMP.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Aplicável a células endoteliais microvasculares pulmonares, apoiando estudos translacionais em vias de sinalização vascular.
- Redução Mecanística de Riscos: Esclarece se as alterações observadas nos níveis de AMPc são decorrentes de modulação real da via ou de artefatos de imagem provocados pela sobreposição espectral.
- Continuidade Pré-clínica: Permite o acompanhamento longitudinal da dinâmica do AMPc desde a descoberta até a validação funcional em sistemas relevantes para doenças.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a otimização de compostos líderes, ao fornecer leituras quantitativas com resolução espacial da atividade de mensageiros secundários.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio do mapeamento da dinâmica do cAMP em resposta a agonistas de receptores acoplados à proteína G ou moduladores da adenilil ciclase.
- Triagem: Fornece dados tridimensionais de cAMP prontos para ensaios, com redução de falsos positivos decorrentes de interferência espectral.
- Análises: Gera mapas de eficiência de FRET e de concentração de cAMP que permitem comparações entre diferentes condições de tratamento e perturbações genéticas.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se a estudos pré-clínicos por meio do uso em células endoteliais primárias e adaptabilidade a modelos de doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade central de imagem reutilizável para o estudo da sinalização espacial em múltiplos sistemas de mensageiros secundários.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na sinalização de cAMP ao resolver as distribuições axial e lateral.
- Valor Operacional: Padroniza as medições de FRET por meio da separação baseada em biblioteca espectral e parâmetros de aquisição reprodutíveis.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper ao fornecer dados espacialmente contextualizados sobre o engajamento do alvo.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base na fidelidade da sinalização subcelular.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em imageamento hiperspectral, separação espectral e validação de biossensores FRET.
- Depende de microscopia confocal com detector espectral e capacidade de detecção de 32 canais.
- Necessita padronização entre equipes para a geração de bibliotecas espectrais e parâmetros de separação espectral.
- A adaptação a outros tipos celulares pode exigir otimização da densidade de marcação e dos parâmetros de aquisição em z-stack.
- As limitações práticas incluem riscos de fotodesvanecimento durante a aquisição prolongada de z-stacks e demandas computacionais do processamento espectral.
