Name: Medição de distribuições 3-dimensionales cAMP em células vivas usando imagens e análises hiperespectrais de FRET 4-Dimensional (x, y, z e λ) Hiperespectrais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprenda a medir distribuições 3D de cAMP em células vivas usando imagens hiperespectrais FRET. Este método combina microscopia confocal com desmisturação linear para visualizar dinâmicas de sinalização celular em alta resolução.

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Os autores gostariam de reconhecer o Dr. Kees Jalink (Instituto de Câncer dos Países Baixos e o Centro de Microscopia Avançada van Leeuwenhoek, Amsterdã, Holanda) por nos fornecer o biosensor H188 cAMP FRET e Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) para ajuda técnica na redução do tempo de tempo que leva para executar nossos scripts de programação desenvolvidos sob medida.
Os autores gostariam de reconhecer as fontes de financiamento: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

<ol><li>Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+adenosine+3%27%3A5%27-monophosphate+and+adenosine+3%27%3A5%27-monophosphate-dependent+protein+kinase+in+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue.</a> The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).</li>
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<li>Bacskai, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+dynamics+of+cAMP+and+protein+kinase+A+subunits+in+Aplysia+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons.</a> Science. 260, 222-226 (1993).</li>
<li>Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+aspects+of+cAMP+signalling+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes.</a> Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).</li>
<li>Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+compartmentation+of+cyclic+AMP+and+protein+kinase+in+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cyclic+Nucleotide+Research%22%5BJournal%5D)">Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart.</a> Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).</li>
<li>Hohl, C. M., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+cAMP+in+adult+canine+ventricular+myocytes.+Relation+to+single-cell+free+Ca2%2B+transients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients.</a> Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).</li>
<li>Rich, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+uniform+extracellular+stimulus+triggers+distinct+cAMP+signals+in+different+compartments+of+a+simple+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).</li>
<li>Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+adenylyl+cyclase+reveals+the+significance+of+cAMP+compartmentation+on+pulmonary+microvascular+endothelial+cell+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier.</a> Circulation Research. 98, 675-681 (2006).</li>
<li>Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+local+phosphodiesterase+activity+using+tailored+cyclic+nucleotide-gated+channels+as+cAMP+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors.</a> The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).</li>
<li>Blackman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDE4D+and+PDE4B+function+in+distinct+subcellular+compartments+in+mouse+embryonic+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).</li>
<li>Sayner, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+cAMP-induced+lung+endothelial+hyperpermeability+revealed+by+Pseudomonas+aeruginosa+ExoY%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY.</a> Circulation Research. 95, 196-203 (2004).</li>
<li>Klarenbeek, J., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+cAMP+with+an+EPAC-based+FRET+sensor+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).</li>
<li>Surdo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+biosensor+uncovers+cAMP+nano-domains+at+%CE%B2-adrenergic+targets+that+dictate+precise+tuning+of+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility.</a> Nature Communications. 8, 15031(2017).</li>
<li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%3A+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).</li>
<li>Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fanciful+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+STKE%22%5BJournal%5D)">Fanciful FRET.</a> Science's STKE. 2006, (2006).</li>
<li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+History+of+FRET%3A+From+conception+through+the+labors+of+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">The History of FRET: From conception through the labors of birth.</a> Reviews in Fluorescence. 3, (2006).</li>
<li>Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-224 (2006).</li>
<li>Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+by+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+microscopy+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells.</a> Current Protocols in Protein Science. 93, 58(2018).</li>
<li>Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenylyl+cyclases+and+the+interaction+between+calcium+and+cAMP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling.</a> Nature. 374, 421-424 (1995).</li>
<li>Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+gene+expression+to+cAMP+signalling%3A+role+of+CREB+and+CREM%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).</li>
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<li>Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+multiphoton+spectral+imaging+and+its+use+for+measuring+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer.</a> Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).</li>
<li>Agarwal, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+cAMP+signaling+associated+with+lipid+raft+and+non-raft+membrane+domains+in+adult+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 332(2018).</li>
<li>Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+signaling+compartmentation%3A+Adenylyl+cyclases+as+anchors+of+dynamic+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes.</a> Mol Pharmacol. , (2017).</li>
<li>Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+measurement+using+emission-spectral+unmixing+with+independent+excitation+crosstalk+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction.</a> Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).</li>
<li>Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IIem-spFRET%3A+improved+Iem-spFRET+method+for+robust+FRET+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 105003(2016).</li>
<li>Levy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpRET%3A+highly+sensitive+and+reliable+spectral+measurement+of+absolute+FRET+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency.</a> Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).</li>
<li>West, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+Measurements+Allow+Separation+of+FRET+Signals+from+Non-Uniform+Background+Fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence.</a> Biophysical Journal. 112, 453(2017).</li>
<li>Annamdevula, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+for+characterizing+and+comparing+hyperspectral+microscopy+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems.</a> Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).</li>
</ol>

Os Drs. Leavesley e Rich revelam interesse financeiro em uma empresa iniciante, SpectraCyte, LLC, que foi formada para comercializar tecnologias de imagem espectral. No entanto, todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados utilizando produtos comercialmente disponíveis não associados à SpectraCyte, LLC.

O desenvolvimento de biosensores FRET permitiu a medição e visualização de sinais nucleotídeos cíclicos em células únicas, e há grande promessa de visualização de eventos de sinalização subcelular13,22,37,38. No entanto, o uso de biosensores FRET apresenta várias limitações, incluindo as características de baixo sinal-ruído de muitos repórteres fret à base de proteína fluorescente e a fraca tra...

Monofosfato de adenosina cíclica (cAMP) é um segundo mensageiro envolvido em processos celulares e fisiológicos chave, incluindo divisão celular, influxo de cálcio, transcrição genética e transdução de sinais. Um conjunto crescente de evidências sugere a existência de compartimentos cAMP na célula através dos quais a especificidade de sinalização é alcançada1,2,3,4,5,6,7. Até recentemente, a compartimentação cAMP era inferida com base em efeitos fisiológicos ou celulares distintos induzidos por diferentes agonistas receptores acopladosG 8,9,10,11. Mais recentemente, as sondas de imagem de fluorescência baseadas em FRET forneceram novas abordagens para a medição direta e observação de sinais cAMP em uma célula12,13,14.
A transferência de energia de ressonância förster (FRET) é um fenômeno físico no qual ocorre a transferência de energia entre moléculas doadoras e aceitadoras de forma não radiativa quando as moléculas estão próximas15,16. Com o desenvolvimento de indicadores fluorescentes baseados em FRET, esse fenômeno físico tem sido utilizado em aplicações biológicas para estudar interações proteína-proteína17, co-localização proteica18, Ca+2 sinalizando19, expressão genética20,divisão celular21 e sinalização nucleotídea cíclica. Os indicadores cAMP baseados em FRET normalmente consistem em um domínio de vinculação cAMP, um fluoróforo doador e um fluoróforoaceitor 22. Por exemplo, o sensor H188 cAMP12,22 utilizado nesta metodologia consiste em um domínio de ligação cAMP obtido da Epac, sanduíche entre fluoroforos turquesa (doador) e Vênus (aceitador). Em condições basais (sem entrada), Turquesa e Vênus estão em uma orientação de tal forma que o FRET ocorre entre os fluoroforos. Ao vincular o cAMP ao domínio de ligação, ocorre uma alteração conformacional de tal forma que Turquesa e Vênus se afastam, resultando em uma diminuição do FRET.
As abordagens de imagem baseadas em FRET oferecem uma ferramenta promissora para investigar e visualizar sinais cAMP dentro de uma célula. No entanto, as técnicas atuais de imagem microscópica baseadas em FRET são muitas vezes apenas parcialmente bem sucedidas em alcançar força de sinal suficiente para medir o FRET com clareza espacial subcelular. Isso se deve a vários fatores, incluindo a intensidade limitada do sinal de muitos repórteres da FRET, o alto nível de precisão necessário para quantificar com precisão as mudanças na eficiência do FRET e a presença de fatores de confusão, como a autofluorescência celular23,24. O resultado é muitas vezes uma imagem FRET que é atormentada por SNR fraco, tornando muito difícil a visualização de mudanças subcelulares no FRET. Além disso, a investigação de sinais cAMP espacialmente localizados tem sido realizada quase exclusivamente em apenas duas dimensões espaciais e a distribuição axial cAMP raramente foi considerada25. Isso é provável porque o SNR baixo impediu a capacidade de medir e visualizar gradientes cAMP em três dimensões espaciais. Para superar as limitações do uso de sensores FRET com baixo SNR, implementamos abordagens hiperespectrais de imagem e análise para medir o FRET em células únicas25,26,27.
Abordagens de imagem hiperespectral foram desenvolvidas pela NASA para diferenciar objetos terrestres presentes em imagens de satélite28,29. Essas técnicas foram traduzidas para o campo de microscopia de fluorescência30,com vários sistemas comerciais de microscópio confocal oferecendo detectores espectrais. Em imagens tradicionais (não espectrais) de fluorescência, a amostra é animada usando um filtro de passe de banda ou uma linha laser, e a emissão é coletada usando um segundo filtro de passe de banda, muitas vezes selecionado para corresponder ao comprimento de onda de emissão máxima do fluoróforo(s). Em contrapartida, as abordagens de imagem hiperespectral buscam amostrar um perfil espectral completo da emissão de fluorescência26,31,32 ou excitação33,34 em intervalos específicos de comprimento de onda. Em nossos estudos anteriores, mostramos que as abordagens de imagem e análise hiperespectral podem oferecer uma quantificação melhorada dos sinais DE TRAC nas células quando comparadas às técnicas tradicionais de imagem FRET baseadas emfiltros 26. Aqui, apresentamos uma metodologia para a realização de imagens e análises hiperespectrais de FRET hiperdimensionais (x, y, z e λ) para medir e visualizar distribuições cAMP em três dimensões espaciais. Essas abordagens permitiram a visualização de gradientes espaciais cAMP induzidos por agonista em célulasúnicas 25. Curiosamente, dependendo do agonista, gradientes cAMP podem ser aparentes nas células. A metodologia aqui apresentada utiliza o descompreamento espectral de fundo não uniforme e autofluorescência celular para melhorar a precisão das medições de FRET. Embora essa metodologia seja demonstrada em células endoteliais microvasculares pulmonares (PMVECs) utilizando um biosensor CAMP FRET, a metodologia poderia ser facilmente modificada para uso com repórteres fret alternativos ou linhas celulares alternativas.

<table><tbody><tr><td>Câmara de células Attofluor</td><td>Invitrogen</td><td>A7816</td><td>Attofluor contém câmaras de células de aço e um O-ring de borracha. A câmara celular contém a lamínula e o O-ring fornece um mecanismo de bloqueio para manter o tampão na câmara celular sem vazamento</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>Solvente usado para preparar a solução estoque para a forscolina.</td></tr><tr><td>Solução de Sonda de Fluorocheiro DRAQ5</td><td>Thermo Scientific</td><td>62252</td><td>Rótulo nuclear</td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Contém nutrientes e fatores de crescimento para as células crescerem e se dividirem nas placas de cultura.</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td> <td>Sigma</td><td>F6178</td><td>Fornecimento de fator de crescimento que é adicionado ao meio de cultura, DMEM</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F3917</td><td>Ativador da adenily ciclase.</td></tr><tr><td>H188 Biossensor AMP FRET cíclico</td> Instituto <td>do Câncer da Holanda, Dr. K. Jalink</td><td>Gift</td><td>Plasmídeo que codifica turquesa (fluoróforo do doador), Vênus (fluoróforo aceptor) e domínio de ligação obtido da Epac.</td></tr><tr><td>Imagem J</td><td>image.net</td><td>Download gratuito</td><td>Outra plataforma de processamento de imagem usada para extrair informações espectrais e processamento de imagens.</td></tr><tr><td>Integrando a Sphere</td><td>Ocean Optics</td><td>FOIS-1</td><td>Usado para medir a intensidade de iluminação da linha de laser em diferentes intensidades de laser (?).</td></tr><tr><td>Proteína de camundongo com laminina, natural</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>As lamínulas são revestidas com laminina e isso ajuda na fixação celular, crescimento e motilidade da célula.</td></tr><tr><td>Kit de Transfecção de Lipofectamina 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000-015</td><td>Reagente de transfecção usado para transfectar células com biossensor H188 FRET</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2019a</td><td>As operações de processamento de imagem (desmistura linear e cálculos de eficiência de FRET) são realizadas escrevendo programas personalizados no ambiente de programação MATLAB</td></tr><tr><td>Microscópio confocal Nikon A1R Instrumentos</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R</td><td>A aquisição de imagens espectrais é realizada usando microscópio confocal.</td></tr><tr><td>Nikon Elements Software</td><td>Nikon Instruments</td><td>Software dongle</td><td>usado para exportar e manipular arquivos de imagem nd2 (arquivos de imagem multidimensionais) que são adquiridos usando Nikon A1R</td></tr><tr><td>NIST-Traceable Calibration Lamp</td><td>Ocean Optics</td><td>LS-1-CAL-INT</td><td>Uma lâmpada com um espectro conhecido para uso como padrão</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>coomonly usado buffer suring cultura</td></tr> <tr><td>de célulasCélulas Endoteliais Microvasculares Pulmonares (PMVECs)</td><td>In house - Núcleo de cultura de células, Universidade do Sul do Alabama</td><td>Isolados da microvasculatura pulmonar de ratos</td>, <td>os PMVECs formam o revestimento interno de um vaso sanguíneo.</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Antibióticos Gibco</td><td>15140-122</td><td>são adicionados ao medum de cultura para evitar a contaminação das células.</td></tr><tr><td>Micro Lâminas de Vedação Dourada Pré-Limpas</td><td>Clay Adams</td><td>3010</td><td>Lâminas de microscópio usadas para fixação de células</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Montagem Media</td><td>Invitrogen</td><td>P36961</td><td>Se as amostras forem fixadas usando mountant antifade, então o último protege os corantes fluorscentes e cromóforos do desbotamento.</td></tr><tr><td>Espectrômetro</td><td>Ocean Optics</td><td>QE65000</td><td>Usado para medir a resposta espectral da fonte de luz (?)</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Digere a ligação proteína-proteína entre a célula e a matriz celular e ajuda a disscociate e levantar as células durante o revestimento celular.</td></tr><tr><td>Tyrodes Buffer</td><td>Made in-house</td><td>Made in-house</td><td>Tyrodes buffer é usado para fazer soluções de trabalho e para manter as células em solução aquosa durante a aquisição de imagens.</td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Células de 6 Poços</td><td>Corning</td><td>3506</td> As <td>lamínulas revestidas com laminina são colocadas em uma placa de cultura de 6 poços (uma cobertura de lixo/poço). Células junto com o meio são adicionadas a cada poço.</td></tr><tr><td>Lamínulas de Microscópio Redondas de 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545102</td><td>As células foram cultivadas em lamínulas redondas de vidro</td></tr><tr><td>60X Objetivo</td><td>Nikon Instruments</td><td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &infin;/0.15-0.18 WD 0.27</td><td>imersão em água e objetiva comumente usada para células</td></tr></tbody></table>

medição de distribuições 3-dimensionales camp em células vivas usando imagens e análises hiperespectrais de fret 4-dimensional (x, y, z e λ) hiperespectrais

Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and &lambda;) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis

O AMP cíclico é um segundo mensageiro que está envolvido em uma ampla gama de atividades celulares e fisiológicas. Vários estudos sugerem que os sinais de cAMP são compartimentados, e que a compartimentação contribui para a sinalização da especificidade dentro da via de sinalização cAMP. O desenvolvimento de biosensores baseados em transferência de energia de ressonância Fӧrster (FRET) promoveram a capacidade de medir e visualizar sinais cAMP nas células. No entanto, essas medidas são muitas vezes limitadas a duas dimensões espaciais, o que pode resultar em má interpretação dos dados. Até o momento, houve apenas medições muito limitadas de sinais cAMP em três dimensões espaciais (x, y e z), devido às limitações técnicas no uso de sensores FRET que inerentemente exibem baixa relação sinal/ruído (SNR). Além disso, as abordagens tradicionais de imagem baseadas em filtros são muitas vezes ineficazes para a medição precisa de sinais cAMP em regiões subcelulares localizadas devido a uma série de fatores, incluindo crosstalk espectral, força limitada do sinal e autofluorescência. Para superar essas limitações e permitir que os biosensores baseados em FRET sejam usados com fluoroforos múltiplos, desenvolvemos abordagens hiperespectrais de imagem e análise de FRET que fornecem especificidade espectral para calcular a eficiência do FRET e a capacidade de separar espectralmente os sinais FRET de confundir autofluorescência e/ou sinais de rótulos fluorescentes adicionais. Aqui, apresentamos a metodologia de implementação de imagens FRET hiperespectrais, bem como a necessidade de construir uma biblioteca espectral apropriada que não seja subamostra nem supersamplada para realizar descomprturações espectrais. Enquanto apresentamos essa metodologia para medição de distribuições tridimensionais de cAMP em células endoteliais microvasculares pulmonares (PMVECs), essa metodologia poderia ser usada para estudar distribuições espaciais de cAMP em uma gama de tipos celulares.

Este protocolo descreve o uso de abordagens hiperespectrais de imagem e análise de FRET para medir gradientes cAMP em três dimensões espaciais em células vivas. Existem várias etapas fundamentais envolvidas na geração desses resultados, para as quais é necessária uma atenção cuidadosa ao analisar e quantificar os dados. Essas etapas-chave incluem a construção de uma biblioteca espectral apropriada, descompramento espectral de fundo, limiar para identificar bordas celulares e cálculos de eficiência do FRET. <strong class=...

Devido à relação sinal-ruído inerente (SNR) de sensores baseados em transferência de energia de ressonância (FRET) Fӧrster, a medição dos sinais cAMP tem sido desafiadora, especialmente em três dimensões espaciais. Aqui, descrevemos uma metodologia hiperespectral de imagem e análise de FRET que permite a medição da distribuição cAMP em três dimensões espaciais.

Medição de distribuições 3-dimensionales cAMP em células vivas usando imagens e análises hiperespectrais de FRET 4-Dimensional (x, y, z e λ) Hiperespectrais

Cyclic AMP is a second messenger that is involved in a wide range of cellular and physiological activities. Several studies suggest that cAMP signals are ...

Este protocolo é significativo, pois fornece um método para medir e visualizar sinais FRET ou AMP cíclico em três dimensões espaciais em células individuais. As distribuições de AMP cíclico podem ocorrer axialmente e lateralmente e é importante adquirir dados de imagem de AMP cíclico FRET em três dimensões para amostrar essas distribuições. No dia da imagem, os Tyrodes quentes tamponam a 37 graus Celsius em banho-maria e montam uma lamínula com as células transfectadas de interesse em uma câmara celular.Prenda a parte superior da câmara com uma junta de montagem para evitar vazamentos e use um limpador de tarefas delicadas para remover qualquer excesso de meio ou células aderentes da parte inferior da lamínula. Adicione 800 microlitros de tampão de trabalho e quatro microlitros de etiqueta nuclear de cinco milimolares à câmara celular e agite suavemente a câmara por cinco a 10 segundos. Em seguida, cubra a câmara celular com papel alumínio por uma incubação de 10 minutos em temperatura ambiente.Para obter imagens das células, selecione a objetiva de imersão em água 60X em um microscópio confocal equipado com um detector espectral e adicione uma gota de água à objetiva. Coloque a câmara de células carregada no microscópio stage e ajuste o botão do filtro para selecionar o conjunto de filtros apropriado. Selecione o modo de campo amplo de fluorescência e use as oculares para selecionar um campo de view contendo células que expressam o sensor AMP cíclico FRET.Abra o software de imagem, selecione o modo confocal e desbloqueie o botão de intertravamento do laser. Abra o menu de configurações A1. Marque as caixas correspondentes às linhas de laser de 405 e 561 nanômetros e defina essas detecções espectrais para SD, a resolução para 10 e os canais para 32.Selecione os valores de comprimento de onda inicial e final para definir a faixa de comprimento de onda. Abra o menu Configurações A1 para selecionar o ícone de salto de compartimentalização. Selecione a caixa número 15 e clique em OK. Defina as intensidades do laser para oito por cento para o laser de 405 nanômetros e para dois por cento para o laser de 561 nanômetros.Defina o ganho do detector para 149 e o raio do orifício para 2.4 unidades de disco Airy. Defina a velocidade de varredura para 25 quadros espectrais por segundo e selecione a direção de varredura unidirecional. Defina a contagem como quatro e o tamanho da varredura como 1024 por 1024.Para definir os parâmetros de aquisição da pilha z, clique em Exibir, Controle de aquisição e Aquisição ND e insira o destino e o nome do arquivo na janela pop-up para salvar o arquivo ND. Clique na caixa z-series e clique em Ao vivo na janela Configurações do A1 Plus para abrir uma janela de visualização ao vivo. Ajuste o botão de foco para focar nas células enquanto olha na janela de visualização.Ajuste o botão de foco no microscópio para selecionar a parte superior da célula e clique em Superior na janela ND Acquisition para definir a posição atual como a parte superior. Ajuste o botão de foco no microscópio para selecionar a parte inferior da célula e clique em Inferior para definir a posição atual como a parte inferior. Insira um micrômetro para o tamanho do passo.Selecione Superior inferior para a direção do z-scan e clique em executar para adquirir uma pilha z. Quando a aquisição da pilha z estiver completa, use uma pipeta para adicionar suavemente o reagente de interesse à câmara sem perturbar as células. Após 10 minutos, altere o nome do arquivo e adquira uma segunda imagem z-stack.Após a geração de imagens, crie novas pastas com os mesmos nomes de arquivo que as imagens espectrais da pilha z e abra o arquivo de imagem espectral de interesse. Clique em Arquivo, Importar/Exportar e Exportar Documento ND. Na janela pop-up, selecione a pasta recém-criada, TIFF para o tipo de arquivo, Imagem mono para cada canal e mantenha a profundidade de bits.Clique em exportar para exportar os arquivos individuais para a pasta e abrir o software de separação espectral linear. Abra a separação linear. m e clique em Executar.Procure e selecione a pasta que contém a sequência de arquivos TIFF exportada e clique em OK para abrir a janela de comprimento de onda e z-slice. Copie o nome do arquivo do primeiro arquivo sem o z-slice e o número do canal da pasta e cole-o na primeira etapa da caixa Digite o nome da imagem, insira o número de canais na caixa Insira o número de bandas de comprimento de onda e o número de z-slices na caixa Insira o número de Z Slices e clique em OK. Em seguida, na janela pop-up, navegue e selecione o Comprimento de onda. mat e clique em Abrir.Navegue e selecione o arquivo Library. mat na nova janela pop-up e clique em Abrir novamente para iniciar a desmistura da fatia. Para calcular a eficiência do FRET, abra o multiFRRCF.m e insira o número de tentativas experimentais a serem analisadas na caixa Quantas pastas refatiar. Clique em OK. Navegue para selecionar as pastas não misturadas e clique em OK novamente. Na nova janela pop-up, defina o fator de escala para 12,4, o limite para 56, a frequência X, Y e Z para cinco, cinco e um, respectivamente, e o algoritmo de suavização para gaussiano.Em seguida, clique em Executar para executar as medições e o refatiamento do FRET. Para mapear a eficiência do FRET para níveis de AMP cíclicos, abra o Mapping_FRET. Efficiency_to_cAMP_concentration. m e clique em Executar.Navegue até a primeira imagem FRET em tons de cinza e selecione-a e clique em OK. Em seguida, abra as imagens AMP cíclicas FRET para inspecionar a distribuição dos sinais AMP cíclicos em três dimensões. Nessas imagens, podem ser observadas visualizações tridimensionais de dados de imagem hiperespectral brutos de cor falsa adquiridos por microscopia confocal no início e 10 minutos após o tratamento com forscolina. Nesta análise, um fluoróforo aceptor foi completamente fotodestruído, permitindo a obtenção de assinaturas espectrais do doador e do aceptor com estequiometria um-para-um.Células não transfectadas marcadas com um corante nuclear foram utilizadas para obter o espectro puro do fluoróforo do corante. A combinação dos espectros do doador, do aceitador e dos fluoróforos de corante nuclear permite a criação de uma biblioteca de três componentes. Aqui, as fontes de três assinaturas espectrais de fundo podem ser observadas.Embora esses sinais sejam distribuídos de maneira não uniforme dentro da amostra e não possam ser simplesmente subtraídos, adicionar as assinaturas espectrais desses sinais à biblioteca espectral e usar a separação linear para separar os sinais fornece uma abordagem para remover esses sinais de confusão dos sinais doadores e aceitadores antes de calcular suas eficiências FRET. A biblioteca espectral de seis componentes pode então ser usada para realizar a separação espectral linear para cada fatia na imagem axial. Aqui, as mudanças na eficiência do FRET e nos níveis cíclicos de AMP em diferentes fatias do plano XY podem ser observadas, permitindo uma comparação entre as condições basais e as condições 10 minutos após o tratamento com forscolina.Essa técnica também pode ser usada para quantificar a eficiência do FRET de outros repórteres em três dimensões em células e tecidos.

measurement-3-dimensional-camp-distributions-living-cells-using-4

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós desenvolvemos uma plataforma de software que utiliza Imaris Neuroscience, ImarisXT e MATLAB para medir as alterações na morfologia de uma forma indefinida retirado tridimensional fluorescência confocal de células individuais. Esta nova abordagem pode ser utilizada para quantificar as alterações na forma da célula após a activação do receptor e, portanto, representa um instrumento adicional possível para a descoberta de drogas.

Uma ferramenta analítica que quantifica Alterações morfologia celular de imagens tridimensionais de fluorescência

Microscopia localização fotoativado (PALM), combinada com uma única molécula de rastreamento permite a observação direta e quantificação das interações DNA-proteína em células de Escherichia coli ao vivo.

Visualizando interações DNA-proteína em células bacterianas ao vivo usando fotoativado única molécula de Rastreamento

Para investigar as velocidades de fluxo e a direcionalidade da actina filamentosa na sinapse imunológica das células T, a imagem de super-resolução de células vivas é combinada com fluorescência de reflexão interna total e quantificada com espectroscopia de correlação de imagem espaço-temporal.

Cortical actina Fluxo nas células T quantificada pela correlação espacial e temporal Imagem Espectroscopia de iluminação estruturada Microscopia Dados

A imagem de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET) é uma ferramenta poderosa para estudos de biologia celular em tempo real. Aqui é apresentado um método para imagens de células FRET em microambientes fisiológicos de hidrogel tridimensional (3D) usando microscopia de epifluorescência convencional. Uma análise para sondas FRET raciométricas que produz razões lineares ao longo da faixa de ativação é descrita.

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Descreveremos um protocolo para a identificação do rótulo-livre dos subtipos de linfócito usando a imagem latente da fase quantitativa e um algoritmo de aprendizado de máquina. Medições de índice de refração 3D tomograms de linfócitos apresentam 3D informações morfológicas e bioquímicas para células individuais, que é, então, analisadas com um algoritmo de aprendizado de máquina para identificação dos tipos de células.

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Este protocolo descreve a análise de compartimentos intracelular cDNAs etiquetados no fermento de brotamento usando a microscopia confocal 4D (Time-Lapse 3D) multi-color. Os parâmetros de imagem são escolhidos para capturar sinais adequados, limitando o Fotodano. Os plugins personalizados do ImageJ permitem que as estruturas rotuladas sejam rastreadas e analisadas quantitativamente.

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A análise precisa de dados de microscopia multidimensional requer fluxos de trabalho complexos. Este artigo demonstra como usar o software Cell-ACDC. Ele aproveita modelos orientados por IA de última geração para segmentação, rastreamento, análise de linhagem celular e quantificação de dados de microscopia. Crucialmente, complementa esses modelos com uma estrutura inovadora para correção semiautomatizada da saída dos modelos.

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Aprenda a medir distribuições 3D de cAMP em células vivas usando imagens hiperespectrais FRET. Este método combina microscopia confocal com desmisturação linear para visualizar dinâmicas de sinalização celular em alta resolução.

Medição de distribuições 3-dimensionales cAMP em células vivas usando imagens e análises hiperespectrais de FRET 4-Dimensional (x, y, z e λ) Hiperespectrais (Vídeo) | JoVE Journal

Medição de distribuições 3-dimensionales cAMP em células vivas usando imagens e análises hiperespectrais de FRET 4-Dimensional (x, y, z e λ) Hiperespectrais

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