Preparação do Inóculo Enriquecido por Vírus para Infecção Oral de Abelhas (Apis mellifera)

Nosso protocolo demonstra como produzir partículas de vírus de abelhas melíferas em massa para seu uso em bioensaios controlados e de alto rendimento para triagem rápida da eficácia do tratamento viral. O ensaio usa pupas de abelha fáceis de cultivar em vez de cultura de células, reduzindo o trabalho de obtenção de sujeitos experimentais. O vírus pode então ser usado para produzir curvas de mortalidade previsíveis e bioensaios repetíveis.

Tem havido um interesse substancial em entender como os chamados vírus das abelhas afetam uma gama maior de hospedeiros. Esta técnica de produção de vírus pode ser emparelhada com outros sistemas de polinizadores para testar a infectividade. Para extração em massa de abelhas por auto-remoção larval, enjaule uma rainha de abelhas em uma estrutura de Langstroth vazia e prolongada e devolva-a à sua colônia.

Depois de permitir que a rainha ponha ovos na estrutura por 24 horas, verifique a estrutura para garantir que a maioria dos favos contenha ovos recém-postos e solte a rainha. Exatamente 192 horas após enjaular a rainha, remova a moldura da colônia e escove todas as abelhas adultas. Ao retornar ao laboratório, coloque a estrutura em uma incubadora ajustada às condições internas de uma colmeia e limpe completamente os recipientes da mesma altura e largura da estrutura cheia de larvas com sabão e água sequencial, água sanitária e lavagens com etanol.

Forre o fundo dos recipientes com várias camadas de papel toalha e adicione várias camadas sobrepostas de material absorvente mais fino. Quando os recipientes estiverem prontos, coloque a estrutura no lado focal das larvas do recipiente para baixo e use um pedaço de papel alumínio para cobrir o recipiente e a estrutura. Após a incubação durante a noite, levante cuidadosamente os lenços individuais da camada superior de cada recipiente para permitir que as larvas sejam despejadas suavemente em uma bandeja de transferência.

Em seguida, use uma pinça romba e macia para espalhar as larvas pela superfície das bandejas sem tocar e coloque a bandeja coberta com papel alumínio na incubadora até que as larvas se transformem em pupas e amadureçam até o estágio de olhos arregalados. Para a injecção viral das pupas, misturar as partículas virais de interesse na concentração adequada em PBS estéril num tubo de 15 mililitros e ligar um aparelho injector a uma multipipeta manual. Para testar a eficácia do injetor, carregue o injetor com 100 microlitros de água e dispense a água em doses de um microlitro.

Se as injeções forem precisas, carregue 100 microlitros da solução de partículas do vírus no injetor e segure suavemente uma pupa ao longo do tórax, aplicando pressão suficiente para forçar os fluidos internos no abdômen para tornar as divisões do tergito mais aparentes. Estabilizando o braço segurando a seringa contra a bancada do laboratório para apoio, insira a agulha apenas na cutícula entre o terceiro e o quarto tergitos abdominais e injete um microlitro de solução de vírus. Quando todas as pupas tiverem sido injetadas, cubra novamente a bandeja com papel alumínio antes de devolvê-las à incubadora por mais três a cinco dias.

No final da incubação, agrupar as pupas por fonte de colônia em tubos de centrífuga cônicos individuais de 50 mililitros e vórtice para homogeneizar o conteúdo. Para realizar um bioensaio de alimentação viral, tampe os orifícios de alimentação das gaiolas limpas com um tubo de centrífuga de tamanho apropriado e encha parcialmente os tubos de centrífuga de 15 mililitros com solução de alimentação recém-preparada. Em seguida, inverta os tubos e use uma tachinha para fazer um ou dois furos ao redor das pontas.

Em seguida, escove todas as abelhas recém-emergidas de suas caixas de emergência em um recipiente de coleta levemente revestido nas bordas com óleo vegetal e misture delicadamente as abelhas à mão. Transfira 35 abelhas individuais para um único copo untado e coloque o conteúdo do copo em uma gaiola de acrílico. Para preparar o inóculo do vírus, misture uma quantidade apropriada de partículas de vírus descongeladas e concentradas com solução de sacarose a 30% em um recipiente estéril por tipo de tratamento e adicione 600 microlitros de solução do vírus em bandejas de inóculo individuais.

Em seguida, insira cuidadosamente cada bandeja de inóculo em suas gaiolas correspondentes, tomando cuidado para não liberar acidentalmente nenhuma abelha. Quando todos os inóculos tiverem sido consumidos, substituir os tubos de centrifugação do orifício de alimentação superior pelos tubos de alimentação preparados e registar a mortalidade dentro de cada gaiola a intervalos de 12 horas durante as primeiras 72 horas do ensaio e de 24 em 24 horas a partir daí. Para remover as abelhas mortas, deslize a porta da gaiola apenas o suficiente para permitir que um par de pinças esterilizadas com álcool seja inserido para retirar as abelhas mortas.

Dependendo do projeto do experimento, coloque amostras vivas de cada gaiola em tubos de centrífuga individuais em gelo seco para permitir a amostragem para medições de títulos virais. Neste esforço representativo de colheita de vírus maiores, cada pupa foi inicialmente injetada com um inóculo de vírus de paralisia aguda israelense de aproximadamente 95%. Embora 10 das 16 amostras de colônias envolvidas nessas extrações contivessem vírus altamente puros, outras amostras variaram em sua proporção de vírus, com algumas até sendo dominadas por outros vírus, como o vírus da asa deformada.

Conforme ilustrado na tabela, os valores do ciclo de limiar podem ser usados como um preditor de proporção. A comparação das curvas de resposta à dose e sobrevivência de abelhas alimentadas com as mesmas partículas de vírus durante dois anos diferentes revela que, apesar dos parâmetros de teste idênticos, os ensaios realizados em 2018 e 2019 produziram respostas de sobrevivência visivelmente diferentes em todos, exceto nos grupos de tratamento de controle, que não receberam nenhum vírus em seu inóculo de sacarose. As respostas das abelhas à infecção viral podem variar muito, dependendo da estação, colmeia ou mesmo distribuição de inóculo dentro de gaiolas individuais.

Portanto, grandes tamanhos de amostra são críticos para confirmar os efeitos do tratamento. Usando estoques de partículas de vírus, o experimento pode ser expandido para incluir injeções de abelhas operárias adultas, rainhas ou zangões, ou para outras espécies de polinizadores para avaliar a gama de hospedeiros. Estoques infecciosos de vírus podem ser usados para testar como a infecção interage com outros fatores, como dieta, exposição a produtos químicos ou ambientes sociais.