Name: Preparação do Inóculo Enriquecido por Vírus para Infecção Oral de Abelhas (Apis mellifera) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprenda a produzir partículas virais de abelhas Apis mellifera em massa para bioensaios de alto rendimento. Este método utiliza pupas fáceis de cultivar, simplificando o estudo de infecções virais e interações hospedeiro-patógeno em pesquisas de virologia apícola.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de agradecer à Dra. Esses materiais contribuíram para projetos apoiados em parte pela Fundação de Pesquisa em Alimentos e Agricultura, sob a concessão de 549025.

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui delineamos métodos detalhando cada etapa do processo de amplificação do vírus e preparação do estoque inóculo, incluindo coleta de larvas e propagação de vírus, extração e concentração, bem como tratamento viral na forma de experimentos de alimentação de gaiolas. Esses métodos permitem a produção de partículas de vírus semi-puros (Figura 4), da qual a eficácia pode ser quantificada consistentemente por testes de mortalidade por dose-resposta para vírus letais para adultos (<strong class...

As abelhas de mel (Apis mellifera) desempenham um papel crítico na paisagem agrícola global moderna, mas atualmente sofrem de uma combinação de estressores bióticos e abióticos, incluindo exposição a pesticidas, forragem ruim, parasitas e patógenos 1,2. Um dos patógenos mais importantes de preocupação são os vírus, muitos dos quais são vetoriados por outro dos maiores estressores de abelhas, o ácaro varroa parasita (destruidor varroa). Esses vírus podem causar uma série de efeitos negativos nas abelhas, incluindo a redução da sobrevida da ninhada, defeitos de desenvolvimento e paralisia que podem levar ao colapso total da colmeia antes e depois do overwinteringperíodos 3,4,5. Embora tenha havido avanços promissores no desenvolvimento de tecnologias usadas para combater a infecção pelo vírus 6,7,8,9, a dinâmica pela qual muitos vírus se propagam, se espalham e interagem dentro de uma abelha ou colônia ainda são mal compreendidas 5,10 . Compreender a biologia básica das interações entre abelhas e vírus e suas relações com outros fatores ambientais é fundamental para o desenvolvimento de técnicas eficazes de manejo de vírus.
No entanto, estudar as interações mel-vírus representa desafios com inúmeros fatores conhecidos e desconhecidos que complicam o processo. Estes incluem interações com a dieta11,12, exposição a pesticidas13 e fundo genético de abelhas14,15. Mesmo focando apenas na infecção por vírus, complicações são comuns porque as populações de abelhas de mel, tanto controladas quanto selvagens, sempre têm algum grau de infecção por vírus de fundo, embora muitas vezes sem manifestar sintomas agudos16,17, e os efeitos da coinfecção do vírus não são bem compreendidos18. Isso tornou difícil o estudo dos efeitos do vírus das abelhas.
Muitos estudos sobre o vírus das abelhas têm usado infecções circunstanciais do vírus para procurar interações com outros estressores, observando como as infecções de fundo mudam com outros tratamentos 12,19,20,21. Embora essa abordagem tenha sido bem sucedida na identificação de efeitos importantes, especialmente descobrindo como os tratamentos pesticidas ou dietéticos afetam os níveis e a replicação do vírus, a inoculação com um tratamento de vírus de conteúdo e concentração conhecidos é fundamental para testes experimentais da dinâmica da infecção por vírus. Mesmo assim, separar o tratamento experimental da infecção em segundo plano também pode representar desafios. Em estudos de campo, pesquisadores têm cepas diferenciadas de vírus de asa deformada (DWV) para fornecer evidências para a transmissão de vírus de abelhas de mel para abelhas22, mas usar essa abordagem seria difícil apenas dentro das abelhas. Clones infecciosos de vírus são uma ferramenta poderosa, não apenas para rastrear infecções 23,24,25, mas para estudos de genética reversa de vírus de abelhas de mel e para pesquisas de interação entre vírus e hospedeiros 26,27,28. No entanto, na maioria dos casos, clones infecciosos ainda são necessários para cumprir o ciclo de infecção dentro das células para produzir partículas. Tais partículas são preferidas como inocula para tratamentos experimentais porque sua infectividade é maior do que o RNA viral nu e a inoculação com genomas encapsidados imita uma infecção natural.
A produção de inocula de vírus de abelhas de mel puro e não contaminado (cepas de vírus do tipo selvagem ou aquelas derivadas de clones infecciosos) também representam desafios. Estes se devem principalmente às dificuldades em obter uma linha de células de abelhas de mel confiável, continuamente replicante e livre de vírus para produzir vírus de cepa pura29,30. Embora algumas linhas celulares tenham sido produzidas, esses sistemas permanecem imperfeitos; ainda assim, há esperança de que uma linha celular viável possa ser produzida29, o que permitiria um controle mais fino da produção e investigação do vírus. Até que essa linha se torne amplamente disponível, a maioria dos protocolos de produção de vírus continuará a depender do uso do vírus in vivo e da purificação 18,31,32,33,34. Essas abordagens envolvem identificar e purificar partículas de vírus de interesse (ou produzir um clone infeccioso) e usá-las para infectar abelhas, geralmente como pupas. As pupas são injetadas com o vírus alvo e depois sacrificadas, e outras partículas são extraídas e purificadas. No entanto, como nenhuma abelha é livre de vírus para começar, há sempre algum grau de contaminação por vestígios de outros vírus em qualquer concentrado, e, portanto, deve-se tomar muito cuidado na escolha de abelhas com baixa probabilidade de infecções de fundo. Além disso, os métodos de remoção da pupae das células pente-pente para uso nesses protocolos33 são muito trabalhosos e podem induzir o estresse nas abelhas, limitando a produção por esses meios 18,32. Aqui, relatamos um método alternativo que permite a remoção em larga escala de larvas com pouco trabalho de parto e menos estresse mecânico nas abelhas.
Uma vez que as pupas são obtidas e injetadas com o vírus inicial inóculo, elas devem ser incubadas para fornecer tempo para o vírus se replicar. Posteriormente, partículas de vírus produzidas podem ser processadas em uma forma utilizável para infectar abelhas experimentais. Existem vários métodos simples para conseguir isso, incluindo o uso de um homogenemente bruta 35,36 ou hemoglifo gerado a partir de abelhas viralmente infectadas como fonte de infecção37. Esses métodos são eficazes, mas têm maior chance de introduzir variáveis desconhecidas do substrato de fundo (por exemplo, outros fatores nos homogeneizadores de abelhas mortas). Além disso, é desejável concentrar as partículas se um experimento requer dar uma grande dose conhecida de um vírus em um curto período de tempo. Portanto, para um melhor controle, é preferível usar métodos que permitam algum nível de purificação e concentração das partículas do vírus. Geralmente, uma série de etapas de precipitação e centrifugação resultarão na remoção de quase todos os possíveis materiaisnão-alvos do vírus 33.
Após produzir esse inóculo concentrado, é benéfico quantificar os títulos virais (qPCR) e caracterizá-lo com bioensações in vivo para testar sua viabilidade e capacidade de causar mortalidade, bem como corroborar que o aumento dos do vírus são obtidos após a infecção. Isso pode ser alcançado através de experimentos de injeção (seja em pupas ou adultos) ou experimentos de alimentação (em larvas ou adultos). Embora todas essas abordagens sejam possíveis, alimentar-se de grupos de abelhas adultas em uma gaiola é muitas vezes o mais rápido e simples. O método de ensaio da gaiola também é amplamente utilizado para testar vários outros tratamentos sobre abelhas, incluindo toxicidade de pesticidas38, desenvolvimento de ovário39 e influência nutricional no comportamento40,41 e, portanto, pode formar uma boa base para experimentos que ligam a infecção pelo vírus a outros fatores42.
Aqui descrevemos um método confiável para produzir grandes quantidades de partículas de vírus semi-puras e altamente enriquecidas sem o uso de uma ultracentrifuagem cara, incluindo um método para remover pupas que reduz o trabalho e o estresse mecânico nas abelhas e um bioensato altamente repetitivo e de alto rendimento para testar infecções e efeitos virais. Controlando firmemente a pureza do inocula viral, os pesquisadores são capazes de reduzir a variação da resposta viral das abelhas em relação a outros métodos de inoculação viral. Além disso, o bioensativo pode testar efeitos virais em um nível de pequenos grupos usando unidades experimentais altamente repetíveis antes de escalar para configurações realistas de campo, o que é muito mais trabalhoso para gerenciar. Em combinação, esses dois métodos fornecem as ferramentas necessárias para estudos que podem ajudar a melhorar nossa compreensão geral das interações fisiológicas do vírus das abelhas.

<table><tbody><tr>Solução <td></td><td></td><td></td>de <td>alvejante a 10%</td></tr><tr><td>24:1 clorofórmio:álcool isoamílico</td><td>SigmaAldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr>Solução <td></td><td></td><td></td>de<td>etanol a 70%</td></tr><tr><td>Gaiolas para bioensaio</td><td></td><td></td><td>Dependente de configuração experimental</td></tr><tr><td>Combitips Advanced 0,1 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089405</td><td>Opcional (se nenhum injetor estiver disponível)</td></tr><tr><td>Recipientes para auto-remoção</td><td></td><td></td> de larvas <td>Devem medir aproximadamente 19" x 9-1/8" (dimensões profundas do quadro Langstroth)</td></tr><tr><td>Pinças</td><td></td><td></td><td>sem corte, macias para separação larval; pinças sem corte e duras para excisão de pupas</td></tr> Incubadora <tr><td></td> de capela <td></td><td></td><td></td>de fumos</tr><tr><td></td> Capaz de manter 34 &ordm;<td></td><td></td><td> C e 50% de umidade relativa</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>Qualquer lenço absorvente funcionará</td></tr><tr><td>Barcos</td><td></td><td></td> de peso médio <td>Servem como bandejas de inóculo</td></tr><tr><td>Microcon-100kDa com membrana Biomax</td><td>MilliporeSigma</td><td>MPE100025</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luvas</td><td></td><td></td><td></td>de nitrilo</tr><tr><td>Fosfato solução salina tamponada (PBS)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol 8000 (PEG)</td><td>SigmaAldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td>refrigerada de bancada Capaz de 15.000 x g</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td> refrigerada <td>Capaz de 21.000 x g</td></tr><tr><td>Repetidor M4 Multipipeta</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Opcional (se nenhum injetor appartus for disponível)</td></tr> <tr><td>RNAse Away</td><td>ThermoFisher</td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de RNAse</td><td>SigmaAldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>SigmaAldrich</td><td>T1375</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação do inóculo enriquecido por vírus para infecção oral de abelhas (apis mellifera)

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

As abelhas são de grande importância ecológica e agrícola em todo o mundo, mas também estão sujeitas a uma variedade de pressões que afetam negativamente a saúde das abelhas, incluindo a exposição a patógenos virais. Esses vírus podem causar uma grande variedade de efeitos devastadores e muitas vezes podem ser desafiadores para estudar devido a múltiplos fatores que dificultam a separação dos efeitos dos tratamentos experimentais da infecção de fundo pré-existente. Aqui apresentamos um método para produzir em massa grandes quantidades de partículas de vírus, juntamente com um bioensaio de alto rendimento para testar infecções e efeitos virais. Necessitadas pela atual falta de uma linha celular de abelhas de mel contínua e livre de vírus, as partículas virais são amplificadas in vivo usando pupas de abelha mel, que são extraídas da colmeia em grandes volumes usando metodologia minimamente estressante. Essas partículas de vírus podem então ser usadas em bioensações de gaiolas de abelhas para testar a viabilidade do inocula, bem como várias outras dinâmicas de infecção por vírus, incluindo interações com nutrição, pesticidas e outros patógenos. Uma grande vantagem do uso dessas partículas é que ela reduz consideravelmente as chances de introduzir variáveis desconhecidas na experimentação subsequente quando comparadas às alternativas atuais, como infecção por hemoglifo de abelha infectada ou homogeneização, embora ainda deva ser tomado cuidado ao fornecer as abelhas, para minimizar a contaminação do vírus de fundo. Os ensaios da gaiola não substituem experimentos realistas em larga escala que testam efeitos de infecção por vírus em nível de colônia, mas funcionam como um método para estabelecer respostas virais de linha de base que, em combinação com as partículas de vírus semi-puros, podem servir como ferramentas importantes para examinar várias dimensões das interações fisiológicas do vírus das abelhas.

Seguindo com sucesso os protocolos (Figuras 1) para injeção de pupal e extração viral devem produzir grandes quantidades de partículas de vírus. No entanto, a amostragem e a injeção de pupas provenientes de uma variedade de colônias em vários pontos de tempo maximiza as chances de adquirir vírus alvo com baixa contaminação. A dinâmica pela qual os vírus se replicam e interagem entre si dentro de uma abelha não é bem compreendida; juntamente com a probabilidade de infecção pré-existente, não há garantia d...

Aqui descrevemos dois protocolos: primeiro para propagar, extrair, purificar e quantificar grandes quantidades de partículas de vírus não envoltas em abelhas, incluindo um método para remover pupas de abelha mel e segundo para testar os efeitos da infecção viral usando um bioensaão de gaiola altamente repetigível e de alto rendimento.

Preparação do Inóculo Enriquecido por Vírus para Infecção Oral de Abelhas (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Nosso protocolo demonstra como produzir partículas de vírus de abelhas melíferas em massa para seu uso em bioensaios controlados e de alto rendimento para triagem rápida da eficácia do tratamento viral. O ensaio usa pupas de abelha fáceis de cultivar em vez de cultura de células, reduzindo o trabalho de obtenção de sujeitos experimentais. O vírus pode então ser usado para produzir curvas de mortalidade previsíveis e bioensaios repetíveis.Tem havido um interesse substancial em entender como os chamados vírus das abelhas afetam uma gama maior de hospedeiros. Esta técnica de produção de vírus pode ser emparelhada com outros sistemas de polinizadores para testar a infectividade. Para extração em massa de abelhas por auto-remoção larval, enjaule uma rainha de abelhas em uma estrutura de Langstroth vazia e prolongada e devolva-a à sua colônia.Depois de permitir que a rainha ponha ovos na estrutura por 24 horas, verifique a estrutura para garantir que a maioria dos favos contenha ovos recém-postos e solte a rainha. Exatamente 192 horas após enjaular a rainha, remova a moldura da colônia e escove todas as abelhas adultas. Ao retornar ao laboratório, coloque a estrutura em uma incubadora aj

preparation-virus-enriched-inoculum-for-oral-infection-honey-bees

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Demonstramos como implementar um método de farmacologia comportamental em um paradigma de condicionamento apetitivo olfativa de abelhas (Apis mellifera) por aplicação sistêmica de medicamentos. Este método permite investigação dos mecanismos subjacentes à aprendizagem e formação da memória de uma forma simples e confiável.

Farmacologia Comportamental no condicionamento clássico da Resposta Extensão Proboscis em Abelhas ( Apis mellifera)

Descrevemos o processo de isolamento de DNA de alta pureza herpesvirus nucleocapsídeo das células infectadas. O DNA final capturada a partir de solução é de alta concentração e pureza, tornando-a ideal para high-throughput seqüenciamento de alta fidelidade reações PCR e transfections para produzir novos recombinantes viral.

Preparação de DNA viral a partir nucleocapsids

Neste protocolo, descrevemos duas estratégias que suprimem simultaneamente dois genes (gene knockdown double) em abelhas. Em seguida, apresentamos como usar a resposta de extensão probóscide (PER) ensaio para estudar o efeito do gene knockdown duplo em mel de abelha percepção gustativa.

RNAi mediado por Gene Knockdown duplo e Mensuração Percepção gustativa em abelhas do mel (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

Aqui apresentamos um protocolo para propagar células Homalodisca vitripennis e HoCV-1 in vitro. Médio foi removido do HoCV-1 culturas positivas e RNA extraído a cada 24 horas para 168 horas. A capacidade de sobrevivência das células foi quantificada por coloração com azul de tripano. Partículas de vírus inteiros foram extraídos após a infecção. RNA extraído foi quantificada por qRT-PCR.

Propagação de<em&gt; 01-vírus Homalodisca coagulata</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cultura de Células

Aqui nós descrevemos nosso protocolo detalhado para a preparação de colônias de abelhas-coorte único - uma ferramenta útil para analisar a fisiologia trabalhador associada à função. Descrevemos também protocolos detalhados para o tratamento de trabalhadores com hormônio juvenil e ecdisona para avaliar o envolvimento desses hormônios na regulação do comportamento do trabalhador e / ou fisiologia.

Preparação de Colônias-coorte único e tratamento hormonal do trabalhador de abelhas para analisar Fisiologia Associated com a função e / ou sistema endócrino

Consórcios microbianos dentro bumble colmeias enriquecem e preservar o pólen para larvas de abelha. Usando o sequenciamento de próxima geração, juntamente com o laboratório e experiências no terreno, este manuscrito descreve protocolos usados para testar a hipótese de que resíduos do fungicida alteram o pólen microbiome e demografia de colônia, finalmente levando à colônia perda.

Técnicas empíricas, metagenômicas e computacionais iluminam os mecanismos pelos quais os fungicidas comprometem a saúde das abelhas

Este manuscrito descreve vários protocolos para a administração de agentes farmacológicos para as abelhas, incluindo métodos não invasivos simples para abelhas de vôo livre, bem como variantes mais invasivos que permitem que o tratamento localizado precisa de abelhas dispositivos de retenção.

Manipulação neurofarmacologia de contido e vôo livre abelhas do mel,<em&gt; Apis mellifera</em

Apresentamos aqui   um método para alimentar pesticida alimentos contaminados se tanto a um indivíduo abelha do mel e uma colónia colmeia. O procedimento avalia o efeito pesticida em abelhas de mel individuais por alimentação in vivo de dieta da larva de base e também na condição natural da colónia colmeia.

Avaliando o efeito de substâncias químicas ambientais em Honey Bee Desenvolvimento do indivíduo para Colony Nível

Doses subletais de pesticidas podem afetar colônias nas maneiras que são difíceis de detectar usando métodos somente periódicos ou visuais. Métodos para medir a massa total de abelha adulta, ninhada e os recursos alimentares por pesagem urticária e partes da colmeia, fotografando quadros e instalação de sensores, são fornecidos. Análise de dados também é abordada.

Monitoramento de nível de colônia os efeitos da exposição de pesticidas subletais em mel de abelhas

Este protocolo foi desenvolvido para aprimorar a compreensão de como os agrotóxicos afetam a reprodução das abelhas de mel (Apis mellifera),estabelecendo métodos para expor rainhas das abelhas e seus cuidadores de trabalhadores a agrotóxicos em um ambiente controlado e laboratorial e monitorando cuidadosamente suas respostas relevantes.

Avaliando o risco agroquímico para rainhas de abelhas de mel acasaladas

Essa metodologia, que incluiu alimentação por via oral e infecção por injeção intratorácica, foi capaz de avaliar efetivamente a influência das barreiras do intestino médio e/ou glândulas salivares na infecção por arbovírus.

Infecção viral experimental em mosquitos adultos por alimentação oral e microinjeção

Aprenda a produzir partículas virais de abelhas Apis mellifera em massa para bioensaios de alto rendimento. Este método utiliza pupas fáceis de cultivar, simplificando o estudo de infecções virais e interações hospedeiro-patógeno em pesquisas de virologia apícola.

Preparação do Inóculo Enriquecido por Vírus para Infecção Oral de Abelhas (Apis mellifera)

Explorar mais vídeos