Microscopia da Força Atômica Combinada com Espectroscopia Infravermelha como ferramenta para sondar química de bacterium único

O método permite estudos em nanoescala de bactérias. Ele nos fornece informações detalhadas sobre as alterações químicas na resistência antimicrobiana. Portanto, pode contribuir para nossa compreensão da RAM e do desenvolvimento de medicamentos.

O tamanho em nanoescala das bactérias limita significativamente as ferramentas de pesquisa disponíveis capazes de sondar sua química. O AFM-IR nos permite fazê-lo de maneira não destrutiva e independente do observador, mesmo no nível subcelular. Ao fornecer uma visão sobre a resistência antimicrobiana, o método pode ajudar a identificar e testar alvos moleculares para novos antimicrobianos.

Além das bactérias, o AFM-IR pode sondar uma variedade de células, tecidos e até vírus. Para preparar uma amostra para a imagem latente do AFM-IR, após ter crescido as bactérias de interesse no meio apropriado sob as condições apropriadas da cultura, use um laço estéril para escolher cuidadosamente as bactérias da parte superior das colônias para transferir a um tubo de vidro. Adicione um mililitro de água ultrapura ao tubo e vortex por um a dois minutos até que o pellet bacteriano coletado não seja mais visível no fundo do tubo.

Estime a turbidez aproximada da solução por comparação visual entre a solução preparada e os padrões de McFarland. Se a turbidez da suspensão bacteriana parecer muito baixa, continue a adicionar mais bactérias e a vórtice até que a turbidez áspera da solução seja comparável aos padrões de 0,5 e 1 de McFarland. Pulverizar as bactérias por centrifugação e aspirar cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta.

Ressuspenda o pellet de células bacterianas em um mililitro de água ultrapura com vórtice e sedimente as bactérias com outra centrifugação. Depois de lavar a bactéria até mais três vezes, como acabamos de demonstrar, aspire o sobrenadante e vortex o pellet por pelo menos dois minutos antes de adicionar cinco microlitros de células ao substrato experimental. Se a espessura desejada for uma monocamada ou bactérias individuais, imediatamente após a deposição, adicione entre 20 a 100 microlitros de água ultrapura ao substrato e misture suavemente a solução com uma ponta de pipeta.

Quando a amostra tiver secado ao ar, use fita adesiva dupla face para montar o substrato em um disco de amostra de metal AFM. Para preparar o instrumento da espectroscopia do AFM-IR para uma análise, pressione Inicialize após ter girado sobre o software e o laser e confirme que o obturador do laser está na posição aberta. Durante esse processo, a janela Stage Initialization será exibida.

Quando o processo de inicialização for concluído, clique em Inicializar e em OK. Se possível, ligue o fluxo de nitrogênio para purgar o instrumento com nitrogênio e ajuste a purga de nitrogênio para atingir um nível de umidade estável. Com cuidado, coloque a amostra na câmara de amostra sem danificar a ponta e clique em Carregar no software. Siga o assistente para carregar a amostra, concentrando-se na ponta e na amostra em cada etapa.

Em seguida, clique em Abordagem para abordar a amostra sem se envolver. Antes de envolver a amostra, selecione Ferramentas, Calibração de fundo IR e Novo. Na janela pop-up, defina a resolução e a faixa espectral de acordo com o objetivo da análise e defina as comédias e os planos de fundo para valores médios.

Selecione Ativar. Na janela pop-up, defina os parâmetros inicial e final e clique em Aceitar e Adquirir. Quando os dados em segundo plano forem adquiridos, clique em Salvar.

Para envolver a ponta na amostra, clique em Engajar. O sistema se aproximará da superfície da amostra até que o contato direto seja detectado. Clique em Digitalizar para coletar uma área maior inicial, imagem AFM de baixa resolução espacial para visualizar a superfície antes de mover a ponta para um ponto de medição de interesse.

Para alinhar o laser infravermelho a um número de onda no qual a amostra será absorvida, insira o número de onda no qual a amostra será absorvida no campo Número de onda e clique em Iniciar IR.At pelo menos um pico claro deve ser observado no gráfico Amplitude versus frequência. O gráfico de deflexão versus tempo deve mostrar uma forma de onda periódica. Clique em Otimizar para selecionar um espectro de bactérias infravermelhas convencional para identificar as posições das bandas e usar o espectro para otimizar os pontos de acesso em vários valores de número de onda de várias regiões espectrais.

Quando os pontos infravermelhos para valores de número de onda selecionados tiverem sido otimizados, defina a resolução espectral e o intervalo e o número de comédias e clique em Adquirir para coletar o espectro AFM-IR. Para coletar uma imagem de distribuição de intensidade para um valor de número de onda selecionado, após gravar um único espectro AFM-IR, grave uma imagem AFM da área de amostra selecionada e selecione os valores de número de onda para imagens AFM-IR. Confirme se o ponto IR do laser foi otimizado para os valores de número de onda selecionados e defina o número de pontos de dados nas direções X e Y da área da imagem.

Na janela Geral, defina a potência do laser. Na janela AFM Scan, defina a taxa de digitalização. Em seguida, marque a caixa IR Imaging Enable e clique em Scan para iniciar a geração de imagens.

O AFM-IR da intensidade do sinal no número de onda selecionado será coletado simultaneamente com os dados do AFM dessa área. Este protocolo permite a aquisição de uma variedade de tipos de distribuições de células bacterianas em um substrato, desde células únicas até monocamadas e multicamadas. O protocolo pode ser usado para monitorar mudanças dinâmicas em bactérias vivas.

Por exemplo, na formação de um septo durante a divisão celular de S.aureus. O espectro do AFM-IR do septo foi caracterizado por uma intensidade relativa mais alta das faixas em 1, 240 e 1, 090 centímetros comparados aos espectros do AFM-IR recolhidos da área de pilha, sugerindo que o septo é compo dos grupos do carboidrato e do fosfodiéster de componentes da parede celular. O protocolo também pode ser usado para estudar diferenças na composição química decorrentes do desenvolvimento de resistência.

Conforme observado nesta análise representativa, nenhuma diferença morfológica foi medida entre a resistência intermitente à vancomicina e as células de S. aureus suscetíveis à vancomicina. A avaliação dos espectros de AFM-IR e seus segundos derivados, no entanto, revelou um claro aumento na intensidade relativa das bandas associadas aos grupos carboidrato e fosfodiéster dos componentes da parede celular na cepa resistente em comparação com a contraparte suscetível. É importante preparar uma amostra limpa, portanto, tome cuidado para reduzir a contribuição do meio desde o início e removê-la completamente de várias lavagens.

Desde que o AFM-IR é uma técnica não-destrutiva, a amostra pode mais tarde ser estudada com outras técnicas, tais como a coloração ou a espectroscopia confocal do íon, que podem fornecer a informação complementar sobre sua química.