Name: Purificação de Afinidade MS2 juntamente com sequenciamento de RNA em bactérias gram-positivas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprenda a purificação de afinidade MS2 com sequenciamento de RNA para identificar redes regulatórias de sRNA em bactérias Gram-positivas. Este método revela parceiros de RNA e mecanismos de virulência.

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Este trabalho foi apoiado pela "Agence Nationale de la Recherche" (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH, e ANR-18-CE12-0025-04, CoNoCo, to PR). Também foi publicado sob o âmbito do laboratórioEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 e do ANR-17-EURE-0023 (para RP), como financiamento do Estado administrado pela ANR como parte dos investimentos para o futuro programa. A DL foi apoiada pelo programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o Acordo de Subvenção Marie Skłodowska-Curie nº 753137-SaRNAReg. O trabalho no E. Massé Lab tem sido apoiado por subvenções operacionais dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR), do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) e dos Institutos Nacionais de Saúde NIH Team Grant R01 GM092830-06A1.

1. Buffers e mídia
<ol><li>Para experimentos maps, prepare os seguintes buffers e mídia: - Buffer A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 e 1 mM DTT) - Buffer E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltose, 0,1% Triton, 1 mM MgCl2 e 1 mM DTT) - Tampão de carregamento de RNA (0,025% cianol de xileno e 0,025% azul bromofenol em 8 M de ureia) - Infundição do Coração Cerebral (BHI) médio (12,5 g de cérebro de bezerro, 10 g de peptone, 5 g de coração de carne bovina, 5 g de NaCl, 2,5 g de Na2HPO4 e 2 g de glicose para 1 L) - Caldo de Lysogeny (LB) médio (10 g de peptone, 5 g de extrato de levedura e 10 g de NaCl para 1 L)</li>
	<li>Para ensaios de manchas do Norte, prepare os seguintes buffers: - Solução de bloqueio (1x ácido maleico e 1% de reagente de bloqueio) - Solução de hibridização (50% formamida, 5x SSC, 7% SDS, solução de bloqueio de 1% e sarcosina N-lauryl de 0,2%, fosfato de sódio de 50 mM). Aqueça com agitação para dissolver. ATENÇÃO: Siga cuidadosamente as precauções de segurança relacionadas a cada produto. - 1 M fosfato de sódio (58 mM de fosfato de sódio dibásico e 42 mM monofasico de sódio) - Soro fisiológico, fole de citrato de sódio (SSC), concentrado de 20x (3 M NaCl e 300 mM citrato de trissódico)</li>
</ol>2. Questões de segurança 
<ol><li>Realize todas as etapas envolvendo bactérias patogênicas viáveis em um laboratório de contenção nível 2. NOTA: Somente extratos celulares podem ser retirados após a lise (etapa 5).</li>
	<li>Coloque um jaleco e luvas.</li>
	<li>Certifique-se de que os pulsos estão cobertos.</li>
	<li>Limpe o armário de segurança biológica (Classe II) com uma solução desinfetante.</li>
	<li>Descarte resíduos sólidos expostos a bactérias na lixeira biomédica apropriada.</li>
	<li>Trate frascos contendo líquidos contaminados com uma solução desinfetante. Então, descarte-o em uma pia.</li>
	<li>Lave cuidadosamente as mãos e pulsos com sabão e remova o jaleco antes de sair do laboratório de contenção nível 2.</li>
</ol>3. Construção plasmid 
NOTA: Para fins de clonagem, é crucial primeiro identificar os limites do sRNA endógeno. Os plasmídeos pCN51-P3 e pCN51-P3-MS2 são descritos em Tomasini et al. (2017)27. O promotor P3 permite a alta expressão do sRNA de forma dependente da densidade celular (ou seja, quando as bactérias entram na fase estacionária do crescimento). Muitas estafilocócicas se acumulam durante esta fase de crescimento.
<ol><li>Amplie a sequência de sRNA por PCR usando uma polimerase de DNA de alta fidelidade e uma máquina PCR. Siga cuidadosamente as instruções do fabricante e leia Garibyan e Avashia (2013)31 para mais detalhes.</li>
	<li>Use os seguintes modelos para projetar os primers específicos: <img alt="Equation 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61731/text12.png"> e 5'-CGCGGATCC(N)-3' para primers dianteiros e invertidos, respectivamente. NOTA: Estes oligonucleotídeos permitem fundir a sequência MS2 (em negrito) ao final de 5' do sRNA de interesse. Pst Os locais de restrição I e BamHI (sublinhados) são adicionados nas extremidades de 5' e 3' da construção MS2-sRNA para clonar o amplicon no plasmídeo pCN51-P327. (N) corresponde à sequência específica do gene (15-20 nucleotídeos).</li>
	<li>Digerir 1 μg de plasmídeo pCN51-P3 e 1 μg do produto MS2-sRNA PCR com 2 U de PstI e 1 U de BamHI no buffer apropriado de acordo com as recomendações do fabricante.</li>
	<li>Incubar 1h a 37 °C e purificar o DNA usando um kit de purificação pcr (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Misture o plasmídeo digerido pCN51-P3 (300 ng) e o amplicon MS2-sRNA (razão molar para vetor:insert = 1:3) em um tubo de 1,5 mL. Consulte Revie et al. (1988)32 para maximizar a eficiência da ligadura. Adicione 1 μL do Tampão ligase e 10 U de Ligase T4 em cada tubo. Ajuste o volume para 10 μL com água ultrapura.</li>
	<li>Incubar a 22 °C por pelo menos 2 h.</li>
	<li>Adicione 5 μL de mistura de ligadura a 50 μL de células E. coli congeladas quimicamente competentes. Leia Seidman et al. (2001)33 para saber mais sobre transformação plasmída e células quimicamente competentes.</li>
	<li>Incubar 30 minutos no gelo.</li>
	<li>Choque térmico (45 s a 42 °C) o tubo de transformação usando um bloco de calor ou banho de água.</li>
	<li>Adicione 900 μL de meio LB e incubar a 37 °C por 30 min.</li>
	<li>Placa 100 μL da suspensão bacteriana em uma placa de ágar LB suplementada com ampicillina (100 μg/μL). NOTA: o vetor pCN51-P3 codifica um gene de resistência à ampicilina, que permite selecionar apenas clones E. coli carregando o plasmídeo pCN51-P3-MS2-sRNA.</li>
	<li>Extrair o plasmídeo pCN51-P3-MS2-sRNA de uma cultura bacteriana durante a noite (5 mL) cultivada na presença de ampicillina (100 μg/μL) utilizando um kit de miniprep de DNA plasmídeo (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Verifique a construção por Sanger sequenciamento34 usando o seguinte primer, 5'-TCTCGAAAATAGAGAGGG-3'.</li>
	<li>Transforme o plasmídeo pCN51-P3-MS2-sRNA em células E. coli quimicamente competentes. Repita as etapas 3.7 a 3.11.</li>
	<li>Extrair o plasmídeo pCN51-P3-MS2-sRNA (ver passo 3.12) e transformar 1-5 μg de DNA plasmídeo em células eletrocompetuntes HG001 ΔsRNA S. aureus usando um aparelho de eletroporação. Siga cuidadosamente as instruções do fabricante. Leia Grosser e Richardson (2016)35 para saber mais sobre métodos de preparação de eletrocompetente S. aureus. ATENÇÃO: Esta etapa envolve o manuseio de bactérias patogênicas (ver passo 2).
</li>
	<li>Adicione 900 μL de bhi médio e incubar a 37 °C por 3 h.</li>
	<li>Centrífuga 1 min a 16.000 x g. Descarte o supernaspeso.</li>
	<li>Resuspenja a pelota em 100 μL de BHI e emplaque a suspensão bacteriana em placas de ágar BHI suplementadas com eritromicina (10 μg/μL). NOTA: O vetor pCN51-P3 também codifica um gene de resistência à eritromicina, que permite selecionar apenas clones S. aureus carregando o plasmídeo pCN51-P3-MS2-sRNA.</li>
</ol>4. Colheita de bactérias
ATENÇÃO: Esta etapa envolve o manuseio de bactérias patogênicas (ver passo 2).
<ol><li>Cresça uma colônia de cepas que carregam pCN51-P3-MS2-sRNA ou pCN51-P3-MS227 plasmídeos em 3 mL de BHI médio suplementado com eritromicina (10 μg/μL) em duplicatas.</li>
	<li>Diluir cada cultura durante a noite em 50 mL (≈1/100) de meio BHI fresco suplementado com eritromicina (10 μg/μL) para atingir um OD600nm de 0,05. Use frascos esterilizados de 250 mL (proporção frasco de 5:1 frasco para médio). NOTA: As condições médias e de crescimento devem ser definidas de acordo com o padrão de expressão do sRNA estudado.</li>
	<li>Cresça culturas a 37 °C com agitação a 180 rpm por 6h.</li>
	<li>Transfira cada cultura para um tubo de centrífuga de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar a 2.900 x g durante 15 min a 4 °C. Descarte o supernaspeso.</li>
	<li>Mantenha pelotas no gelo e realize diretamente a lise celular mecânica (passo 5) ou congele e armazene pelotas a -80 °C.</li>
</ol>5. Lise celular mecânica 
ATENÇÃO: As seguintes etapas devem ser realizadas no gelo e os buffers devem estar a 4 °C. Use luvas e tome todas as precauções para proteger amostras de RNases.
<ol><li>Pelotas resuspend (passo 4.6) em 5 mL de Buffer A.</li>
	<li>Transfira as células resuspended em tubos centrífugas de 15 mL com 3,5 g de contas de sílica (0,1 mm).</li>
	<li>Inserir tubos em um instrumento de lise celular mecânica (ver Tabela de Materiais). Executar um ciclo de 40 s a 4,0 m/s. NOTA: Se um ciclo não for suficiente para quebrar células, deixe o dispositivo esfriar por 5 minutos enquanto mantém amostras no gelo. Em seguida, repita outro ciclo de 40 s a 4,0 m/s. A eficiência da lise celular pode ser testada emplacando o supernascido na placa BHI-ágar.</li>
	<li>Centrifugar a 15.700 x g por 15 min. Recupere o supernaspe e mantenha-o no gelo.</li>
</ol>6. Preparação da coluna
ATENÇÃO: Tenha cuidado para não permitir que a resina de amilolose seque. Se necessário, sele a coluna com uma tampa final. Prepare todas as soluções antes de iniciar a purificação de afinidade.
<ol><li>Coloque uma coluna de cromatografia em um rack de coluna (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Retire a ponta da coluna e lave a coluna com água ultrapura.</li>
	<li>Adicione 300 μL de resina de amilolose.</li>
	<li>Lave a coluna com 10 mL de Buffer A.</li>
	<li>Diluir 1.200 pmol de proteína MBP-MS2 em 6 mL de Buffer A e carregá-lo na coluna.</li>
	<li>Lave a coluna com 10 mL de Buffer A.</li>
</ol>7. Purificação de afinidade MS2 (Figura1)
<ol><li>Coloque a célula na coluna. NOTA: Mantenha 1 mL do lysato celular (Extrato bruto, CE) para extrair RNA total (etapa 8) e realizar a análise da mancha norte (etapa 9) e transcriômica (etapa 10).</li>
	<li>Colete a fração de fluxo (FT) em um tubo de coleta limpo.</li>
	<li>Lave a coluna 3 vezes com 10 mL de Buffer A. Colete a fração de lavagem (W).</li>
	<li>Elute a coluna com 1 mL de Buffer E e colete a fração de eluição (E) em um microtubo de 2 mL.</li>
	<li>Mantenha todas as frações coletadas no gelo até a extração de RNA (etapa 8) ou congele-as a -20 °C para uso posterior.</li>
</ol>8. Extração de RNA de frações coletadas (CE, FT, W e E)
<ol><li>Use 1 mL de cada fração (incluindo FT e W) para extração de RNA.</li>
	<li>Adicione 1 volume de fenol. Misture vigorosamente. ATENÇÃO: O fenol é volátil e corrosivo, presta atenção e trabalha com segurança sob um capô de fumaça.</li>
	<li>Centrifugar a 16.000 x g por 10 min a 20 °C.</li>
	<li>Transfira a fase superior em um microtubo limpo de 2 mL.</li>
	<li>Adicione 1 volume de clorofórmio/isoamílico (24:1) e repita as etapas 8,3 a 8,4. ATENÇÃO: Trabalhe com segurança sob um capô de fumaça.</li>
	<li>Adicione 2,5 volumes de etanol frio 100% e 1/10 de volume de acetato de sódio de 3 M (NaOAc) pH 5,2.</li>
	<li>Precipitar durante a noite a -20 °C. NOTA: A precipitação também pode ser realizada em um banho de gelo seco/etanol durante 20 min ou a -80 °C durante 2 h.</li>
	<li>Centrifugar a 16.000 x g para 15 min a 4 °C. Retire lentamente o etanol com uma pipeta enquanto tome cuidado para não perturbar a pelota. ATENÇÃO: A pelota de RNA nem sempre é visível e às vezes é solta na presença de etanol.</li>
	<li>Adicione 500 μL de 80% de etanol frio.</li>
	<li>Centrifugar a 16.000 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Descarte o etanol tubondo-o lentamente. Seque a pelota usando um concentrador de vácuo, 5 min no modo de execução.</li>
	<li>Resuspenque a pelota em um volume apropriado (15-50 μL) de água ultrapura. Congele a pelota a -20 °C para uso posterior.</li>
	<li>Avalie a quantidade de RNA (260 nm) e a qualidade (260/280 e 260/230 taxas de comprimento de onda) utilizando um espectrofotômetro/fluorômetro (ver Tabela de Materiais). Siga cuidadosamente as instruções do fabricante. NOTA: 3-4 μg são geralmente obtidos na fração de elução (E). Isso depende principalmente das condições testadas.</li>
</ol>9. Análise da purificação de afinidade MS2 pela mancha norte36
<ol><li>Diluir 5 μg de RNA de CE, FT, frações W e 500 ng de fração E em 10 μL de água ultrauso e misturar com 10 μL de tampão de carregamento de RNA.</li>
	<li>Incubar 3 min a 90 °C.</li>
	<li>Carregue amostras em poços de um gel de 1% de agarose suplementado com 20 mM de tiocianato de guanidium e execute o gel a 100-150 V no tampão TBE 1x a 4 °C. Leia Koontz (2013)37 para mais detalhes.</li>
	<li>Transfira RNAs em uma membrana de nitrocelulose por transferência de vácuo para 1h ou transferência de capilaridade durante a noite. NOTA: O método de capilaridade é mais eficiente para grandes RNAs.</li>
	<li>UV cross-link RNAs na membrana (120 mJ a 254 nm) usando um crosslinker ultravioleta.</li>
	<li>Insira a membrana em uma garrafa de hibridização com o lado RNA voltado para cima.</li>
	<li>Adicione 10-20 mL de solução de hibridização pré-aquecido. Incubar 30 min a 68 °C.</li>
	<li>Descarte a solução e adicione 10-20 mL de solução de hibridização fresca complementada com 1 μL da sonda específica sRNA. Incubar durante a noite a 68 °C. NOTA: A sonda RNA com etiqueta DIG é sintetizada usando um kit de rotulagem DIG RNA e seguindo as instruções do fabricante. Alternativamente, uma sonda radiolabelled pode ser usada.</li>
	<li>Lave a membrana com 10-20 mL de solução de lavagem 1 (2x SSC e 0,1% SDS) por 5 min a 20 °C. Repita uma vez.</li>
	<li>Lave a membrana com 10-20 mL de solução de lavagem 2 (0,2x SSC e 0,1% SDS) por 15 min a 68 °C. Repita uma vez.</li>
	<li>Incubar com 10-20 mL de solução de bloqueio por pelo menos 30 min a 20 °C.</li>
	<li>Descarte a solução e adicione 10-20 mL da solução de bloqueio suplementada com o anticorpo anti-digoxigenina policalinha (1/1000), conjugado à fosfatase alcalina. Incubar 30 min a 20 °C.</li>
	<li>Lave a membrana com 10-20 mL da solução de lavagem 3 (1x ácido maleico e 0,3% Tween 20) por 15 min a 20 °C. Repita uma vez.</li>
	<li>Incubar a membrana com 10-20 mL da solução de detecção (0,1 M Tris HCl e 0,1 M NaCl pH 9,5) 5 min a 20 °C.</li>
	<li>Coloque a membrana em uma película plástica e mergulhe-a com o substrato (ver Tabela de Materiais). Incubar 5 min no escuro.</li>
	<li>Sele a membrana em um filme plástico. Coloque a membrana em um autordiografia.</li>
	<li>Exponha a membrana a um filme autordiografia na sala escura dedicada. NOTA: O tempo de exposição depende da força do sinal, de poucos segundos a minutos.</li>
	<li>Revele o filme exposto em um dispositivo de desenvolvimento automático.</li>
</ol>10. Preparação das amostras para sequenciamento de RNA 
NOTA: Esta etapa diz respeito apenas às RNAs extraídas das frações E e CE.
<ol><li>Adicione a cada amostra 10 μL de tampão DNase 10x e DNase I (1 U/μg de RNAs tratadas). Adicione água para um volume final de 100 μL.</li>
	<li>Incubar 1 h a 37 °C.</li>
	<li>Extrair e purificar RNAs como descrito anteriormente (etapas 8.2 a 8.11).</li>
	<li>Resuspenque a pelota de RNA em 20 μL de água ultrapura. NOTA: A presença de DNA restante pode ser verificada usando PCR e primers específicos (por exemplo, gene 16S).</li>
	<li>Avalie a quantidade e a qualidade do RNA utilizando um sistema de análise de eletroforese à base de microfluidos (ver Tabela de Materiais). NOTA: 1 μg é geralmente obtido na fração de eluição (E) após o tratamento DNase.</li>
	<li>Remova as RNAs ribossômicas com um kit de esgotamento de rRNA bacteriano. NOTA: As RNAs grandes e abundantes (ou seja, rRNAs) tendem a interagir não especificamente com a coluna de afinidade. 500 ng de RNA extraído são necessários para executar esta etapa.</li>
	<li>Avalie novamente a quantidade e a qualidade do RNA usando um sistema de análise de eletroforese baseado em microfluidos.</li>
	<li>Prepare bibliotecas cDNA com 10-20 ng de RNA ribodepleted usando um kit de preparação da biblioteca cDNA e seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Sequencia as bibliotecas obtidas utilizando um instrumento de sequenciamento (por exemplo, single-end, 150 bp; ver Tabela de Materiais). NOTA: 5-10 milhões de leituras por amostra são geralmente suficientes.</li>
</ol>11. Análise de dados rnaseq (Figura 2)
<ol><li>Baixe os arquivos de sequenciamento FastQ da plataforma de sequenciamento.</li>
	<li>Acesso à instância galaxy da estação biológica Roscoff (https://galaxy.sb-roscoff.fr/) e login. NOTA: Cada algoritmo mencionado pode ser facilmente encontrado usando a barra de pesquisa. Um guia de usuário é fornecido para cada ferramenta. ATENÇÃO: A versão das ferramentas necessárias pode diferir do servidor galaxy38público .</li>
	<li>Clique no ícone Obter dados e, em seguida, faça upload de arquivo do seu computador. Carregue o arquivo de sequenciamento FastQ de cada controle MS2 e amostras de MS2-sRNA. Faça upload também do arquivo de genoma de referência FASTA e arquivo de anotação GFF.</li>
	<li>Execute os relatórios fastqc read quality (Galaxy Versão 0.69). NOTA: Esta ferramenta fornece uma avaliação de qualidade de sequências brutas (por exemplo, pontuação de qualidade, presença de sequências de adaptador).</li>
	<li>Execute a ferramenta de corte flexível Trimmomatic (Galaxy Version 0.36.6) para remover notavelmente sequências de adaptadores e leituras de má qualidade. Indicar sequências de adaptador usadas para preparação da biblioteca (por exemplo, TruSeq 3, single-ended). Adicionar as seguintes operações trimmomáticas: SLIDINGWINDOW (Número de bases=4; Qualidade média=20) e MINLEN (comprimento min de leituras=20).</li>
	<li>Execute novamente os relatórios fastqc read quality (Galaxy Versão 0.69).</li>
	<li>Run Bowtie2 - mapa lê contra genoma de referência (Galaxy Versão 2.3.2.2). Use o arquivo FASTA de referência de genoma do histórico para mapear leituras com configurações padrão (local muito sensível). NOTA: O arquivo BAM gerado pela ferramenta Bowtie2 pode ser visualizado usando o Visualizador de Genômica Integrativa (IGV). O arquivo BAI associado também será necessário.</li>
	<li>Opcionalmente, execute o Flagstat que compila estatísticas para o conjunto de dados BAM (Galaxy Version 2.0).</li>
	<li>Execute a contagem de htseq - Count (Galaxy Versão 0.6.1) que alinha leituras de recursos sobrepostos no arquivo de anotação GFF. Use o modo Intersecção (não vazio).</li>
	<li>Arquive todos os arquivos de contagem bruta da análise de contagem de htseq em um único arquivo Zip.</li>
	<li>Execute o SARTools DESeq2 para comparar dados (Galaxy Versão 1.6.3.0). Forneça o arquivo Zip contendo arquivos de contagem bruta e o arquivo de design, um arquivo delimitado de guia descrevendo o experimento. Siga cuidadosamente as instruções fornecidas para gerar o arquivo de design.</li>
</ol>

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<li>Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+silencing+mechanisms+of+the+same+target+mRNA+by+two+regulatory+RNAs+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).</li>
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<li>Lalaouna, D., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+sRNA+interacting+with+a+transcript+of+interest+using+MS2-affinity+purification+coupled+with+RNA+sequencing+%28MAPS%29+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Data%22%5BJournal%5D)">Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology.</a> Genomics Data. 5, 136-138 (2015).</li>
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<li>Koontz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).</li>
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<li>Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IntaRNA+2.0%3A+enhanced+and+customizable+prediction+of+RNA-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).</li>
<li>Georg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+cooperation%3A+Experimental+and+computational+approaches+in+the+functional+characterization+of+bacterial+sRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs.</a> Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Um protocolo modificado para bactérias Gram-positivas O protocolo inicial do MAPS foi desenvolvido para estudar o sRNA interactome no organismo modelo E. coli20,30. Aqui, descrevemos um protocolo modificado que é adequado para a caracterização de redes regulatórias dependentes de sRNA no patógeno humano oportunista S. aureus e é certamente transposável para outras bactérias Gram-positivas, patogênicas ou não.
<p class="jo...

Centenas, talvez até milhares de pequenas RNAs regulatórias (sRNAs) foram identificadas na maioria dos genomas bacterianos, mas as funções da grande maioria deles permanecem descaracterizadas. No geral, as sRNAs são moléculas curtas sem codificação, desempenhando papéis importantes na fisiologia bacteriana e adaptação a ambientes flutuantes1,2,3. De fato, essas macromoléculas estão no centro de inúmeras redes regulatórias intrincadas, impactando vias metabólicas, respostas ao estresse, mas também virulência e resistência a antibióticos. Logicamente, sua síntese é desencadeada por estímulos ambientais específicos (por exemplo, fome de nutrientes, estresse oxidativo ou membrana). A maioria dos sRNAs regulam mRNAs de alvo múltiplos no nível pós-transcrição através de emparelhamento de base curto e não contíguo. Eles geralmente impedem a iniciação da tradução competindo com ribossomos para as regiões de iniciação de tradução4. A formação de duplexes sRNA:mRNA também frequentemente resulta na degradação ativa do mRNA alvo por meio do recrutamento de RNases específicos.
A caracterização de um targetome sRNA (ou seja, todo o conjunto de suas RNAs alvo) permite a identificação das vias metabólicas nas quais ele intervém e o sinal potencial a que responde. Consequentemente, as funções de um sRNA específico geralmente podem ser inferidas a partir de seu targetome. Para isso, várias ferramentas de previsão de silico foram desenvolvidas, como IntaRNA e CopraRNA5,6,7. Eles notavelmente contam com complementaridade de sequência, emparelhamento de energia e acessibilidade do potencial local de interação para determinar parceiros de sRNA putativos. No entanto, os algoritmos de previsão não integram todos os fatores que influenciam o emparelhamento de base in vivo, como o envolvimento de acompanhantesrna 8 favorecendo interações sub-ideais ou a co-expressão de ambos os parceiros. Devido às suas limitações inerentes, a taxa falsa positiva de ferramentas de predição permanece alta. A maioria das abordagens experimentais em larga escala baseia-se na co-purificação de casais sRNA:mRNA interagindo com uma proteína de ligação de RNA (RBP)6,9. Por exemplo, o método RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) identificou duplexes RNA co-purificados com acompanhantes de RNA como Hfq e ProQ em Escherichia coli10,11. Uma tecnologia semelhante chamada UV-Crosslinking, Ligation and Sequencing of Hybrids (CLASH) foi aplicada aos SRNAs associados ao RNase E e Hfq em E. coli12,13. Apesar dos papéis bem descritos do Hfq e do ProQ na regulação mediada pelo SRNA em múltiplas bactérias8,14,15, a regulamentação baseada em sRNA parece ser independente de RNA em vários organismos como S. aureus16,17,18. Mesmo que a purificação dos duplexes de RNA em associação com rnases seja viável, como demonstrado por Waters e colegas de trabalho13,isso permanece complicado à medida que as RNases desencadeiam sua rápida degradação. Assim, a Purificação MS2-Affinity juntamente com a abordagem RNA Sequencing (MAPS)19,20 constitui uma alternativa sólida nesses organismos.
Ao contrário dos métodos acima mencionados, o MAPS usa um sRNA específico como isca para capturar todos os RNAs interagindos e, portanto, não depende do envolvimento de um RBP. Todo o processo é retratado na Figura 1. Resumindo, o sRNA é marcado no 5' com o aptamer MS2 RNA que é especificamente reconhecido pela proteína do casaco MS2. Esta proteína é fundida com a proteína de ligação maltosa (MBP) a ser imobilizada em uma resina de amilose. Portanto, o MS2-sRNA e seus parceiros RNA são mantidos na coluna de cromatografia de afinidade. Após a elução com maltose, os RNAs co-purificados são identificados utilizando-sequenciamento de RNA de alto rendimento seguido de análise bioinformática(Figura 2). A tecnologia MAPS acaba por desenhar um mapa interativo de todas as interações potenciais que ocorrem in vivo.
A tecnologia MAPS foi originalmente implementada na bactéria gram-negativa não patogênica E. coli21. Notavelmente, o MAPS ajudou a identificar um fragmento derivado de tRNA interagindo especificamente com os sRNAs ryhB e RybB e impedindo qualquer ruído transcricional sRNA para regular os alvos de mRNA em condições não indutoras. A partir daí, o MAPS foi aplicado com sucesso a outros E. coli sRNAs como DsrA22, RprA23, CyaR23 e GcvB24 (Tabela 1). Além de confirmar alvos previamente conhecidos, o MAPS estendeu o targetome desses sRNAs conhecidos. Recentemente, o MAPS foi realizado em Salmonella Typhimurium e revelou que o SRNA da SraL se liga ao rho mRNA, codificando para um fator de rescisão de transcrição25. Através deste emparelhamento, a SraL protege rho mRNA da rescisão de transcrição prematura desencadeada pela própria Rho. Curiosamente, essa tecnologia não se restringe aos sRNAs e pode ser aplicada a qualquer tipo de RNAs celular como exemplificado pelo uso de um fragmento derivado de tRNA26 e uma região não traduzida de 5'-untranslated de mRNA22 (Tabela 1).
O método MAPS também foi adaptado à bactéria gram-positiva patogênica S. aureus19. Especificamente, o protocolo de lise foi amplamente modificado para quebrar células eficientemente devido a uma parede celular mais espessa do que as bactérias Gram-negativas e para manter a integridade do RNA. Este protocolo adaptado já desvendou o interactome do RsaA27, RsaI28 e RsaC29. Essa abordagem deu insights sobre o papel crucial dessas sRNAs nos mecanismos regulatórios das propriedades da superfície celular, captação de glicose e respostas ao estresse oxidativo.
O protocolo desenvolvido e implementado em E. coli em 2015 foi recentemente descrito em grande detalhe30. Aqui, fornecemos o protocolo MAPS modificado, que é particularmente adequado para estudar redes reguladoras de sRNA em bactérias Gram-positivas (parede celular mais grossa), sejam elas não patogênicas ou patogênicas (precauções de segurança).

<table><tbody><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 mL Falcon</td><td></td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 2 mL</td><td>Starstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>2100 Instrumento Bioanalisador</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>quantidade e qualidade de RNA</td></tr><tr><td>Frasco de cultura de 250 mL</td><td>Dominique Dutscher</td><td>2515074</td><td>Bacteriano culturas</td></tr><tr><td>Tubos de centrifugação de 50 mL Falcon</td><td></td><td>352051</td><td>Centrifugação de cultura</td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.321</td><td>Extração e purificação de RNA</td></tr><tr><td>Allegra X-12R Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Pelotização bacteriana</td></tr><tr><td>Ampicilina (amp)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td>Meio de crescimento</td></tr><tr><td>Resina de amilose</td><td>Novo Inglaterra BioLabs</td><td>E8021S</td><td>MS2-purificação de afinidade</td></tr><tr><td>Anti-dioxigenina AP Fragmento Fab</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td>Northern blot</td></tr> ensaios <tr><td>de autorradiografia</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-212-726</td><td>Northern blot ensaios</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ER0051</td><td>Construção de plasmídeo</td></tr><tr><td>BHI (Infusão de Cérebro e Coração) Caldo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53286</td><td>Meio de crescimento</td></tr><tr><td>Reagente de bloqueio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td>Ensaios de Northern blot</td></tr><tr><td>CDP-Star</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11759051001</td><td>Northern blot ensaios (substrato)</td></tr> <tr><td>Centrífuga 5415 R</td> Extração <td>e purificação de RNA</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Dominique Dutscher</td><td>508320-CER</td><td>Extração de RNA e purificação</td></tr><tr><td>Mistura de marcação DIG-RNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11277073910</td><td>Ensaios de Northern blot</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>Tratamento DNase</td></tr><tr><td>Eritromicina (ery)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Fluka 45673</td><td>Meio de crescimento</td></tr><tr><td>Dispositivo FastPrep</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td>Lise mecânica</td></tr><tr><td>Tiocianato</td> <td>de guanídioEnsaios de Northern blot Sigma-Aldrich</td><td>G9277-250G</td><td></td></tr><tr><td>Hibridização Hoven Hybrigene</td><td>Techne</td><td>FHB4DD</td><td>Northern blot</td></tr><tr><td>Tubos de hibridização</td><td>Techne</td><td>FHB16</td><td>Northern blot</td></tr><tr><td>ensaios Álcool isoamílico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/6960/08</td><td>Extração e purificação de RNA</td></tr><tr><td>LB (Caldo de Lisogenia)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>Meio de crescimento</td></tr><tr><td>Matriz de lise B Bulk</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540-428</td><td>Lise mecânica</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>BioRad</td><td>1652100</td><td>Construção de plasmídeo</td></tr><tr><td>Dispositivo de água Milli-Q</td> Água <td>ultrapura</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoDrop</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Quantidade e qualidade</td></tr> <tr><td>de RNA/DNAMembrana de nitrocelulose</td><td>Dominique Dutsher</td><td>10600002</td><td>ensaios de Northern blot</td></tr><tr><td>Phembact Neutre</td><td>PHEM Technologies</td><td>BAC03-5-11205</td><td>Limpeza e descontaminação</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Carl Roth</td><td>38.2</td><td>Extração e purificação de RNA</td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerase de alta fidelidade</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>Construção de plasmídeo</td></tr><tr><td>pMBP-MS2</td><td>Addgene</td><td>65104</td><td>MS2-MBP produção</td></tr><tr><td>Poly-Prep coluna de cromatografia</td><td>BioRad</td><td>7311550</td><td>MS2-purificação de afinidade</td></tr><tr><td>PstI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ER0615</td><td>Construção de plasmídeo</td></tr><tr><td>Qubit 3 Fluorômetro</td><td>Invitrogen</td><td>15387293</td><td>quantidade de</td></tr><tr><td>RNA Solução</td><td>MP Biomedicals</td><td>6055050</td><td>Lise mecânica</td></tr><tr><td>Kit Completo ScriptSeq</td><td>Illumina</td><td>BB1224</td><td>Preparação de bibliotecas de cDNA</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro Genesys 20</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11972278</td><td>Culturas bacterianas</td></tr><tr><td>Dispositivo de vácuo SpeedVac Savant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>DNA120</td><td>Extração e purificação de RNA</td></tr><tr><td>Stratalinker UV Crosslinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400672</td><td>Northern blot ensaios</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0014</td><td>Construção de plasmídeo</td></tr><tr><td>TBE (Tris-Borato-EDTA)</td> <td>Euromedex</td><td>ET020-C</td><td>Ensaios de Northern blot</td></tr><tr><td>ThermalCycler T100</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td>Construção de plasmídeo</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416-100ML</td><td>Northern blot</td></tr><tr><td>ensaios Processador de filme de raios-X</td><td>hu.q</td><td>HQ-350XT</td><td>Ensaios de Northern blot</td></tr><tr><td>Filmes de raios-X Super RX-N</td><td>FujiFilm</td><td>4741019318</td><td>Northern blot</td></tr></tbody></table>

purificação de afinidade ms2 juntamente com sequenciamento de rna em bactérias gram-positivas

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

Embora os PEQUENOs RNAs regulatórios (sRNAs) sejam difundidos entre o domínio bacteriano da vida, as funções de muitos deles permanecem pouco caracterizadas notavelmente devido à dificuldade de identificar seus alvos de mRNA. Aqui, descrevemos um protocolo modificado da Purificação MS2-Affinity, juntamente com a tecnologia RNA Sequencing (MAPS), com o objetivo de revelar todos os parceiros de RNA de um sRNA in vivo específico. Em linhas gerais, o aptamer MS2 é fundido à extremidade de 5' do sRNA de interesse. Essa construção é então expressa in vivo, permitindo que o MS2-sRNA interaja com seus parceiros celulares. Após a colheita bacteriana, as células são mecanicamente cultivadas. O extrato bruto é carregado em uma coluna de cromatografia à base de amilolose previamente revestida com a proteína MS2 fundida à proteína de ligação maltosa. Isso permite a captura específica de MS2-sRNA e RNAs interagindo. Após a elução, os RNAs co-purificados são identificados por sequenciamento de RNA de alto rendimento e análise bioinformática subsequente. O protocolo a seguir foi implementado no Patógeno Humano Gram-positivo Staphylococcus aureus e é, em princípio, transposável para qualquer bactéria Gram-positiva. Resumindo, a tecnologia MAPS constitui um método eficiente para explorar profundamente a rede regulatória de um sRNA específico, oferecendo um instantâneo de todo o seu targetome. No entanto, é importante ter em mente que as metas putativas identificadas pelo MAPS ainda precisam ser validadas por abordagens experimentais complementares.

Os resultados representativos são originários do estudo do RsaC targetome em S. aureus29. RsaC é um sRNA não convencional de 1.116 nt-long. Seu final de 5' contém várias regiões repetidas, enquanto seu final de 3' (544 nt) é estruturalmente independente e contém todos os locais de interação previstos com seus alvos mRNA. A expressão deste sRNA é induzida quando o manganês (Mn) é escasso, o que é frequentemente encontrado no contexto da resposta imune hospedeira. Utilizando a tecnologia MA...

A tecnologia MAPS foi desenvolvida para examinar o targetome de um RNA regulatório específico in vivo. O sRNA de interesse é marcado com um aptamer MS2 permitindo a co-purificação de seus parceiros RNA e sua identificação por sequenciamento de RNA. Este protocolo modificado é particularmente adequado para bactérias Gram-positivas.

Purificação de Afinidade MS2 juntamente com sequenciamento de RNA em bactérias gram-positivas

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

A purificação de afinidade MS2 aliada ao sequenciamento de RNA ou maps foi desenvolvida para identificar todo o targetome de qualquer RNA de interesse em bactérias. Essa tecnologia permite identificar qualquer tipo de parceiro sRNA independentemente do mecanismo de regulação. A caracterização das redes regulatórias dependentes do SRNA ajudará a entender melhor a produção de fatores de virulência, a formação de biofilme e a sobrevivência das bactérias dentro das células hospedeiras e, finalmente, combater as infecções estafilocócicas.Este protocolo pode ser aplicado a qualquer bactéria patogênica ou não-patogênica gram-positiva. Demonstrando o procedimento estará Noemie Mercier, uma estudante de doutorado do laboratório do Dr. Pascal Romby. Para começar, crie uma colônia de cepas carregando pCN51 P3 MS2 sRNA ou pCN51 P3 MS2 plasmids em três mililitros de bhi médio suplementado com 10 microgramas por microliter eritromicina em duplicatas.Diluir cada cultura durante a noite em 50 mililitros de bhi fresco suplementado com eritromicina para atingir um OD 600 de 0,05. Cresça as culturas a 37 graus Celsius com agitação a 180 RPM por seis horas. Transfira cada cultura em um tubo de centrífuga de 50 mililitros e centrífugue os tubos a 2.900 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius, depois descarte o supernasce, congele e armazene-os a menos 80 graus Celsius ou mantenha as pelotas no gelo e realize diretamente a lise celular mecânica.Para realizar a lise celular mecânica, resuspenda pelotas em cinco mililitros de tampão A e transferir as células resuspended para tubos de centrífugas de 15 mililitros com 3,5 gramas de contas de sílica. Insira os tubos em um instrumento de lise celular mecânica e execute um ciclo de 40 segundos a quatro metros por segundo. Centrifugar os tubos a 2.900 vezes G por 15 minutos, depois recupere o supernasal e mantenha-o no gelo.Certifique-se de que o supernatante está claro, repetindo a centrifugação se não estiver. Retire a ponta da coluna, depois coloque uma coluna de cromatografia em um rack de coluna e lave a coluna com água ultrapura. Adicione 300 microliters de resina de amilolose e lave a coluna com 10 mililitros de tampão A.Diluir 1,200 picamoles de proteína MBP-MS2 em seis mililitros de tampão A e carregue-a na coluna.Lave a coluna com 10 mililitros de tampão A.Next, realize a purificação de afinidade MS2. Carregue a célula lysate na coluna e colete a fração de fluxo em um tubo de coleta limpo. Lave a coluna três vezes com 10 mililitros de tampão A e colete a fração de lavagem, em seguida, elute a coluna com um mililitro de buffer E e colete a fração de elução em um microtubo de dois mililitros.Mantenha todas as frações coletadas no gelo até a extração do RNA. Use um mililitro de cada fração para extração de RNA. Adicione um volume de fenol ao RNA e misture vigorosamente, depois centrifugar a mistura a 16.000 vezes G por 10 minutos a 20 graus Celsius.Transfira a fase superior para um microtubo de dois mililitros limpos. Adicione um volume de álcool isoamílico de clorofórmio e repita a centrifugação e transfira a fase superior para um novo tubo. Adicione 2,5 volumes de etanol 100% frio e 0,1 volume de três acetato de sódio molar no pH 5.2 e precipitar durante a noite a menos 20 graus Celsius.No dia seguinte, centrifugar os tubos por 15 minutos a 16.000 vezes G e quatro graus Celsius. Retire lentamente o etanol com uma pipeta, tomando cuidado para não perturbar a pelota. Adicione 500 microliters de 80% de etanol frio e centrífuga por cinco minutos.Descarte o etanol tubondo-o lentamente e, em seguida, seque a pelota usando um concentrador de vácuo por cinco minutos no modo de execução. Resuspenque a pelota em um volume apropriado de água ultrapura. Este protocolo foi usado para estudar o targetome RsaC em S.aureus.Vários mRNAs interagindo diretamente com o RsaC foram identificados usando a tecnologia MAPS, revelando seu papel crucial no estresse oxidativo e respostas relacionadas ao metal. Para confirmar as construções de sRNA MS2 e visualizar seu padrão de expressão, as células foram colhidas após duas, quatro e seis horas de crescimento no meio BHI. O RNA foi extraído e a análise da mancha do Norte foi realizada utilizando-se a sonda DIG específica do RsaC.O nível de RsaC endógeno aumentou significativamente após seis horas de crescimento. É importante ressaltar que o nível de MS2-RsaC 544 e MS2-RsaC 1, 116 eram comparáveis ao RsaC endógeno em seis horas. A purificação de afinidade foi realizada e as RNAs foram extraídas das frações de extrato bruto, fluxo e eluição na cepa do tipo selvagem expressando apenas a tag MS2 e a cepa mutante RsaC expressando a construção MS2-RsaC 544.O RsaC nucleotídeo de 1.116 nucleotídeos de longa duração foi enriquecido na fração de elução, mas interagiu não especificamente com a coluna de afinidade devido ao seu comprimento e estrutura secundária complexa. O MS2-RsaC 544 foi altamente enriquecido na fração de elução demonstrando que foi retido com sucesso pela proteína de fusão MS2-MBP. Uma análise bioinformática revelou alvos putativos de mRNA de acordo com a mudança de dobra entre o controle ms2 sRNA e MS2, indicando que o sodA foi o primeiro alvo putativo.Uma análise de manchas do Norte realizada sonda DIG específica do SODA após a purificação de afinidade MS2 mostra que o sodA foi eficientemente co-enriquecido com MS2-RsaC 544 em comparação com o controle MS2. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que a adição da tag MS2 pode afetar a confirmação, estabilidade ou função do SRNA. Isso deve ser cuidadosamente monitorado.O MAPS fornece um instantâneo de emparelhamento de alvos sRNA-RNA. Outra validação experimental irá desvendar sua função. Esta técnica representa uma poderosa ferramenta para construir redes regulatórias sRNA em qualquer bactéria.

ms2-affinity-purification-coupled-with-rna-sequencing-gram-positive

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Ensaio pull-down de proteína de RNA para isolar proteínas de ligação a RNA por meio de extração de afinidade

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Purificação de Afinidade MS2 juntamente com sequenciamento de RNA em bactérias gram-positivas

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