Microscopia 4D: Desvendando caenorhabditis elegans Desenvolvimento Embrionário usando Microscopia Nomarski

A microscopia 4D é uma ferramenta valiosa para reconstruir a linhagem celular completa do embrião de C. elegans ou qualquer outro espécime no nível de uma única célula. A óptica Nomarski pode ser usada para destacar as mudanças na forma da célula durante o desenvolvimento com um microscópio padrão e luz transmitida sem a necessidade de animais transgênicos ou microscopia de fluorescência. O microscópio 4D permite estudar a ciclagem celular, proliferação, diferenciação e apoptose em C.elegans e em outros sistemas, como mamíferos ou cultura de células teciduais.

O rastreamento da linhagem celular em imagens DIC é realizado manualmente. É demorado e requer alguma prática para realizar uma análise completa do embrião. Demonstrando o procedimento estará Begona Ezcurra, técnica em nosso laboratório.

Antes de preparar os embriões, ajuste a temperatura de registro do microscópio 4D para 15, 20 ou 25 graus Celsius e configure o microscópio para registrar 1.500, 30 pilhas z de plano focal separadas por um mícron com intervalos de 30 segundos entre o início de cada pilha. Em seguida, alíquota de 500 a 1000 microlitros de ágar líquido 4,5% em tubos de vidro de três milímetros e sele cuidadosamente os tubos com filme de cera para evitar a dessecação. Para preparar uma almofada de ágar homogênea fina para a gravação, aqueça cuidadosamente e alíquota de ágar sobre um queimador de álcool até que o ágar derreta e coloque o tubo em um bloco de calor de 80 graus Celsius.

Coloque uma lâmina de microscópio de vidro em um pedaço de plástico e use uma pipeta de pasto em uma mão para colocar uma pequena gota de ágar derretido no centro da lâmina e, em seguida, use imediatamente a outra mão para colocar uma segunda lâmina na gota de ágar para criar uma almofada de ágar muito fina. Para montar os embriões, primeiro use um selecionador para transferir de 5 a 10 hermafroditas grávidas para um vidro de relojoeiro cheio de água sob um microscópio estéreo. Use um bisturi para abrir os nematóides hermafroditas e extraia de um a quatro óvulos precoces do útero.

Deslize suavemente a corrediça superior da almofada de ágar e use um tubo capilar para colocar um ovo precoce no centro da almofada. Use um cílio colado na ponta de um palito para ajustar a posição do ovo conforme necessário e use a pipeta capilar para remover o excesso de água. Use um bisturi para cobrir lenta e obliquamente a lamínula sobre a preparação antes de usar uma micropipeta para preencher 3/4 do espaço ao redor da almofada de ágar com água.

Em seguida, sele a lamínula com vaselina para evitar a dessecação durante longos períodos de gravação. Após a selagem, coloque a lâmina no microscópio 4D e use uma objetiva de baixa ampliação para colocar o embrião em foco. Selecione a objetiva de imersão 100X e foque o condensador.

Abra completamente a abertura do condensador e feche o diafragma de campo para fornecer uma abertura numérica mais alta e maior resolução. Gire o prisma de Wollaston para obter uma imagem tridimensional do embrião iluminado de um lado, depois gire o prisma na outra direção para obter o efeito de ter o embrião iluminado do outro lado e comece a gravação 4D. Para a reconstrução da linhagem celular de um embrião gravado em filme 4D, abra o software de rastreamento de linhagem e selecione Arquivo e Novo projeto.

Selecione o modelo de linhagem celular apropriado dependendo da temperatura de gravação e defina a contagem de varredura para 1500. O tempo entre as varreduras é de 30 segundos, a contagem de níveis é de 30 e a distância entre os níveis é de um mícron. Selecione o arquivo de imagem, o formato e o diretório onde as imagens foram salvas.

Selecione se as imagens foram salvas como imagens únicas ou como pilhas z de várias imagens e defina a nomenclatura do arquivo e os formatos de imagem. Em seguida, clique em Processamento de canal ativado para detectar e definir os canais de luz apropriados do filme 4D. Para rastreamento de linhagem celular, inicie o software de rastreamento de linhagem celular.

Uma janela de vídeo e uma janela de linhagem de células aparecerão. Na janela de linhagem, selecione a ramificação de linhagem e clique no núcleo da célula correspondente a esta célula na janela de vídeo. Reproduza o filme 4D para frente, para trás ou para cima ou para baixo um nível para seguir a célula de interesse espacialmente ao longo do tempo.

Clique periodicamente no núcleo da célula para gerar um ponto no ramo da linhagem e registrar as coordenadas espaciais da célula em um momento específico. Como resultado, são possíveis progressões de linhagem celular e reconstruções 3D do embrião. Em seguida, pressione a tecla Return para marcar a mitose e selecione uma das células-filhas para acompanhar a progressão celular, conforme demonstrado.

Repita a análise para o resto das células embrionárias para traçar a linhagem celular completa ou para seguir células específicas de interesse, como aquelas que sofrem apoptose. Permitir a comparação de linhagens mutantes de interesse com a linhagem celular estereotipada de C. elegans do tipo selvagem. As placas sem-fim são incubadas dentro de caixas de papelão para evitar condensação.

Assim que a gravação for concluída, a linhagem celular pode ser reconstruída usando o software de rastreamento de linhagem, conforme demonstrado. Por exemplo, nesta análise representativa, a linhagem de células embrionárias mutante gsr-1 rastreada foi comparada com a linhagem de tipo selvagem C. elegans. E a detecção de um atraso progressivo no ciclo celular durante o desenvolvimento embrionário foi revelada.

Como consequência, os embriões mutantes foram presos em estágios intermediários, enquanto os embriões do tipo selvagem progrediram e finalmente eclodiram como larvas. Além disso, outras características importantes do desenvolvimento embrionário, como a apoptose, podem ser visualizadas dinamicamente usando microscopia 4D. O rastreamento de linhagem das imagens DIC deve ser processado manualmente.

Um processamento de software de células não marcadas na luz visível nos estágios iniciais de desenvolvimento não é preciso para análise de embriões. A aplicação do sistema de reconhecimento de imagem ao campo da microscopia de luz visível trará um grande avanço no campo da biologia do desenvolvimento.