Name: Microscopia 4D: Desvendando caenorhabditis elegans Desenvolvimento Embrionário usando Microscopia Nomarski (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprenda microscopia 4D para reconstruir linhagens celulares em embriões de Caenorhabditis elegans usando óptica Nomarski. Este método permite analisar ciclo celular, proliferação e apoptose sem necessidade de transgênicos.

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Os autores desejam reconhecer o apoio da Fundação Rioja Salud (Fondos FEDER) e do Ministro espanhol de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00). Cristina Romero Aranda é financiada por uma bolsa da AECC (Asociación Española Contra el Cáncer).

1. Cresça C. elegans em pratos de Petri
<ol><li>Prepare as placas de NGM e as semee com E. coli OP50 como fonte de alimento (Figura 1). Cresça e mantenha C. elegans como descrito17. Armazene as placas semeadas a 4 °C por até um mês.</li>
	<li>Ajuste as placas à temperatura desejada antes de adicionar os vermes.<ol>
<li>Para transferir os vermes, remova um pedaço de ágar de uma placa velha e coloque-o em um prato fresco.</li>
		<li>Alternativamente, capture animais solteiros com um catador de vermes estéril (um pedaço de 1 polegada de fio de platina de calibre 32 com uma ponta achatada, montado na ponta de uma pipeta Pasteur) e coloque-os na nova placa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cresça os vermes na temperatura desejada.<ol>
<li>Cresça C. elegans vermes a 20 °C, a temperatura padrão. No entanto, para analisar o desenvolvimento de mutantes termosensíveis, realize uma incubação durante a noite, geralmente a 25 °C. Ajuste a duração e a temperatura desta incubação conforme necessário, dependendo do mutante específico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Prepare a gravação da microscopia 4D antes de montar os embriões (Figura 2)
<ol><li>Configure o microscópio e os controles de temperatura antes de preparar o embrião. C. elegans embriões se dividem muito rapidamente. Prepare-se para começar a gravar imediatamente após a montagem dos embriões.</li>
	<li>Ajuste a temperatura de gravação para 15 °C, 20 °C ou 25 °C.<ol>
<li>Regissão rotineiramente os embriões a 25 °C. Registre mutantes termo-sensíveis na temperatura restritiva para mostrar seus fenótipos. Registo um controle WT (se feito em uma preparação diferente) na mesma temperatura que os mutantes. NOTA: Os embriões WT desenvolvem-se mais rápido a 25 °C e mais lento a 15 °C sem diferenças adicionais na linhagem celular. Coloque microscópios em uma sala controlada pela temperatura. Controle adicional por resfriamento ou aquecimento do slide é altamente desejável. Isso pode ser alcançado através da água circulante a uma temperatura específica através de um anel de metal em torno do objetivo do microscópio e do condensador. O objetivo e a preparação estão em contato direto através do óleo de imersão e a transferência de temperatura é eficiente. Este sistema permite um controle preciso da temperatura de gravação e para a realização de mudanças de temperatura durante o desenvolvimento de embriões.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Defina os parâmetros de registro no software de microscopia.<ol>
<li>Para uma gravação padrão de C. elegans (sem varreduras fluorescentes), selecione: z-stacks de 30 planos focais, a uma distância de 1 mícdo cada. Intervalos de 30 segundos entre o início de cada pilha z. 1500 z-stacks (12,5 horas de registro). NOTA: Tanto os programas de controle de microscópio de código aberto quanto comercial podem ser usados para definir este fluxo de trabalho para capturar imagens. Agora o microscópio está pronto para gravar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Prepare e monte os embriões
<ol><li>Prepare uma almofada de ágar fina e homogênea como o primeiro passo para obter uma imagem agradável (Figura 3).<ol>
<li>Prepare 50 ml de uma solução de 4,5% de ágar em água deionizada. Aqueça para ferver no micro-ondas e despeje 0,5 – 1 ml em tubos de vidro de 3 ml.</li>
		<li>Sele cuidadosamente os tubos com filme de cera para evitar a proficação. Os tubos de ágar selados podem ser armazenados à temperatura ambiente por até dois meses.</li>
		<li>No banco do laboratório, tenha um bloco de calor a 80 °C com: um tubo de ensaio de geleia de petróleo puro (derretido), com um pincel fino dentro. um tubo de ensaio com água destilada contendo uma pipeta Pasteur. NOTA: Isso garante que todos os materiais necessários estarão quentes, e o ágar não se solidificará no processo de fabricação do bloco.</li>
		<li>Remova o filme de cera do topo de um dos tubos de ágar, e aqueça-o cuidadosamente sobre um queimador de álcool para derreter o ágar. Tenha cuidado, pois o ágar quente expelido do tubo de vidro pode causar queimaduras.</li>
		<li>Uma vez que o ágar esteja derretido, coloque o tubo no bloco de calor para manter o ágar em forma líquida.</li>
		<li>Alternativamente, coloque os tubos de ágar no bloco de calor 1h antes do experimento para derretê-los sem usar um queimador. O ágar derretido deve ser descartado depois de um dia.</li>
		<li>Coloque um slide de microscópio (Slide A) entre outros dois em um pedaço de plástico.</li>
		<li>Pegue outro slide (Slide B) e segure-o com os dedos em uma mão.</li>
		<li>Por outro lado, coloque uma pequena gota de ágar derretido no centro do Slide A usando a pipeta pasteur quente.</li>
		<li>Pressione imediatamente o slide B na gota de ágar para criar uma almofada muito fina entre slides A e B. Mantenha estes slides espremidos até o passo 3.2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monte os embriões.<ol>
<li>Colete 5-10 hermafroditas gravid com o catador e coloque-os em um copo de relojoeiro cheio de água.</li>
		<li>Use um bisturi para cortar os nematoides hermafroditas e extrair ovos precoces (1-4 células) do útero, sob o estereoscópio.</li>
		<li>Pegue o slide da etapa 3.1.10 e deslize suavemente o Slide B para expor a almofada de ágar no Slide A.</li>
		<li>Coloque um ovo no centro da almofada de ágar por pipetar com um tubo capilar.</li>
		<li>Alternativamente, pipeta uma gota contendo um conjunto de embriões na almofada de ágar e, em seguida, procurar embriões em estágio inicial. Faça este passo sob o estereótipo.</li>
		<li>Se necessário, mova o ovo cutucando-o com um cílio colado no final de um palito.</li>
		<li>Remova o excesso de água com a pipeta capilar. NOTA: Uma pipeta capilar pode ser facilmente preparada aquecendo uma pipeta Pasteur sobre um queimador de álcool e puxando-a de ambas as extremidades.</li>
		<li>Cubra cuidadosamente a preparação com um deslizamento de cobertura. Para evitar bolhas de ar, coloque uma borda da mancha de cobertura no slide e deslize suavemente um bisturi ao longo da borda adjacente para lentamente e obliquamente cobrir o deslizamento de tampas na preparação.</li>
		<li>Use uma pipeta para encher 3/4 do espaço ao redor da almofada de ágar com água. Deixe 1/4 do espaço com ar.</li>
		<li>Sele o deslizamento com geleia de petróleo para evitar a dessecação durante longos períodos de gravação.</li>
		<li>Use a escova fina para estender uma fina camada de geleia de petróleo derretida ao redor da borda da tampa. NOTA: Agora a preparação está pronta para gravação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Ajuste o DIC e inicie a gravação de microscopia 4D
<ol><li>Coloque o slide no estágio do microscópio. Concentre o embrião utilizando o objetivo de baixa ampliação (5x ou 10x).</li>
	<li>Mude para o objetivo de imersão de 100x.</li>
	<li>Ajuste os componentes ópticos do microscópio para obter uma imagem Nomarski.<ol>
<li>Concentre o condensador.</li>
		<li>Abra completamente a abertura do condensador e feche o diafragma de campo (isso proporcionará uma maior abertura numérica e, portanto, maior resolução).</li>
		<li>Verifique se ambos os polarizadores no microscópio são orientados para causar a máxima extinção da luz.</li>
		<li>Gire o prisma wollaston para obter uma bela imagem tridimensional do embrião, iluminado de um lado. Gire o prisma na outra direção para obter o efeito de ter o embrião iluminado do outro lado. NOTA: Estas etapas podem ser realizadas em uma amostra de ensaio antes da gravação, de modo que apenas um ajuste fino seja necessário na amostra que está sendo analisada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inicie a captura de imagem no microscópio.</li>
</ol>5. Analise o filme 4D (Figura 4).
NOTA: Uma vez que a gravação esteja concluída, use o software de rastreamento de linhagem celular para reconstruir e analisar a linhagem celular.
O software de rastreamento de linhagem celular é uma ferramenta poderosa para realizar análises detalhadas do desenvolvimento embrionário ou dinâmica em culturas celulares ou fragmentos de tecido. O programa extrai e quantifica vários conjuntos de dados sobre a dinâmica celular da amostra que incluem a geração da linhagem celular completa de cada célula registrada, incluindo divisões celulares, comprimento do ciclo celular, migração ou apoptose, bem como sua cinética. Além disso, a diferenciação celular pode ser pontuada pelas alterações morfológicas da célula ou pela expressão de marcadores específicos. Basicamente, a tela de software exibe duas janelas: na janela esquerda, o filme 4D pode ser reproduzido para frente e para trás ou para cima e para baixo para os níveis superior ou inferior para que cada célula possa ser seguida no tempo e no espaço durante toda a gravação. Na viúva direita, a linhagem celular é gerada. Clicar em um núcleo celular no filme 4D gera um ponto na janela de linhagem que armazena as informações do nome celular, destino e coordenadas espaciais. A linhagem celular de uma célula específica é gerada reproduzindo o filme 4D para a frente e clicando periodicamente no núcleo para marcar a mitose dessa célula específica ao longo do tempo. A repetição desse processo para cada uma das células registradas gera a linhagem celular completa do embrião ou amostra. As informações armazenadas para coordenadas espaciais de cada célula são posteriormente usadas para reconstruir modelos de embriões 3D e caminhos de migração celular.
<ol><li>Abra o software de rastreamento de linhagem e crie um novo projeto indo para o menu da barra superior e selecionando: | de arquivos Novo projeto.</li>
	<li>Selecione o modelo de linhagem celular dependendo da temperatura de gravação: DB08 para gravação a 25 °C, DB10 para gravação a 20 °C e DB12 para gravação a 15 °C.</li>
	<li>Defina os parâmetros de gravação na janela emergente: contagem de varredura (geralmente 1500), tempo entre as varreduras (30 segundos), contagem de nível (30) e distância entre os níveis (1 míccro).</li>
	<li>Selecione o arquivo de imagem e o formato.<ol>
<li>Selecione o diretório de imagens onde as imagens foram salvas.</li>
		<li>Escolha se as imagens devem ser salvas como imagens únicas (uma imagem por nível e tempo) ou como pilhas z de várias imagens.</li>
		<li>Determine a nomeação do arquivo e o formato de imagem. Rotineiramente, imagens únicas são salvas sob os seguintes nomes: X0000L00C1 (para varredura 0, nível 0, canal 1) X0000L01C1 (para varredura 0, nível 1, canal 1) X0000L02C1 (para digitalização 0, nível 2, canal 1) ... X0001L00C1 (para varredura 1, nível 0, canal 1) X0001L01C1 (para varredura 1, nível 1, canal 1) ... X0300L04C1 (para digitalização 300, nível 4, canal 1) ... NOTA: Salvar as imagens em um formato compactado economiza espaço no disco rígido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Defina os canais de luz: 1 para óptica DIC, 2 para GFP, 3 para RFP, etc. Adicione aqueles que foram usados na gravação 4D. Clique em "processamento de canal ativado" para detectá-los.</li>
	<li>Comece a traçar a linhagem celular do embrião. A tela agora contém duas janelas principais: a janela de vídeo e a janela de linhagem celular.<ol>
<li>Na janela de linhagem, selecione um ramo de linhagem e use o mouse para clicar no núcleo celular correspondente a esta célula na janela de vídeo.</li>
		<li>Siga a célula espacialmente e ao longo do tempo reproduzindo o filme 4D para frente, para trás ou para cima ou para baixo em um nível, usando as teclas do cursor.</li>
		<li>Clique periodicamente no núcleo celular. Isso gera um ponto no ramo de linhagem e registra as coordenadas espaciais da célula neste momento. Como resultado, a linhagem celular progride, e reconstruções 3D do embrião são possíveis.</li>
		<li>Marque mitose clicando na tecla de retorno. Em seguida, selecione uma das células da filha e siga-a como antes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita o processo (etapas 5.6.1 a 5.6.4) para que o resto das células embrionárias rastreiem a linhagem celular completa, ou siga células específicas de interesse, como as submetidas à apoptose.</li>
	<li>Compare a linhagem mutante com a linhagem celular wt c. elegans estereotipada.</li>
</ol>

<ol><li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Um dos grandes desafios da biologia moderna é entender o desenvolvimento de organismos multicelulares. C. elegans emergiu como um dos modelos mais adequados para estudar a coordenação fina entre a proliferação celular e a diferenciação celular no embrião em desenvolvimento. Do ponto de vista óptico, seu corpo transparente e seu pequeno tamanho fazem deste nematode um espécime ideal para microscopia DIC. Outros organismos com características semelhantes também foram submetidos à análise de microscopia 4D 11,12,13,14,15,16.
Para esses estudos de desenvolvimento, a inativação genética genética por frente ou reversa fornece uma pista de seu envolvimento em embriogênese. Uma vez provado que um gene desempenha um papel no desenvolvimento, o próximo passo é definir seu papel exato no estabelecimento do plano corporal correto. Imunostaining é a abordagem selecionada para a maioria dos modelos. Esta técnica elucida problemas na diferenciação celular ou expressão de marcadores específicos. No entanto, uma grande limitação dessa abordagem é que ela só fornece uma visão estática da expressão de um único ou mais marcadores em um ponto fixo de desenvolvimento. Uma visão dinâmica desses marcadores durante todo o desenvolvimento só pode ser obtida colorindo diferentes embriões em diferentes pontos de tempo. Além disso, a reconstrução da linhagem celular não é possível em amostras tão fixas.
A microscopia 4D é uma abordagem complementar para o estudo do desenvolvimento embrionário. Essa técnica revela a dinâmica de desenvolvimento em uma resolução de nível celular. Qualquer defeito no embrião, como problemas na orientação do fuso, migração celular, apoptose, especificação do destino celular, etc. aparecerá em um filme 4D que pode ser visualizado para frente e para trás, quantificado e pontuado pelo pesquisador. Usando essa técnica, praticamente todas as células do embrião podem ser acompanhadas até o momento em que o embrião começa a se mover. Embriões submetidos à microscopia 4D apenas com luz visível e óptica Nomarski não incorrem em fotodamagem. As varreduras fluorescentes também podem ser intercaladas dentro da gravação para detectar quando e onde um gene é expresso. Embriões que sofrem fotodamagem significativa são identificados pela extensão do ciclo celular que causa forte irradiação UV em comparação com um embrião de linhagem padrão WT. Nesse caso, a fotodamagem pode ser reduzida reduzindo a intensidade da lâmpada UV e aumentando a sensibilidade da câmera ou o tempo de exposição. Características morfológicas e marcadores moleculares podem ajudar a esclarecer o desenvolvimento embrionário de qualquer mutante.
A criação de um sistema de microscopia 4D é fácil de implementar em laboratório e, após alguma prática, permite uma análise incomparável da dinâmica celular e rastreamento de linhagem de culturas celulares e espécimes transparentes vivos a um nível de resolução de cada célula no campo do microscópio. O rastreamento de linhagem celular em imagens DIC ainda é processado manualmente. É demorado e, embora o software detecte erros de linhagem, como diferentes ramos de linhagem marcando a mesma célula, erros são possíveis. Embora a detecção automática de células rotuladas por GFP seja bem desenvolvida2, o software de rastreamento de linhagem complementar baseado em células não marcadas e imagens de luz visível ainda está em estágio inicial e não é realmente útil para uma análise completa de embriões. Sem dúvida, a aplicação de sistemas de reconhecimento de imagem para o campo da microscopia de luz visível trará um grande avanço neste campo.

A microscopia 4D é um sistema de gravação de lapso de tempo multifocal que permite aos pesquisadores registrar e quantificar a dinâmica celular de uma amostra biológica espacialmente e ao longo do tempo. Culturas celulares, leveduras ou tecidos vivos podem ser submetidos à análise 4D, mas essa técnica é especialmente adequada para analisar o desenvolvimento de embriões vivos. A resolução desta análise atinge o nível de cada célula do embrião. Cada divisão celular pode ser detectada, e movimentos celulares podem ser rastreados ao longo do tempo. Os destinos celulares são avaliados de acordo com a posição e forma que as células adquirem. O uso da óptica Nomarski aumenta o contraste de amostras transparentes não manchadas usando feixes de luz hitogonalmente polarizados que interferem no plano focal. As imagens resultantes aparecem tridimensionais, iluminadas de um lado.
Outros métodos baseados no uso de microscopia confocal e animais transgênicos GFP para detecção automática de núcleos e geração de linhagens celulares foram desenvolvidos 1,2. A vantagem desses sistemas é óbvia: o software substitui muito a necessidade de marcar manualmente cada núcleo durante um período de tempo (embora alguma supervisão manual seja necessária durante os estágios finais). No entanto, os processos celulares envolvendo mudanças na forma celular ou dinâmica da membrana, como os que ocorrem durante a diferenciação celular, migração, apoptose ou engolfação de cadáver, permanecem escondidos como um fundo preto nas imagens de núcleos fluorescentes.
Em contraste, a microscopia 4D Nomarski (também chamada microscopia DIC, microscopia de contraste de interferência diferencial) mostra alterações nos núcleos e na forma celular que ocorrem durante o desenvolvimento de animais selvagens ou mutantes. Isso permite o rastreamento de linhagem celular usando microscópios padrão, empregando apenas luz transmitida. Não há necessidade geral de usar animais transgênicos, exceto para mostrar padrões de expressão específicos, nesse caso os exames fluorescentes podem ser intercalados. Portanto, essa pode ser a abordagem ideal para muitos laboratórios que trabalham em processos celulares dinâmicos, como embriogênese ou apoptose, que podem ser destacados sob microscopia DIC 3,4,5,6,7.
Vários programas flexíveis e fáceis de usar estão disponíveis para capturar imagens microscópicas e reconstruir linhagens celulares, modelos 3D, caminhos de migração celular, etc. na amostra gravada. Em um experimento padrão, as imagens são adquiridas em uma série de planos focais, a uma distância constante, o número que depende da espessura da amostra. A resolução temporal da análise pode ser otimizada aumentando a frequência de varredura. Não há praticamente nenhum limite para a duração da gravação além da capacidade de armazenamento do computador. Por exemplo, para uma análise de desenvolvimento de embriões C. elegans , nós rotineiramente adquirimos imagens em 30 planos focais (1 micron-passo cada), a cada 30 segundos durante 12 horas.
Esses sistemas foram aplicados à análise de vários embriões animais, como Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster11, outros embriões de nematoides 12,13, tardigrades14,15 e até mesmo embriões de camundongosprecoces 16. O único requisito é ter um embrião transparente capaz de desenvolver na preparação do slide sob o microscópio.
Em resumo, a microscopia 4D baseada em DIC é especialmente útil para 1) analisando o desenvolvimento embrionário de animais pequenos e transparentes: traçando a linhagem celular, caminhos de migração celular, geração de modelos 3D, etc; 2) definição de padrões de expressão genética; 3) estudar a dinâmica da cultura celular, da levedura às células humanas; 4) análise da dinâmica tecidual ou fragmentos de embriões; 5) quantificar cinética de morte celular e engolfação de cadáver; e 6) realização de análise filogenia comparativa com base em características embrionárias de desenvolvimento. Se houver interesse em qualquer um desses tópicos (ou similares), a microscopia 4D pode ser usada.

<table><tbody><tr><td>Caenorhabditis elegans (N2)</td><td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td><td>N2</td><td>WT cepa de C. elegans. Pode ser solicitado no GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans (VZ454)</td><td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td><td>VZ454</td><td>gsr-1(tm3574) Cepa mutante de C. elegans. Pode ser solicitado no GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td></tr> <tr><td>Software de rastreamento de linhagem celular</td><td>SIMI</td><td>Simi BioCell</td><td>Este é o software para reconstruir a linhagem de células embrionárias. Para uma explicação detalhada, consulte: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html</td></tr><tr><td>Câmera do microscópio</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-R2</td><td>Câmera miscroscópio para luz transmitida e UV</td></tr><tr><td>Software de controle do microscópio</td><td>Caenotec</td><td>Time to Live</td><td>Este software controla o microscópio para realizar a captura de imagem 4D. Pode ser solicitado em: Caenotec Prof. Ralf Schnabel Kleine Dorfstr. 9 38312 B&ouml; r&szlig; um, Alemanha, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de</td></tr><tr><td>Software de controle de microscópio</td><td>Micro-manager</td><td>Micro-manager</td><td>Este software controla o microscópio para realizar a captura de imagem 4D. Pode ser baixado em: https://micro-manager.org/</td></tr> <tr><td>Microscópio motorizado</td><td>Leica</td><td>Leica DM6000</td><td>Microscópio vertical motorizado para realizar microscopia 4D</td></tr><tr><td>Equipamento padrão em um laboratório de Biologia Molecular.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td>Esteromicroscópio para manipular nematóides e preparar embriões.</td></tr></tbody></table>

microscopia 4d: desvendando caenorhabditis elegans desenvolvimento embrionário usando microscopia nomarski

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

A microscopia 4D é uma ferramenta inestimável para desvendar o processo de desenvolvimento embrionário em diferentes animais. Nas últimas décadas, caenorhabditis elegans emergiu como um dos melhores modelos para estudar o desenvolvimento. Do ponto de vista óptico, seu tamanho e corpo transparente fazem deste nematode um espécime ideal para microscopia DIC (Diferencial Interference Contrast ou Nomarski). Este artigo ilustra um protocolo para o cultivo de nematoides C. elegans , preparando e montando seus embriões, realizando microscopia 4D e rastreamento de linhagem celular. O método é baseado em registros multifocais de imagens e análises de nomarski com software específico. Esta técnica revela dinâmica de desenvolvimento embrionário no nível celular. Qualquer defeito embrionário em mutantes, como problemas na orientação do fuso, migração celular, apoptose ou especificação do destino celular, pode ser detectado e pontuado de forma eficiente. Praticamente todas as células do embrião podem ser seguidas até o momento em que o embrião começa a se mover. Traçar a linhagem celular completa de um embrião C. elegans por microscopia DIC 4D é trabalhoso, mas o uso de software específico facilita muito essa tarefa. Além disso, essa técnica é fácil de implementar em laboratório. A microscopia 4D é uma ferramenta versátil e abre a possibilidade de realizar uma análise incomparável do desenvolvimento embrionário.

Para caracterizar o desenvolvimento embrionário de um mutante C. elegans para o gene gsr-1, que codifica a enzima glutathione reductase, necessária para regenerar glutationa reduzida (GSH) e envolvida na manutenção da homeostase redox no nematode, realizamos microscopia 4D de um mutante de exclusão gsr-1 (tm3574) que é uma perda de função allele causando um fenótipo de parada embrionária precoce18. Tanto wt quanto gsr-1 (tm3574) mutantes C. elegans nematodes foram cultivados em placas NGM semeadas com E. coli OP50 como a fonte de alimento17. os vermes gsr-1 (tm3574) foram cultivados como heterozigos a 20 °C por duas gerações e, em seguida, os vermes homozigos (que são capazes de crescer até a idade adulta graças à carga materna) foram deslocados para 25 °C para uma incubação durante a noite antes da análise de embriões. Placas de vermes foram incubadas dentro de caixas de papelão para evitar condensação (Figura 1). Nematoides gravid foram abertos para extrair embriões jovens.
Para comparar o desenvolvimento embrionário do mutante versus o estereotipado WT em condições idênticas, um WT (como controle) e um embrião gsr-1 (tm3574) foram colocados na mesma preparação um ao lado do outro. O fluxo de trabalho de microscopia 4D foi executado em um microscópio de ereta motorizado padrão equipado com óptica DIC. Os parâmetros de gravação selecionados no programa de controle de microscópio foram: pilhas z de 30 planos focais a 1 micron de distância cada, intervalos de 30 segundos entre o início de cada pilha z e 1500 z-stacks (12,5 horas de gravação). A temperatura de gravação foi ajustada para 25 °C (tanto na sala quanto no estágio do microscópio) (Figura 2).
Uma vez que a gravação foi concluída, o arquivo de imagens foi aberto, e a linhagem celular foi reconstruída usando software de rastreamento de linhagem clicando em núcleos celulares mostrados na janela de vídeo (Figura 4). A linhagem celular mutante gsr-1 (tm3574) foi comparada com a linhagem C. elegans WT retratada no fundo. Um resultado importante foi a detecção de um atraso progressivo do ciclo celular durante o desenvolvimento embrionário. Como consequência, embriões mutantes presos em estágios intermediários, enquanto os embriões WT progrediram e finalmente eclodiram como larvas.
A preparação e a observação direta de embriões sob o microscópio ou imunostaining com anticorpos contra marcadores embrionários tardios poderiam revelar a presença de uma alta porcentagem de embriões jovens no mutante em comparação com a prisão de embriões WT. poderia então ser inferida como a explicação mais plausível. No entanto, a prova direta e a quantificação exata do atraso do ciclo celular só podem ser mostradas de forma elegante e fácil e quantificadas através de um experimento de microscopia 4D. Outras características importantes do desenvolvimento embrionário, como diferenciação celular ou apoptose (Figura 5) também podem ser visualizadas de forma dinâmica usando microscopia 4D que oferece uma análise detalhada de múltiplos aspectos do desenvolvimento em um único experimento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig01.jpg"> Figura 1: C. elegans nematoides crescendo em condições laboratoriais. Os nematoides são cultivados em placas de GNM semeadas por E. coli, armazenados em caixas de papelão e incubados a 15 °C, 20 °C ou 25 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig02.jpg"> Figura 2: Captura de tela do software de gravação de microscopia 4D. Exemplo de dois programas de software de controle de microscópio diferentes (A e B). Esses programas criam fluxos de trabalho para controlar o microscópio e a captura de imagens durante a gravação de microscopia 4D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig03.jpg"> Figura 3: Fotografias em série da preparação do ágar pad e montagem do embrião C. elegans . A. Tubos de ágar preparados. B-C. Preparação do ágar pad. D. Deslize parcialmente cheio de água. E. Selar o escorregador com geleia de petróleo. F. Preparação final. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig04.jpg"> Figura 4: Capturas de tela serial do software rastreador de linhagem celular. O programa permite a reconstrução da linhagem celular embrionária de um mutante de atraso de ciclo celular (esquerda) e um embrião WT (direita) C. elegans . Um. Um passo inicial do desenvolvimento. B-C. O desenvolvimento de ambos os embriões progride ao longo do tempo. O embrião D. WT desenvolve-se adequadamente e inicia o alongamento enquanto o mutante prende. Em todos os casos, o programa exibe a janela de vídeo e a janela de linhagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig05v2.jpg"> Figura 5: Forma refrátil de lentilha de células apoptóticas em um embrião C. elegans WT. O destino celular, definido por características morfológicas, pode ser avaliado por microscopia 4D. A imagem mostra um embrião C. elegans no estágio do feijão. As células vivas mostram núcleos de forma lisa cercados por um citoplasma granular. Em contraste, as células apoptóticas (setas amarelas) condensam e adotam uma forma refrátil semelhante à lentilha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar e montar embriões de Caenorhabditis elegans , registrando o desenvolvimento sob um microscópio 4D e traçando a linhagem celular.

Microscopia 4D: Desvendando caenorhabditis elegans Desenvolvimento Embrionário usando Microscopia Nomarski

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

A microscopia 4D é uma ferramenta valiosa para reconstruir a linhagem celular completa do embrião de C. elegans ou qualquer outro espécime no nível de uma única célula. A óptica Nomarski pode ser usada para destacar as mudanças na forma da célula durante o desenvolvimento com um microscópio padrão e luz transmitida sem a necessidade de animais transgênicos ou microscopia de fluorescência. O microscópio 4D permite estudar a ciclagem celular, proliferação, diferenciação e apoptose em C.elegans e em outros sistemas, como mamíferos ou cultura de células teciduais.O rastreamento da linhagem celular em imagens DIC é realizado manualmente. É demorado e requer alguma prática para realizar uma análise completa do embrião. Demonstrando o procedimento estará Begona Ezcurra, técnica em nosso laboratório.Antes de preparar os embriões, ajuste a temperatura de registro do microscópio 4D para 15, 20 ou 25 graus Celsius e configure o microscópio para registrar 1.500, 30 pilhas z de plano focal separadas por um mícron com intervalos de 30 segundos entre o início de cada pilha. Em seguida, alíquota de 500 a 1000 microlitros de ágar líquido 4,5% em tubos de vidro de três milímetros e sele cuidadosamente os tubos com filme de cera para evitar a dessecação. Para preparar uma almofada de ágar homogênea fina para a gravação, aqueça cuidadosamente e alíquota de ágar sobre um queimador de álcool até que o ágar derreta e coloque o tubo em um bloco de calor de 80 graus Celsius.Coloque uma lâmina de microscópio de vidro em um pedaço de plástico e use uma pipeta de pasto em uma mão para colocar uma pequena gota de ágar derretido no centro da lâmina e, em seguida, use imediatamente a outra mão para colocar uma segunda lâmina na gota de ágar para criar uma almofada de ágar muito fina. Para montar os embriões, primeiro use um selecionador para transferir de 5 a 10 hermafroditas grávidas para um vidro de relojoeiro cheio de água sob um microscópio estéreo. Use um bisturi para abrir os nematóides hermafroditas e extraia de um a quatro óvulos precoces do útero.Deslize suavemente a corrediça superior da almofada de ágar e use um tubo capilar para colocar um ovo precoce no centro da almofada. Use um cílio colado na ponta de um palito para ajustar a posição do ovo conforme necessário e use a pipeta capilar para remover o excesso de água. Use um bisturi para cobrir lenta e obliquamente a lamínula sobre a preparação antes de usar uma micropipeta para preencher 3/4 do espaço ao redor da almofada de ágar com água.Em seguida, sele a lamínula com vaselina para evitar a dessecação durante longos períodos de gravação. Após a selagem, coloque a lâmina no microscópio 4D e use uma objetiva de baixa ampliação para colocar o embrião em foco. Selecione a objetiva de imersão 100X e foque o condensador.Abra completamente a abertura do condensador e feche o diafragma de campo para fornecer uma abertura numérica mais alta e maior resolução. Gire o prisma de Wollaston para obter uma imagem tridimensional do embrião iluminado de um lado, depois gire o prisma na outra direção para obter o efeito de ter o embrião iluminado do outro lado e comece a gravação 4D. Para a reconstrução da linhagem celular de um embrião gravado em filme 4D, abra o software de rastreamento de linhagem e selecione Arquivo e Novo projeto.Selecione o modelo de linhagem celular apropriado dependendo da temperatura de gravação e defina a contagem de varredura para 1500. O tempo entre as varreduras é de 30 segundos, a contagem de níveis é de 30 e a distância entre os níveis é de um mícron. Selecione o arquivo de imagem, o formato e o diretório onde as imagens foram salvas.Selecione se as imagens foram salvas como imagens únicas ou como pilhas z de várias imagens e defina a nomenclatura do arquivo e os formatos de imagem. Em seguida, clique em Processamento de canal ativado para detectar e definir os canais de luz apropriados do filme 4D. Para rastreamento de linhagem celular, inicie o software de rastreamento de linhagem celular.Uma janela de vídeo e uma janela de linhagem de células aparecerão. Na janela de linhagem, selecione a ramificação de linhagem e clique no núcleo da célula correspondente a esta célula na janela de vídeo. Reproduza o filme 4D para frente, para trás ou para cima ou para baixo um nível para seguir a célula de interesse espacialmente ao longo do tempo.Clique periodicamente no núcleo da célula para gerar um ponto no ramo da linhagem e registrar as coordenadas espaciais da célula em um momento específico. Como resultado, são possíveis progressões de linhagem celular e reconstruções 3D do embrião. Em seguida, pressione a tecla Return para marcar a mitose e selecione uma das células-filhas para acompanhar a progressão celular, conforme demonstrado.Repita a análise para o resto das células embrionárias para traçar a linhagem celular completa ou para seguir células específicas de interesse, como aquelas que sofrem apoptose. Permitir a comparação de linhagens mutantes de interesse com a linhagem celular estereotipada de C. elegans do tipo selvagem. As placas sem-fim são incubadas dentro de caixas de papelão para evitar condensação.Assim que a gravação for concluída, a linhagem celular pode ser reconstruída usando o software de rastreamento de linhagem, conforme demonstrado. Por exemplo, nesta análise representativa, a linhagem de células embrionárias mutante gsr-1 rastreada foi comparada com a linhagem de tipo selvagem C. elegans. E a detecção de um atraso progressivo no ciclo celular durante o desenvolvimento embrionário foi revelada.Como consequência, os embriões mutantes foram presos em estágios intermediários, enquanto os embriões do tipo selvagem progrediram e finalmente eclodiram como larvas. Além disso, outras características importantes do desenvolvimento embrionário, como a apoptose, podem ser visualizadas dinamicamente usando microscopia 4D. O rastreamento de linhagem das imagens DIC deve ser processado manualmente.Um processamento de software de células não marcadas na luz visível nos estágios iniciais de desenvolvimento não é preciso para análise de embriões. A aplicação do sistema de reconhecimento de imagem ao campo da microscopia de luz visível trará um grande avanço no campo da biologia do desenvolvimento.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Microscopia 4D: Desvendando caenorhabditis elegans Desenvolvimento Embrionário usando Microscopia Nomarski

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