Name: Visualizando a Interiorização Imunoreativa Do Peptídeo Relacionado ao Gene calcitonina do Rato Cranial Dura Mater com Imunofluorescência e Rastreamento Neural (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprenda a visualizar fibras nervosas imunorreativas ao CGRP e vasos sanguíneos na dura-máter craniana de ratos usando imunofluorescência e rastreamento neural retrógrado. Este método permite análise 3D detalhada das interações neurovasculares.

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Este estudo foi apoiado pelo projeto do Programa Nacional de P&D da China (Project Code nº 2019YFC1709103; nº 2018YFC1707804) e Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Código de Projeto nº 81774211; nº 81774432; nº 81801561).

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Acupuntura e Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (número de referência D2018-09-29-1). Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Foram utilizados neste estudo 12 ratos machos adultos Sprague-Dawley (peso 220 ± 20 g). Os animais [número de licença SCXK (JING) 2017-0005] foram fornecidos pelos Institutos Nacionais de Controle de Alimentos e Drogas.
1. Innervation of rat cranial dura mater
<ol><li>
Perfusões
	<ol>
<li>Injetar intraperitoneally uma overdose de solução de tribromoetanol (250 mg/kg) no rato para induzir eutanásia.</li>
		<li>Uma vez que a respiração pare, a perfuse transcardial com 100 mL de soro fisiológico normal de 0,9%, seguida por 250-300 mL de 4% de paraformaldeído em 0,1 M tampão fosfato (PB, pH 7.4).</li>
		<li>Após a perfusão, remova a pele da cabeça e abra o crânio para expor o lado dura e dorsal do cérebro. Em seguida, disseca a dura-máter craniana ao longo do tronco cerebral à lâmpada olfativa no padrão de montagem total(Figura 1). Realize a pós-fixação em 4% paraformaldeído por 2h e, em seguida, crioproteto em 25% de sacarose em 0,1 M PB por mais de 24h a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imunohistoquímica de fluorescência para rotulagem de CGRP e fálico NOTA: Uma combinação de coloração fluorescente de CGRP e fábula foi aplicada para revelar a correlação espacial das fibras nervosas durais e vasos sanguíneos na dura-dura do rato no padrão de montagem total.<ol>
<li>Enxágüe a dura-m de 0,1 M PB por cerca de 1 min.</li>
		<li>Incubar o dura mater em uma solução de bloqueio contendo 3% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 em 0,1 M PB por 30 min.</li>
		<li>Transfira o dura mater para o anticorpo anti-CGRP do mouse (1:1000) em 0,1 M PB contendo 1% de soro normal de burro e 0,5% Triton X-100 durante a noite a 4 °C11.</li>
		<li>Lave a dura mater três vezes em 0,1 M PB no dia seguinte.</li>
		<li>Incubar o dura mater em uma solução mista de anticorpo médio Alexa Fluor 488 (1:500) e falo 568 (1:1000) em 0,1 M PB contendo 1% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 por 1,5 h em temperatura ambiente (26 °C).</li>
		<li>Lave a dura mater três vezes em 0,1 M PB.</li>
		<li>Apare as bordas e monte-as em slides de microscópio (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Coloque as tampas com 50% de glicerina antes da observação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Observação e gravação
	<ol>
<li>Observe as amostras fluorescentes sob um microscópio fluorescente ou um sistema de imagem confocal.</li>
		<li>Pegue as imagens de toda a dura-montagem por um microscópio fluorescente equipado com uma câmera digital (4x, NA: 0.13), e use um tempo de exposição de 500 ms. Os mosaicos de imagem do dura mater foram completados com um software de microscópio fluorescente (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Faça imagens das fibras nervosas imunoreativas CGRP e vasos sanguíneos rotulados com falioidina na dura mater usando um microscópio confocal. Os comprimentos de onda de excitação e emissão foram de 488 nm (verde) e 594 nm (vermelho). O pinhole confocal é de 110 (20x) e 105 μm (40x). A resolução da captura de imagem é de 640 x 640 pixels.</li>
		<li>Capture 20 imagens em quadros de 2 μm de cada seção de 40 μm de espessura e realize uma integração de imagem em foco único com um sistema de software associado ao processamento de imagens confocal para análise 3D da seguinte forma: Defina o Plano Focal iniciar | Set End focal plane | Definir o tamanho do passo | Escolha | padrão de profundidade | de captura de imagens Série Z.
</li>
		<li>Use um software de edição de fotos para ajustar o brilho e o contraste das imagens para otimizar a visualização. Preste atenção para não remover nenhum dado das imagens.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Estudo de rastreamento retrógrado com FG
<ol><li>Procedimentos cirúrgicos
	<ol>
<li>Determine a área de coordenação de interesse em rato cranial dura mater.</li>
		<li>Prepare uma micro-seringa de 10 μL e teste-a com parafina líquida.</li>
		<li>Anestesiar os ratos com solução de tribromoetanol (150 mg/kg) via injeção intraperitoneal. Verifique a profundidade na anestesia pela falta de resposta ao aperto do dedo do dedo do dedo.</li>
		<li>Raspe a cabeça do rato com uma navalha elétrica.</li>
		<li>Coloque as barras de ouvido cegas no rato e coloque-o no dispositivo estereotaxico. Em seguida, coloque o porta-boca e aplique pomada oftálmica nos olhos.</li>
		<li>Limpe o local cirúrgico da pele da cabeça usando 10% de iodo povidone seguido de 75% de etanol.</li>
		<li>Faça uma incisão ao longo da linha média do couro cabeludo.</li>
		<li>Remova sem rodeios e tecidos musculares do crânio usando aplicadores estéreis com ponta de algodão(Figura 1A).</li>
		<li>Faça um pequeno furo (~5-7 mm) usando uma broca de rebarba com um bit de ponta redonda (#106) nos ossos parietal esquerdo e temporal acima do MMA12, e certifique-se de que a dura-moria craniana foi mantida intacta(Figura 1B).</li>
		<li>Construa um banco ao redor do orifício com cimento silicato dental para limitar a propagação do rastreador(Figura 1C).</li>
		<li>Adicione 2 μL de 2% FG no orifício ao redor do MMA com uma micro-seringa de 10 μL(Figura 1D).</li>
		<li>Cubra o buraco com um pequeno pedaço de esponja hemostática.</li>
		<li>Coloque um pedaço de filme de parafina no buraco e sele as bordas com cera óssea para evitar o vazamento de rastreador e para evitar contaminar os tecidos circundantes.</li>
		<li>Sutura a ferida com fio estéril.</li>
		<li>Mantenha os ratos em uma área quente até que eles se recuperem completamente.</li>
		<li>Devolva os ratos de volta às suas gaiolas e adicione um antibiótico e analgésico na água potável.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusões e seções
	<ol>
<li>Após 7 dias de sobrevivência, perfundir esses ratos como mencionado acima nos procedimentos da seção 1.1.</li>
		<li>Disseca os DRGs TG e C1-4, depois pós-fixe e crioproteta-los como mencionado acima na seção 1.1.3 (Figura 1F).</li>
		<li>Corte os TG e DRGs na espessura de 30 μm em um sistema de microtome criostat na direção sagital e montado em lâminas de vidro revestidas de silano.</li>
	</ol></li>
	<li>Imunofluorescências duplas para rotulagem FG e CGRP nos TG e DRGs NOTA: Embora a rotulagem FG possa ser observada diretamente com iluminação UV sob lâmpada de mercúrio sem coloração adicional13,14,15,16, os neurônios rotulados com FG foram examinados posteriormente em TG e DRGs cervicais utilizando imunofluorescências duplas com FG e CGRP para revelar as origens das fibras nervosas dural CGRP-imunoreactive nos TG e DRGs.<ol>
<li>Circule as seções com a caneta histoquímica.</li>
		<li>Incubar as seções por 30 min em uma solução de bloqueio contendo 3% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 em 0,1 M PB.</li>
		<li>Transfira as amostras para a solução de coelhinho anti-fluorogold (1:1000) e anticorpo anti-CGRP do rato (1:1000) em 0,1 M PB contendo 1% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Lave as seções três vezes em 0,1 M PB no dia seguinte.</li>
		<li>Incubar em uma solução mista de anti-coelho de burro Alexa Fluor 594 (1:500) e anti-mouse de burro Alexa Fluor 488 (1:500) anticorpo secundário em 0,1 M PB contendo 1% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 por 1,5 h em temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave e aplique tampas nas seções como os procedimentos nas etapas 1.2.6 e 1.2.8.</li>
	</ol></li>
	<li>Observação e gravação
	<ol>
<li>Tire imagens dos neurônios rotulados por FG em TG e DRGs sob iluminação UV por microscópio fluorescente equipado com uma câmera digital.</li>
		<li>Capture imagens dos neurônios rotulados FG e CGRP em TG e DRGs sob um microscópio fluorescente equipado com uma câmera digital.</li>
		<li>Use o software de edição para ajustar o brilho e o contraste das imagens e adicionar rótulos nas imagens.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kekere, V., Alsayouri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy%2C+Head+and+Neck%2C+Dura+Mater%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls%22%5BJournal%5D)">Anatomy, Head and Neck, Dura Mater.</a> StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).</li>
<li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+origin+of+TRPV1+receptor-containing+nerve+fibers+in+the+dura+mater+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat.</a> Brain Research. 1173, 84-91 (2007).</li>
<li>Jacobs, B., Dussor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+contributions+to+migraine%3A+moving+beyond+vasodilation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation.</a> Neuroscience. 338, 130-144 (2016).</li>
<li>Dodick, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase-by-phase+review+of+migraine+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Headache%22%5BJournal%5D)">A phase-by-phase review of migraine pathophysiology.</a> Headache. 58, Suppl 1 4-16 (2018).</li>
<li>Amin, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+pathophysiological+mechanisms+of+migraine+attacks+induced+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide-38%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%3A+A+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38.</a> Brain: A Journal of Neurology. 137, Pt 3 779-794 (2014).</li>
<li>Keller, J. T., Marfurt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidergic+and+serotoninergic+innervation+of+the+rat+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater.</a> The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).</li>
<li>Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+of+the+dura+mater+encephali+of+cat+and+rat%3A+ultrastructure+and+calcitonin+gene-related+peptide-like+and+substance+P-like+immunoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity.</a> Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).</li>
<li>Lennerz, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+receptor-like+receptor+%28CLR%29%2C+receptor+activity-modifying+protein+1+%28RAMP1%29%2C+and+calcitonin+gene-related+peptide+%28CGRP%29+immunoreactivity+in+the+rat+trigeminovascular+system%3A+differences+between+peripheral+and+central+CGRP+receptor+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution.</a> The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).</li>
<li>Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+nerve+fibers+storing+CGRP+and+CGRP+receptors+in+the+peripheral+trigeminovascular+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%3A+Official+Journal+of+the+American+Pain+Society%22%5BJournal%5D)">Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system.</a> The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).</li>
<li>Xu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+distribution+of+blood+vessels+and+nerve+fibers+in+the+skin+tissues+of+acupoint+%22Taichong%22+%28LR3%29+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Zhen+Ci+Yan+Jiu%22%5BJournal%5D)">Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat.</a> Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).</li>
<li>Cui, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+calcitonin+gene-related+peptide+on+the+neurons+associated+Zusanli+%28ST+36%29+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Integrative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).</li>
<li>Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibres+and+their+terminals+of+the+dura+mater+encephali+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat.</a> Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).</li>
<li>Leng, C., Chen, L., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+P2X1-6+receptor+expression+in+retrograde+Fluorogold-labeled+DRG+neurons+from+rat+chronic+neuropathic+pain+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model.</a> Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).</li>
<li>Huang, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+with+fluorogold+in+an+animal+optic+nerve+crush+model%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model.</a> Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).</li>
<li>Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+protective+effect+of+local+administration+of+triamcinolone+or+systemic+treatment+with+methylprednisolone+against+damages+caused+by+optic+nerve+crush+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).</li>
<li>Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+recombinant+human+granulocyte+colony-stimulating+factor+%28G-CSF%29+in+neurodegeneration+after+optic+nerve+crush+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).</li>
<li>Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcitonin+gene-related+peptide+in+peripheral+and+central+pain+mechanisms+including+migraine%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine.</a> Pain. 158 (4), 543-559 (2017).</li>
<li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li>
<li>Kou, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+neural+circuits+from+peripheral+afferents+to+the+spinal+cord%3A+possible+implications+for+diabetic+polyneuropathy+in+streptozotocin-induced+type+1+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+neural+circuits%22%5BJournal%5D)">Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 6(2014).</li>
<li>Alarcon-Martinez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+pericytes+express+%CE%B1-smooth+muscle+actin%2C+which+requires+prevention+of+filamentous-actin+depolymerization+for+detection%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection.</a> eLife. 7, 34861(2018).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Histology%22%5BJournal%5D)">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li>
<li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+projections+of+sensory+innervation+of+the+rat+superior+sagittal+sinus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus.</a> Neuroscience. 129, 431-437 (2004).</li>
<li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+projections+of+the+sensory+innervation+of+the+rat+middle+meningeal+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery.</a> Brain Research. 1208, 103-110 (2008).</li>
<li>Schmued, L. C., Fallon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoro-Gold%3A+a+new+fluorescent+retrograde+axonal+tracer+with+numerous+unique+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties.</a> Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste estudo, demonstramos com sucesso a distribuição e a origem das fibras nervosas imunoreativas CGRP no dura-pena craniano usando imunofluorescência, reconstrução 3D e abordagens de rastreamento neural com anticorpo CGRP e rastreador neural FG, fornecendo as evidências histológicas e químicas para entender melhor a rede neurovascular dural.
Como era conhecido, o CGRP desempenha um papel crítico na patogênese da enxaqueca4,17. Mostro...

A dura-máter craniana é a camada mais externa de meninges para proteger o cérebro e contém vasos sanguíneos abundantes e diferentes tipos de fibras nervosas1,2. Muitos estudos têm demonstrado que a dura-dura-maternidade craniana sensibilizada pode ser o fator-chave que leva à ocorrência de dores de cabeça, envolvendo a vasodilatação anormal e a inervação3,4,5. Assim, o conhecimento da estrutura neurovascular na dura-escola craniana é importante para a compreensão da patogênese das dores de cabeça, especialmente para a enxaqueca.
Embora a innervação dura tenha sido previamente estudada com a imunohistoquímica convencional, a correlação espacial das fibras nervosas e vasos sanguíneos na duracolia craniana foram menos estudadas6,7,8,9. Para revelar a estrutura neurovascular dural com mais detalhes, peptídeos relacionados a genes de calcitonina (CGRP) e faloideína foram selecionados como marcadores para, respectivamente, coloração das fibras nervosas durais e vasos sanguíneos na dura-dura craniana de todo o monte com imunofluorescência e histoquímica fluorescente10. Pode ser uma escolha ideal para obter uma visão tridimensional (3D) da estrutura neurovascular. Além disso, fluorogold (FG) foi aplicada na área em torno da artéria meningeal média (MMA) na dura-dura craniana para determinar a origem das fibras nervosas imunorreativas CGRP, e rastreada à gânglio trigeminal (TG) e gânglios de raiz dorsal (DRGs) cervicais (DRGs), enquanto os neurônios rotulados pelo FG foram examinados juntamente com CGRP usando imunofluorescência.
O objetivo deste estudo foi fornecer uma ferramenta eficaz para a investigação da estrutura neurovascular na dura mater craniana para a inervação CGRP-imunoreactive e sua origem. Aproveitando a dura-dura-montagem transparente e combinando a imunofluorescência, o rastreamento retrógrado, as técnicas confocal e a reconstrução 3D, esperamos apresentar uma nova visão 3D da estrutura neurovascular na dura-duracaca craniana. Essas abordagens metodológicas podem ser ainda mais servidas para explorar a patogênese de diferentes dores de cabeça.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 burro anti-rato IgG (H+L)</td><td>Invitrogen por Thermo Fisher Scientific</td><td>A21202</td><td>Proteger da luz; RRID: AB_141607</td></tr><tr><td>Instrumento de estereotaxia cerebral</td><td>Narishige</td><td>SR-50</td><td></td></tr><tr><td>CellSens Dimension</td><td>Olympus</td><td>Versão 1.1</td><td>Software do microscópio fluorescente</td></tr><tr><td>Sistema de imagem confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Fluorogold (FG)</td><td>Fluorochrome</td><td>52-9400</td><td>Proteger da luz</td></tr><tr><td>Sistema de imagem fluorescente</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo de congelamento</td><td>Thermo</td><td>Microm International&nbsp; </td><td></td>GmbH</tr><tr><td>Olympus FV10-ASW 4.2a</td><td>Olympus</td><td>Versão 4.2</td><td>Sistema de software de processamento de imagem confocal</td></tr><tr><td>Micro Drill</td><td>Saeyang Microtech</td><td>Marathon-N7</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-CGRP</td><td>Abcam</td><td>ab81887</td><td>RRID: AB_1658411</td></tr><tr><td>Soro de burro normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Faloidina 568</td><td>Molecular& nbsp; Sondas</td><td>A12380</td><td>Protegem da luz</td></tr><tr><td>Photoshop e&nbsp; Ilustração</td><td>Adobe</td><td>CS6</td><td>Software de edição de fotos</td></tr><tr><td>Coelho anti-fluorogold</td><td>Abcam</td><td>ab153</td><td>RRID: AB_90738</td></tr><tr><td>Sprague Dawley</td><td>National Institutes for Food and Drug Control</td><td>SCXK (JING) 2014-0013</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost mais lâminas de microscópio</td><td>Thermo</td><td>#4951PLUS-001</td><td>25x75x1mm</td></tr></tbody></table>

visualizando a interiorização imunoreativa do peptídeo relacionado ao gene calcitonina do rato cranial dura mater com imunofluorescência e rastreamento neural

Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing

O objetivo deste estudo foi examinar a distribuição e a origem do peptídeo relacionado ao gene de calcitonina (CGRP)-fibras sensoriais imunoreativas do duracococa craniano utilizando imunofluorescência, reconstrução tridimensional (3D) e técnica de rastreamento retrógrado. Aqui, as fibras nervosas e vasos sanguíneos foram manchados usando imunofluorescência e técnicas histoquímicas com CGRP e fábula fluorescente, respectivamente. A correlação espacial das fibras nervosas e vasos nervosos transmotivos cgrp-immuoreactive dural e vasos sanguíneos foram demonstradas pela reconstrução 3D. Enquanto isso, a origem das fibras nervosas imunoreativas CGRP foram detectadas pela técnica de rastreamento neural com fluorogold (FG) da área ao redor da artéria meningeal média (MMA) na duracaca craniana mater à gânglio triginal (TG) e gânglios de raiz dorsal cervical (C) (DRGs). Além disso, as características químicas dos neurônios rotulados por FG nos TG e DRGs também foram examinadas juntamente com CGRP utilizando imunofluorescências duplas. Aproveitando a amostra transparente de montagem integral e a reconstrução 3D, mostrou-se que as fibras nervosas imunoreativas CGRP e as artérias rotuladas por fálico funcionam juntas ou formando separadamente uma rede neurovascular dural em uma visão 3D, enquanto os neurônios rotulados por FG foram encontrados nos ramos oftálmico, maxilar e mandibular de TG, bem como os IPS C2-3 ao lado da aplicação do rastreador em que alguns dos neurônios rotulados por FG apresentavam expressão CGRP-imunoreactive. Com essas abordagens, demonstramos as características distributivas das fibras nervosas cgrp-imunoreativas ao redor dos vasos sanguíneos na dura-duracaca craniana, bem como a origem dessas fibras nervosas de TG e DRGs. Do ponto de vista da metodologia, pode fornecer uma referência valiosa para a compreensão da complicada estrutura neurovascular da dura mater craniana sob a condição fisiológica ou patológica.

Estrutura neurovascular da dura mater craniana Após a coloração histoquímica imunofluorescente e fluorescente com CGRP e faloidina, as fibras nervosas imunoreativas CGRP e as artérias dural e tecidos conjuntivos foram claramente demonstradas em toda a duraza mater de todo o monte em um padrão 3D(Figura 2C, D,E,F). Mostrou-se que tanto as fibras nervosas espessas quanto as finas CGRP-imunoreactive funcionam em paralelo às a...

Aqui apresentamos um protocolo para visualizar a correlação espacial do peptídeo relacionado ao gene de calcitonina (CGRP)-fibras nervosas imunoreativas e vasos sanguíneos na duracolia craniana usando imunofluorescência e histoquímica fluorescente com CGRP e fábulina, respectivamente. Além disso, a origem dessas fibras nervosas foi retrógrada traçada com um rastreador neural fluorescente.

Visualizando a Interiorização Imunoreativa Do Peptídeo Relacionado ao Gene calcitonina do Rato Cranial Dura Mater com Imunofluorescência e Rastreamento Neural

The aim of this study was to examine the distribution and origin of the calcitonin gene-related peptide (CGRP)-immunoreactive sensory nerve fibers of the ...

Este protocolo pode fornecer uma referência metodológica variável para compreender a complicada estrutura neurovascular da dura mater craniana na condição fisiológica ou patológica. Aproveitando-se de toda a montagem transparente dura mater, a correlação espacial de fibras nervosas imunoreativas dural CGRP e vasos sanguíneos pode ser demonstrada em uma visão 3D. Depois de eutanásia de um rato, transcardialmente perfundiu-o com 100 mililitros de soro fisiológico 0,9% normal seguido por 250 a 300 mililitros de 4% de paraformaldeído em 0,1 tampão molar fosfato.Quando terminar, remova a pele da cabeça e abra o crânio para expor o lado dura e dorsal do cérebro. Disseca a dura gêmea craniana ao longo do tronco cerebral à lâmpada olfativa em um padrão de montagem inteiro. Enxágüe a dura-máter craniana em 0,1 tampão de fosfato molar por cerca de um minuto e incuba-o em uma solução de bloqueio.Transfira o dura mater para o anticorpo anti-CGRP do mouse durante a noite. No dia seguinte, lave a dura mater três vezes em 0,1 tampão de fosfato molar. Incubar o dura mater em uma solução mista de anti-rato de burro Alexa Fluor 488 anticorpo secundário e faloidein 568 em 0.1.Tampão fosfato molar contendo soro de burro 1% normal e 0,5% Triton X-100 por 1,5 horas em temperatura ambiente. Em seguida, lave a dura mater três vezes em tampão de fosfato molar de 0,1, corte as bordas e monte-a em slides de microscópio. Coloque os deslizamentos de cobertura com 50% de glicerina antes da observação.Imagem toda a montagem dura mater com um microscópio fluorescente, em seguida, tirar imagens das fibras nervosas imunoreativas CGRP e vasos sanguíneos rotulados com falitina na dura mater usando um microscópio confocal. Raspe a cabeça do rato com uma navalha elétrica, depois coloque barras de ouvido cegas no rato e coloque-a no dispositivo estereotaxico. Posicione o porta-voz e aplique pomada oftálmica nos olhos.Limpe o lado cirúrgico da pele da cabeça usando 75% de etanol e faça uma incisão ao longo da linha média do couro cabeludo. Remova sem rodeios e tecidos musculares do crânio usando aplicadores de algodão estéril. Faça um pequeno furo usando uma broca de rebarba com uma ponta redonda nos ossos parietal esquerdo e temporal acima da artéria meningeal média.Construa um banco ao redor do buraco com cimento de sílica dental e adicione dois microliters de fluorogold no buraco ao redor da artéria meningeal média com uma microsiringe de 10 microliteres. Cubra o buraco com um pequeno pedaço de esponja hemostática. Coloque um pedaço de filme de parafina no buraco e sele as bordas com cera óssea.Sutura a ferida com fio estéril. Mantenha os ratos em uma área quente até que eles se recuperem completamente. Então devolva os ratos de volta às suas gaiolas.Após sete dias de sobrevivência, perfuse esses ratos com soro fisiológico 0,9% normal seguido de 4% de paraformaldeído em 0,1 tampão de fosfato molar. Disseca o TG e o cervical de um a quatro DRGs, em seguida, corte-os na espessura de 30 micrômetros em um sistema de microtome criostat na direção sagital. E monte as seções em lâminas de vidro revestidas de silano.Circule as seções com uma caneta histoquímica e incuba-as por 30 minutos na solução de bloqueio. Transfira as amostras para a solução de anticorpo anti-fluorogold e camundongo e incubar a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave as seções três vezes em 0,1 tampão molar fosfato.Incubar as seções lavadas em uma solução mista de anti-coelho de burro Alexa Fluor 594 e anti-rato de burro Alexa Fluor 488 anticorpo secundário. Em seguida, lave-os três vezes em 0,1 tampão molar fosfato e aplique deslizamentos de cobertura com 50% de glicerina para observação. Tire imagens dos neurônios rotulados fluorogold em TG e DRGs sob iluminação UV usando um microscópio fluorescente.Em seguida, capture imagens dos neurônios rotulados fluorogold e CGRP em TG e DRGs. Após a coloração histoquímica imunofluorescente e fluorescente com CGRP e faloidina, as fibras nervosas imunoreativas CGRP e a fálice rotulada dural arterioles e tecidos conjuntivos foram claramente visualizadas em todo o monte de duração craniana mater em um padrão 3D. As fibras nervosas imunoreativas CGRP grossas e finas funcionam em paralelo às artérias durais ao redor da parede vascular ou entre os vasos sanguíneos.Sete dias após a aplicação de fluorogold na região da artéria meningeal média e da dura-dura-rato, os neurônios rotulados fluorogold foram detectados em TG e DRGs cervicais no lado ipsilateral da aplicação do rastreador, que foi observado diretamente sob a iluminação UV da microscopia fluorescente. Os neurônios rotulados fluorogold foram encontrados nos três ramos de TG, com maiores concentrações nas divisões oftálmicas e maxilares e com menores concentrações na divisão mandibular. Alguns dos neurônios rotulados por fluorogold também foram observados nos drgs cervicais de dois a três drados.Estas fotografias representativas de imunofluorescências duplas mostram neurônios sensoriais em TG e DRG. Os neurônios rotulados com FG, CGRP e fg e CGRP foram visualizados por dupla imunofluorescência. Ao tentar este protocolo, lembre-se de dissecar completamente a dura-fé cranial e colá-la em um slide em um padrão de montagem inteiro.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Shannonhouse, J., et al. In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios da raiz dorsal intactos. J. Vis. Exp. (2023). O vídeo demonstra uma técnica de imagem de cálcio in vivo para monitorar a atividade neuronal nos gânglios da raiz dorsal (DRG) de um camundongo transgênico. Os neurônios DRG expressam um indicador de cálcio que aumenta a intensidade da fluorescência ao se ligar ao cálcio. Estímulos mecânicos ou térmicos aplicados a...

Imagem de cálcio in vivo de conjuntos neuronais nos gânglios intactos da raiz dorsal de um camundongo

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove. com/v/61742/visualizaizing-the-calcitonin-gene-related-peptide-immunoreactive-innervation-of-the-rat-cranial-dura-mater-with-immunofluorescence-and-neural-tracing'&gt;Wang, J., et al. Visualizando a inervação imunorreativa do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina da dura-máter craniana de ratos com imunofluorescência e rastreamento neural. J. Vis. Exp. (2021). Este vídeo demonstra um método para rastrear as origens dos...

Investigando as origens dos neurônios sensoriais na dura-máter usando microscopia de fluorescência

Imunohistoquímica protocolos são usados ​​para estudar a localização de uma proteína específica na retina. Técnicas de imagem de cálcio são utilizados para estudar a dinâmica de cálcio nas células ganglionares da retina e seus axônios.

Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina

O sistema nervoso entérico (ENS) é uma rede de neurônios e glia localizada na parede intestinal que controla os reflexos intestinais. Este protocolo descreve métodos para registrar a atividade de neurônios entéricos e glia em preparações vivas de ENS usando imagens de Ca2+.

In Situ Ca 2+ Imagem do Sistema Nervoso Entérico

O presente protocolo descreve o modelo de liberação ex vivo do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) e a estratégia para quantificar o efeito de agentes farmacológicos sobre a quantidade de CGRP liberada do sistema trigeminovascular em roedores.

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A espessura das seções teciduais limitou o estudo morfológico da inervação da pele. O presente protocolo descreve uma técnica única de limpeza tecidual para visualizar fibras nervosas cutâneas em seções de tecido espessas de 300 μm sob microscopia confocal.

Demonstrando a inervação da pele cabeluda e glabrous em um padrão 3D usando múltiplas abordagens de coloração fluorescente e limpeza de tecidos

O presente protocolo descreve a confecção de uma grande janela craniana (6 x 3 mm2) usando envoltório de alimentos, silicone transparente e vidro de cobertura. Esta janela craniana permite experiências de imagem de cálcio in vivo de campo largo e de dois fótons no mesmo rato.

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Este protocolo descreve a exposição cirúrgica do gânglio da raiz dorsal (DRG) seguida de GCaMP3 (indicador Ca2+ codificado geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Imagem de Ca2+ dos conjuntos neuronais usando camundongos Pirt-GCaMP3 enquanto se aplica uma variedade de estímulos na pata traseira ipsilateral.

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECI) permitem uma análise robusta em nível populacional da sinalização de neurônios sensoriais. Aqui, desenvolvemos uma nova abordagem que permite a visualização in vivo do GECI da atividade dos neurônios dos gânglios trigeminais de ratos.

In-Vivo Imagem de cálcio de neurônios sensoriais no gânglio trigeminal de ratos

Este estudo apresenta uma manipulação cirúrgica para expor o T-DRG em camundongos anestesiados para imagens de cálcio in vivo , juntamente com registros de ECG síncronos. Este método representa uma ferramenta de ponta para estudar a estimulação elétrica nervosa periférica e as entradas de órgãos viscerais torácicos, bem como suas interações no nível sensorial primário.

Imagem de cálcio dos gânglios da raiz dorsal torácica (DRG) in vivo e registro de ECG para estudar a estimulação de nervos periféricos

Este protocolo descreve imagens de cálcio GCaMP in vivo de neurônios intactos do gânglio do trigêmeo (TG). Esta descrição inclui cirurgia de exposição TG, imagem de microscopia confocal in vivo de neurônios TG, aplicação de estímulos somáticos durante imagens microscópicas de neurônios TG e análise de dados de imagem de cálcio GCaMP in vivo .

In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios trigêmeos intactos

Aprenda a visualizar fibras nervosas imunorreativas ao CGRP e vasos sanguíneos na dura-máter craniana de ratos usando imunofluorescência e rastreamento neural retrógrado. Este método permite análise 3D detalhada das interações neurovasculares.

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