Transplante intramial de hidrogéis injetáveis de carregamento de MSC após infarto do miocárdio em um modelo murino

Este método pode ajudar a abordar questões-chave na terapia cardíaca exacerbada atual, como baixa aplicabilidade à baixa retenção e sobrevivência de células transplantadas em corações infartados. Para resolver essa questão, esse método pode fornecer uma técnica confiável para estudar o transplante intramiocárdico com células-tronco usando hidrogéis injetáveis em um modelo murino, que é uma excelente plataforma para investigar o reparo e regeneração do tecido cardíaco após infarto do miocárdio. A principal vantagem desta técnica é que é um método viável para melhorar a retenção e sobrevivência de células-tronco transplantadas após transplante intramiocárdico usando hidrogéis injetáveis de cobertura de reticulação in-situ.

Esses hidrogéis oferecem diversas oportunidades para a engenharia de tecidos cardíacos, como o fornecimento não apenas de células-tronco, mas também de fatores de crescimento, materiais genéticos e medicamentos para maximizar seu efeito terapêutico em tecidos cardíacos infartados. Demonstrando o procedimento para experimentos in vitro estará Eunmi Lee, uma tecnóloga de pesquisa do meu laboratório. Os tecnólogos de pesquisa de Eun-Hye Park e Eunhwa Seong demonstrarão o procedimento para experimentos in vivo.

Cultive células-tronco mesenquimais, ou MSCs, em uma placa de cultura de 100 milímetros a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Quando as células atingirem 80% de confluência, lave o prato duas vezes com DPBS e incube-as com um mililitro de substituto de tripsina a 37 graus Celsius por três minutos. Em seguida, adicione nove mililitros de meio de cultura às células e centrifugue-as a 500 vezes G por três minutos.

Descarte o sobrenadante resultante. Ressuspenda as células em um mililitro de PBS e mantenha a suspensão celular no gelo. Dilua 10 microlitros de suspensão celular com 10 microlitros de azul de tripano e determine a concentração celular usando um contador de células automatizado.

Ressuspenda as MSCs a uma densidade de uma vez 10 elevado à sétima célula por mililitro e transfira-as para um tubo de um mililitro. Prepare uma solução conjugada de 6,25% GH em PBS e separe-a em dois frascos. Em seguida, misture as soluções de GH com seis microgramas por mililitro de HRP ou peróxido de hidrogênio a 0,07%.

Centrifugar brevemente a suspensão celular a 1000 vezes G e aspirar cuidadosamente o sobrenadante resultante. Em seguida, misture o pellet celular com a solução de GH A. Carregue as MSCs na solução de GH A e na solução de GH B em ambos os lados de uma seringa dupla. Placa de 300 microlitros das soluções combinadas de GH com MSCs a uma densidade final de 5 milhões de células por mililitro em uma lâmina de câmara de oito poços.

Após a formação de hidrogel in situ e subsequente encapsulamento de MSC via reticulação enzimática, adicione 700 microlitros de DMEM contendo 10% de FBS e 1% de solução antibiótica antimicótica. Incube a lâmina a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e substitua o meio de cultura a cada dois ou três dias. Antes da cirurgia, depole o tórax do camundongo usando creme depilatório e esterilize a pele com iodo.

Coloque o mouse em uma mesa de operação e intube-o inserindo um cateter na traqueia para fornecer oxigênio suplementar por meio de ventilação mecânica. Corte suavemente a pele usando uma tesoura cirúrgica. Em seguida, penetre nos músculos intercostais com uma micro tesoura.

Separe a segunda e a terceira costelas esquerdas usando uma sutura de seda 5-O para manter uma cavidade torácica aberta. Ligue cuidadosamente a artéria coronária descendente anterior esquerda usando um porta-agulha com um 8-0 polipropileno e corte a sutura com eletrocautério. Observe uma mudança imediata de cor na parede anterior do ventrículo esquerdo.

Após induzir o infarto do miocárdio, injete 10 microlitros das soluções de GH de carga de MSC em dois pontos diferentes na zona da borda do infarto. Restaure a cavidade torácica aberta e feche os músculos e a pele usando suturas 5-0. Remova o tubo traqueal e coloque o mouse em uma gaiola sob uma lâmpada infravermelha durante a recuperação.

Realize uma ecocardiografia e meça as linhas correspondentes para a parede anterior do VE, parede interna do VE e parede posterior do VE para obter a espessura da parede cardíaca, dimensão da câmara e encurtamento fracionário. Antes do transplante in vivo, a proliferação e a sobrevivência de MSCs em hidragéis de GH foram confirmadas por um ensaio de coloração de células mortas vivas in vitro 3D. Imagens representativas exibiram proliferação suficiente de MSC mostrando redes ramificadas dentro de hidrogéis de GH.

Uma extensa estrutura 3D multicelular de MSCs foi claramente observada no dia 14, indicando que os hidrogéis de GH poderiam fornecer um microambiente adequado para as células encapsuladas. Após a indução do infarto do miocárdio, os hidrogéis de GH com carga de CTM foram transplantados por via intramiocárdica para as áreas peri-infarto. As CTMs e o gel foram adequadamente sustentados na região infartada.

As MSCs foram bem integradas aos hidrogéis de GH. Para verificar os efeitos terapêuticos dos hidrogéis de GH com carga de CTM, as alterações na função e estrutura cardíaca foram avaliadas por ecocardiografia e análise histológica no 28º dia pós-transplante e comparadas entre os diferentes grupos de tratamento. A ecocardiografia representativa mostrou melhora das funções cardíacas, incluindo encurtamento fracionário, fração de ejeção e volume sistólico final no grupo tratado com gel de MSC.

Além disso, a análise histológica exibiu menos fibrose, paredes infartadas mais espessas e menor tamanho de infarto no grupo tratado com gel de MSC do que nos outros grupos, indicando que esse protocolo atenuou significativamente o remodelamento do VE. Usando esta técnica, alcançamos células-tronco de longo prazo e proliferação e levamos a uma melhora significativa na estrutura e função cardíaca após infarto do miocárdio em modelo murino. Essa técnica pode ser estendida para uso em animais de grande porte e para tradução clínica como uma nova estratégia para prevenção de insuficiência cardíaca pós-infarto, proporcionando reparo e regeneração do tecido cardíaco.