Name: Transplante intramial de hidrogéis injetáveis de carregamento de MSC após infarto do miocárdio em um modelo murino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprenda a técnica de transplante intramiocárdico de células-tronco mesenquimais usando hidrogéis de gelatina injetáveis em modelo murino. Este método melhora a retenção e sobrevivência celular para reparação cardíaca após infarto do miocárdio.

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Esta pesquisa é apoiada pelo Programa de Pesquisa em Ciência Básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo Ministério da Educação (NRF-2018R1D1A1A02049346)

Todos os procedimentos de pesquisa animal foram fornecidos de acordo com a Lei de Bem-Estar dos Animais de Laboratório, o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e as Diretrizes e Políticas para Experimentos de Roedores fornecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) na Faculdade de Medicina da Universidade Católica da Coreia.
1. Preparação de MSCs e hidrogéis de gelatina injetáveis
<ol><li>MSCs de cultura em um prato de cultura de 100 mm a 37 °C e 5% DE CO2. Quando o crescimento das MSCs atingir 80% de confluência, lave o prato duas vezes com DPBS e adicione 1 mL de trippsina-substituto a 37 °C por 3 min. NOTA: Os MSCs foram isolados da medula óssea murina após os procedimentos convencionais16, cultivados no Médio De Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de solução antimíctica antibiótico,e utilizado entre a passagem 7\u20129 para este estudo.</li>
	<li>Adicione 9 mL de cultura média e centrífuga a 500 x g por 3 min. Em seguida, descarte o supernaente resultante, resuspenque as células em 1 mL de PBS, e mantenha a suspensão celular no gelo.</li>
	<li>Diluir 10 μL de suspensão celular com 10 μL de azul Trypan e obter a concentração celular usando um contador celular automatizado.</li>
	<li>Resuspend e transfira MSCs para um tubo de 1 mL a uma densidade de 1 x 107 células/mL.</li>
	<li>Prepare uma solução conjugada de 6,25 wt% de GH em PBS e separe em 2 frascos. Em seguida, misture as soluções GH com 6 μg/mL de HRP (solução GH A) ou 0,07 wt% de H2O2 (solução GH B). NOTA: Prepare os conjugados de ácido propiônico gelatin-hidroxifenil (GH) de acordo com os protocolos publicados12,15.<ol>
<li>Mantenha uma razão volumosa de 9:1 da solução conjugada GH para hrp (solução GH solução A) e solução conjugada GH para H2O2 (solução B DE GH), respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Antes de misturar os MSCs com a solução GH A, centrifufique brevemente a suspensão celular a 1.000 x g e aspire cuidadosamente o supernanato resultante. Posteriormente, misture a pelota contendo MSCs com a solução GH A.</li>
</ol>2. In situ MSC-loading e tridimensional cultura in vitro
<ol><li>Solução de carga GH A (contendo MSCs) e solução GH B em ambos os lados de uma seringa dupla. Placa 300 μL das soluções GH combinadas com MSCs a uma densidade final de 5 x 106 células/mL em um slide de câmara de oito poços.</li>
	<li>Após a formação de hidrogel in situ e posterior encapsulamento msc via ligação cruzada enzimática, adicione 700 μL de DMEM contendo 10% de FBS e 1% de solução antimicomolítica.</li>
	<li>Incubar o slide a 37 °C e 5% de CO2 e substituir o meio de cultura a cada 2\u20123 dias.</li>
</ol>3. Confirmação da proliferação in vitro e sobrevivência de MSCs dentro de hidrogéis GH
<ol><li>Para determinar a viabilidade de MSCs cultivados em 3D dentro de hidrogéis GH, use um ensaio de coloração de células vivas/mortas após o tempo de incubação predeterminado.</li>
	<li>Após a incubação dos MSCs encapsulados em hidrogéis GH por 3, 5, 7 ou 14 dias, aspire o médio e lave o poço duas vezes com PBS.</li>
	<li>Prepare uma solução de coloração contendo 5 μL de calcein AM e 20 μL de ethidium homodimer-1 (EthD-1) em 10 mL de DPBS.</li>
	<li>Adicione 200 μL da solução de coloração ao poço e incubar por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspire a solução de coloração e lave o poço duas vezes com PBS.</li>
	<li>Separe cuidadosamente a câmara do slide e coloque uma tampa completa sobre os hidrogéis GH. Use uma microscopia confocal para visualizar o grau de proliferação e alterações morfológicas dos MSCs encapsulados. NOTA: As imagens fluorescentes foram adquiridas sob ampliação de 200x e imagens nos comprimentos de onda de excitação/emissão de 470/540 nm para calcein e 516/607 nm para EthD-1.</li>
</ol>4. Indução do infarto do miocárdio em camundongos
<ol><li>Anestesize camundongos C57BL/6 masculinos de 7 semanas de idade (20\u201222 g) com injeção intraperitoneal de uma mistura de Zoletil (30 mg/kg) e Rompun (10 mg/kg) em soro fisiológico.</li>
	<li>Antes da cirurgia, depilar o peito do rato usando creme de depilação e esterilizar a pele com iodo.</li>
	<li>Coloque o mouse sobre uma mesa de operação e entubar inserindo um cateter na traqueia para fornecer oxigênio suplementar através de ventilação mecânica.</li>
	<li>Corte suavemente a pele usando uma tesoura cirúrgica e, em seguida, penetre os músculos intercostais por micro tesoura. Separe as costelas esquerdas 2ª e 3ª usando uma sutura de seda 5-0 para manter uma cavidade torácica aberta.</li>
	<li>Ligar cuidadosamente a artéria coronária anterior esquerda (LAD) usando um suporte de agulha com um 8-0 sutura de polipropileno e corte a sutura usando eletrocauteria.</li>
	<li>Observe uma mudança de cor imediata na parede ventricular esquerda anterior.</li>
</ol>5. Transplante intramyocárdio de hidrogéis GH de carregamento de MSC
<ol><li>Depois de induzir o infarto do miocárdio por ligadura LAD, injete 10 μL de soluções GH de carregamento MSC em dois pontos diferentes na zona de fronteira infarto (total: 2 x 105 MSCs/20 μL) usando uma seringa dupla equipada com uma agulha de 26G.<ol>
<li>Seguindo o mesmo procedimento descrito na Etapa 1, prepare e transfira as soluções GH de carregamento de MSC em uma seringa dupla. NOTA: Para avaliar o engrafamento dos hidrogéis GH de carregamento de MSC dentro da área infarto, os MSCs e os conjugados GH foram pré-rotulados com PHK26 e isoticianato de fluoresceína (FITC), respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Restaure a cavidade torácica aberta e feche os músculos e a pele usando suturas 5-0. NOTA: Antes do fechamento do peito, remova o ar usando uma seringa de cateter.</li>
	<li>Remova o tubo traqueal e coloque o mouse em uma gaiola sob uma lâmpada infravermelha durante a recuperação.</li>
	<li>Para analgesia pós-operatória, administre injeções subcutâneas de Cetoprofeno (5 mg/kg por dia) por um mínimo de 72 h. Todos os camundongos devem ser monitorados de perto por um tempo adequado para garantir a recuperação adequada após os procedimentos cirúrgicos, bem como o tratamento adequado da dor.</li>
</ol>6. Ecocardiografia
<ol><li>Quatro semanas após o transplante, inicialmente anestesiar o camundongo com 5% de isoflurane e, em seguida, ajustar a concentração de isoflurane para 1%.</li>
	<li>Despito o baú usando creme de depilação e coloque o mouse em uma almofada de aquecimento. Aplique gel transdutor de ultrassom no peito.</li>
	<li>Adquira vistas bidimensionais de eixo curto e registre traçados no modo M ao nível do músculo papilar. NOTA: Coloque um transdutor de matriz linear (7\u201215 MHz) na linha parasternal esquerda e visualize as estruturas anatômicas.</li>
	<li>Meça linhas correspondentes para LVAW, LVID e LVPW para obter espessura da parede cardíaca, dimensão da câmara e encurtamento fracionado. NOTA: Compare a função cardíaca, incluindo a fração de ejeção (EF), encurtamento fracionado (FS) e volume sistólico final (ESV) ao nível do músculo papilar para garantir a avaliação adequada no mesmo local anatômico.</li>
</ol>7. Avaliação histológica
<ol><li>No tempo predeterminado após o transplante de hidrogéis GH carregados de MSC no coração infartado, eutanize o rato em uma câmara de CO2 e colete o coração para análise histológica15.</li>
	<li>Para hematoxilina e eosina (H&E) e coloração tricrática (MT) de Masson, fixar os tecidos cardíacos dissecados em 4% de paraformaldeído (PFA) e incorporar em parafina. Em seguida, corte os blocos cardíacos incorporados à parafina em seções seriais de 4 μm usando um microtome e colora as seções com mancha DE MT de acordo com os protocolos padrão17.</li>
	<li>Adquira imagens em um scanner de slides a 20x de ampliação e calcule o tamanho do infarto dos grupos de tratamento. Tamanho do infarto (%) = circunferência total infarto / circunferência total de LV x 100</li>
	<li>Calcule ambas as circunferências por medição de comprimento médio. Para circunferências da linha média LV, meça os comprimentos da linha central entre as superfícies endocárdia e epicoardial. Para circunferências infartos midline, meça os comprimentos do infarto, incluindo mais de 50 % de toda a espessura do miocárdio18. NOTA: Todas as análises de imagem foram realizadas por meio do software ImageJ.</li>
	<li>Meça a espessura da parede da cicatriz nos níveis musculares papilares.</li>
	<li>Calcule a fração da área de colágeno. Área de colágeno (%) = área total de fibrose intersticial/área de miócito x 100</li>
</ol>

<ol><li>Jhund, P. S., McMurray, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+failure+after+acute+myocardial+infarction%3A+a+lost+battle+in+the+war+on+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart failure after acute myocardial infarction: a lost battle in the war on heart failure.</a> Circulation. 118 (20), 2019-2021 (2008).</li>
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<li>Kim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonsil-derived+mesenchymal+stem+cell-embedded+in+situ+crosslinkable+gelatin+hydrogel+therapy+recovers+postmenopausal+osteoporosis+through+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tonsil-derived mesenchymal stem cell-embedded in situ crosslinkable gelatin hydrogel therapy recovers postmenopausal osteoporosis through bone regeneration.</a> PLoS One. 13 (7), 0200111(2018).</li>
<li>Kim, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC-Encapsulating+in+situ+Cross-Linkable+Gelatin+Hydrogels+To+Promote+Myocardial+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Bio+Materials%22%5BJournal%5D)">MSC-Encapsulating in situ Cross-Linkable Gelatin Hydrogels To Promote Myocardial Repair.</a> ACS Applied Bio Materials. 3 (3), 1646-1655 (2020).</li>
<li>Meirelles Lda, S., Nardi, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+marrow-derived+mesenchymal+stem+cell%3A+isolation%2C+in+vitro+expansion%2C+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion, and characterization.</a> Br J Haematol. 123 (4), 702-711 (2003).</li>
<li>Ojha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+structural+and+functional+changes+in+the+myocardium+following+focal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), 2435-2443 (2008).</li>
<li>Takagawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarct+size+measurement+in+the+mouse+chronic+infarction+model%3A+comparison+of+area-+and+length-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches.</a> Journal of Applied Physiology. 102 (6), 2104-2111 (2007).</li>
<li>Terrovitis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Quantification+and+Optimization+of+Acute+Cell+Retention+by+In+vivo+Positron+Emission+Tomography+After+Intramyocardial+Cardiac-Derived+Stem+Cell+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery.</a> Journal of the American College of Cardiology. 54 (17), 1619-1626 (2009).</li>
<li>Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Therapy+for+Cardiovascular+Disease%3A+A+Comparison+of+Methods+of+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Cell Therapy for Cardiovascular Disease: A Comparison of Methods of Delivery.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (2), 177-181 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar com este trabalho.

Os hidrogéis GH injetáveis têm grande potencial para aplicações in vivo devido à sua capacidade de incorporar homogêneo agentes terapêuticos in situ. Além disso, suas propriedades físicas e bioquímicas podem ser facilmente manipuladas com base em requisitos dependentes de doenças. Nesse sentido, hidrogéis injetáveis têm sido propostos para abordar as principais limitações na atual terapia de células-tronco cardíacas dificultadas pela má sobrevida e retenção celular (ou seja, < 10% dentro de 24h após o transplante) no cor...

A terapia com células-tronco cardíacas emergiu como uma abordagem potencial para reparação e regeneração do miocárdio1,2. Apesar dos resultados positivos recentes em modelos animais e ensaios clínicos, a aplicação de terapia baseada em células-tronco para reparação do miocárdio é limitada devido à baixa retenção e má sobrevivência das células injetadas nos tecidos cardíacos infartados3,4. Como resultado, o uso de engenharia de tecidos baseados em células, incluindo biomateriais injetáveis5, patches cardíacos6e folhas de células7, tem sido intensamente estudado para melhorar a retenção e integração celular dentro do miocárdio hospedeiro.
Entre as várias abordagens potenciais para a reparação de tecidos cardíacos bioengenharia, hidrânis injetáveis combinados com tipos de células apropriadas, como células-tronco mesenquimais (MSCs), células-tronco embrionárias (ESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), são uma opção atraente para efetivamente entregar células nas regiões miocárdias8,9. A gelatina, um polímero natural bem conhecido, pode ser usada como uma matriz injetável devido à sua grande biocompatibilidade, biodegradabilidade considerável e imunogenicidade reduzida quando comparada com uma ampla gama de biomaterias usados em aplicações biomédicas. Embora as plataformas injetáveis à base de gelatina tenham grande potencial, sua aplicabilidade in vivo permanece limitada com base em sua baixa rigidez mecânica e fácil degradabilidade no ambiente fisiológico.
Para superar essas limitações, foi proposto um design novo e simples de hidrogéis à base de gelatina, compostos por ácido propiônico hidroxifenil. Os conjugados de ácido propiônico gelatino-hidroxifenil (GH) podem ser interligados in situ na presença de uma enzima, peroxidase de rabanete (HRP) e, posteriormente, encapsular várias drogas, biomoléculas ou células dentro do hidrogel, sugerindo grande potencial nas aplicações de engenharia de tecidos10,11,12,13,14. Além disso, recentemente investigamos os efeitos terapêuticos dos hidrogéis GH contendo MSCs encapsulados e demonstramos seu uso em reparo e regeneração cardíaca bem-sucedido após a MI em um modelo murino15. Neste protocolo, descrevemos uma técnica simples para o encapsulamento e a proliferação tridimensional in vitro (3D) de MSCs dentro de hidrogéis GH. Também introduzimos um procedimento cirúrgico projetado para gerar um modelo mi murina através da ligadura da artéria coronária e transplante intramocárdio de hidrogéis GH que carregam MSC no coração infartado.

<table><tbody><tr><td>4 % paraformaldeído (PFA)</td><td>Intron</td><td>IBS-BP031-2</td><td></td></tr><tr><td>5-0 sutura de seda</td><td>AILEE</td><td>SK534</td><td></td></tr><tr><td>8-0 sutura de polipropileno</td><td>ETHICON</td><td>M8732H</td><td></td></tr><tr><td>Corrediça de câmara de 8 poços</td><td>Nunc LAB-TEK</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>Cateter Angiocath Plus (22GA)</td><td>BD Angiocath Plus</td><td>REF382423</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-antimiocóico</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>GYROGEN</td><td>1582MGR</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula</td><td>MARIENFELD</td><td>101242</td><td></td></tr><tr><td>Deluxe Kit de cauterização de alta temperatura</td><td>Bovie</td><td>QTY1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td></td><td></td><td></td>dupla</tr><tr><td>EOSIN</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td></td></tr> HT110116 <tr><td>Etanol</td><td>EMSURE</td><td>K49350783 739</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Fechtner pinça conjuntiva titânio</td><td>WORLD PRECISISON INSTRUMENTS</td><td>WP1820</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína isômero de isotiocianato I (FITC)</td> <td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F7250</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>HEBU</td><td>HB0458</td><td></td></tr><tr><td>Creme de depilação</td><td>Ildong Pharmaceutical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>Stoelting</td><td>50300</td><td>Homeothermic Blanket System</td></tr><tr><td></td><td></td><td>50301</td><td>Almofada de aquecimento de substituição para 50300 (10 x 12,5 cm)</td></tr> <tr><td>Hematoxilina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>HHS80</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de rábano (HRP; 250-330 U / mg)</td> <td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P8375</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio (H2 O2; 30% em peso em H2O)</td> <td>SIGMA-ALDRICH</td><td>216763</td><td></td></tr> Kit de coloração de células vivas / <tr><td>mortas da Green Green Pharmaceutical</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>R37601</td><td></td></tr><tr><td>Ventilador mecânico</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro centrifugador</td><td>HANIL</td><td>Micro 12</td><td></td></tr><tr><td>Micro porta-agulhas</td><td>KASCO</td><td>37-1452</td><td></td></tr><tr><td>Micro tesoura</td><td>HEBU</td><td>HB7381</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>OLYMPUS</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloração MT</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>HT1079-1SET</td><td>Weigert& rsquo; s solução</td></tr><tr><td></td><td></td> de hematoxilina de ferro <td>HT15-1KT</td><td>Kit de coloração tricrômica (Masson) Parafina</td></tr><tr><td></td><td>LK LABKOREA</td><td>H06-660-107</td><td></td></tr><tr><td>Tampão PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloração PHK26</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>MINI26</td><td></td></tr><tr><td>Scanner de lâminas</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>HEBU</td><td>HB7454</td><td></td></tr><tr><td>Fita cirúrgica</td><td>3M micopore</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>de tecido</td><td>Scilab Korea</td><td>Cas3003</td><td></td></tr><tr><td>Gel transdutor</td><td>SUNGHEUNG</td><td>SH102</td><td></td></tr><tr><td>Trout-Barraquer porta-agulha curvo</td><td>KASCO</td><td>50-3710c</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de ultrassom</td><td>Philips</td><td>Affiniti 50</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>JUNSEI</td><td>Rolamento 25175-0430</td><td></td></tr></tbody></table>

transplante intramial de hidrogéis injetáveis de carregamento de msc após infarto do miocárdio em um modelo murino

Intramyocardial Transplantation of MSC-Loading Injectable Hydrogels after Myocardial Infarction in a Murine Model

Um dos principais problemas enfrentados pelas atuais terapias de células-tronco cardíacas para prevenir a insuficiência cardíaca pós-infarto é a baixa retenção e as taxas de sobrevivência das células transplantadas dentro do miocárdio ferido, limitando sua eficácia terapêutica. Recentemente, o uso de biomateriais de andaimes ganhou atenção para melhorar e maximizar a terapia com células-tronco. O objetivo deste protocolo é introduzir uma técnica simples e simples para transplantar células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (MSCs) utilizando hidrogéis de ácido propínico hidroxifenil injetável (GH); os hidrogéis são favoráveis como uma plataforma de entrega de células para aplicações de engenharia de tecidos cardíacos devido à sua capacidade de estar intercingo in situ e alta biocompatibilidade. Apresentamos um método simples para fabricar hidrogéis GH de carregamento de MSC (MSC/hidrogéis) e avaliar sua sobrevivência e proliferação na cultura in vitro tridimensional (3D). Além disso, demonstramos uma técnica para transplante intramialárdio de MSC/hidrogéis em camundongos, descrevendo um procedimento cirúrgico para induzir o infarto do miocárdio (MI) através da ligadura da artéria coronária descendente anterior (LAD) e posterior transplante de MSC/hidrogéis.

Para efetivamente fornecer MSCs ao miocárdio infartado, foram utilizados neste protocolo o carregamento de MSC em hidrogéis transfronteiriços descritos na Figura 1. Antes do transplante in vivo, a proliferação e sobrevivência de MSCs em hidrogéis GH foram confirmadas por um ensaio de coloração de células mortas/in vitro 3D (ao vivo: verde; morto: vermelho). Como mostrado na Figura 2,imagens representativas exibiram proliferação suficiente de MSCs, mostrando rede...

A terapia baseada em células-tronco emergiu como uma estratégia eficiente para reparar tecidos cardíacos feridos após o infarto do miocárdio. Fornecemos uma aplicação in vivo ideal para transplante de células-tronco usando hidrogéis de gelatina que são capazes de ser enzimaticamente intercessos.

Transplante intramial de hidrogéis injetáveis de carregamento de MSC após infarto do miocárdio em um modelo murino

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of ...

Este método pode ajudar a abordar questões-chave na terapia cardíaca exacerbada atual, como baixa aplicabilidade à baixa retenção e sobrevivência de células transplantadas em corações infartados. Para resolver essa questão, esse método pode fornecer uma técnica confiável para estudar o transplante intramiocárdico com células-tronco usando hidrogéis injetáveis em um modelo murino, que é uma excelente plataforma para investigar o reparo e regeneração do tecido cardíaco após infarto do miocárdio. A principal vantagem desta técnica é que é um método viável para melhorar a retenção e sobrevivência de células-tronco transplantadas após transplante intramiocárdico usando hidrogéis injetáveis de cobertura de reticulação in-situ.Esses hidrogéis oferecem diversas oportunidades para a engenharia de tecidos cardíacos, como o fornecimento não apenas de células-tronco, mas também de fatores de crescimento, materiais genéticos e medicamentos para maximizar seu efeito terapêutico em tecidos cardíacos infartados. Demonstrando o procedimento para experimentos in vitro estará Eunmi Lee, uma tecnóloga de pesquisa do meu laboratório. Os tecnólogos de pesquisa de Eun-Hye Park e Eunhwa Seong demonstrarão o procedimento para experimentos in vivo.Cultive células-tronco mesenquimais, ou MSCs, em uma placa de cultura de 100 milímetros a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Quando as células atingirem 80% de confluência, lave o prato duas vezes com DPBS e incube-as com um mililitro de substituto de tripsina a 37 graus Celsius por três minutos. Em seguida, adicione nove mililitros de meio de cultura às células e centrifugue-as a 500 vezes G por três minutos.Descarte o sobrenadante resultante. Ressuspenda as células em um mililitro de PBS e mantenha a suspensão celular no gelo. Dilua 10 microlitros de suspensão celular com 10 microlitros de azul de tripano e determine a concentração celular usando um contador de células automatizado.Ressuspenda as MSCs a uma densidade de uma vez 10 elevado à sétima célula por mililitro e transfira-as para um tubo de um mililitro. Prepare uma solução conjugada de 6,25% GH em PBS e separe-a em dois frascos. Em seguida, misture as soluções de GH com seis microgramas por mililitro de HRP ou peróxido de hidrogênio a 0,07%.Centrifugar brevemente a suspensão celular a 1000 vezes G e aspirar cuidadosamente o sobrenadante resultante. Em seguida, misture o pellet celular com a solução de GH A. Carregue as MSCs na solução de GH A e na solução de GH B em ambos os lados de uma seringa dupla. Placa de 300 microlitros das soluções combinadas de GH com MSCs a uma densidade final de 5 milhões de células por mililitro em uma lâmina de câmara de oito poços.Após a formação de hidrogel in situ e subsequente encapsulamento de MSC via reticulação enzimática, adicione 700 microlitros de DMEM contendo 10% de FBS e 1% de solução antibiótica antimicótica. Incube a lâmina a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e substitua o meio de cultura a cada dois ou três dias. Antes da cirurgia, depole o tórax do camundongo usando creme depilatório e esterilize a pele com iodo.Coloque o mouse em uma mesa de operação e intube-o inserindo um cateter na traqueia para fornecer oxigênio suplementar por meio de ventilação mecânica. Corte suavemente a pele usando uma tesoura cirúrgica. Em seguida, penetre nos músculos intercostais com uma micro tesoura.Separe a segunda e a terceira costelas esquerdas usando uma sutura de seda 5-O para manter uma cavidade torácica aberta. Ligue cuidadosamente a artéria coronária descendente anterior esquerda usando um porta-agulha com um 8-0 polipropileno e corte a sutura com eletrocautério. Observe uma mudança imediata de cor na parede anterior do ventrículo esquerdo.Após induzir o infarto do miocárdio, injete 10 microlitros das soluções de GH de carga de MSC em dois pontos diferentes na zona da borda do infarto. Restaure a cavidade torácica aberta e feche os músculos e a pele usando suturas 5-0. Remova o tubo traqueal e coloque o mouse em uma gaiola sob uma lâmpada infravermelha durante a recuperação.Realize uma ecocardiografia e meça as linhas correspondentes para a parede anterior do VE, parede interna do VE e parede posterior do VE para obter a espessura da parede cardíaca, dimensão da câmara e encurtamento fracionário. Antes do transplante in vivo, a proliferação e a sobrevivência de MSCs em hidragéis de GH foram confirmadas por um ensaio de coloração de células mortas vivas in vitro 3D. Imagens representativas exibiram proliferação suficiente de MSC mostrando redes ramificadas dentro de hidrogéis de GH.Uma extensa estrutura 3D multicelular de MSCs foi claramente observada no dia 14, indicando que os hidrogéis de GH poderiam fornecer um microambiente adequado para as células encapsuladas. Após a indução do infarto do miocárdio, os hidrogéis de GH com carga de CTM foram transplantados por via intramiocárdica para as áreas peri-infarto. As CTMs e o gel foram adequadamente sustentados na região infartada.As MSCs foram bem integradas aos hidrogéis de GH. Para verificar os efeitos terapêuticos dos hidrogéis de GH com carga de CTM, as alterações na função e estrutura cardíaca foram avaliadas por ecocardiografia e análise histológica no 28º dia pós-transplante e comparadas entre os diferentes grupos de tratamento. A ecocardiografia representativa mostrou melhora das funções cardíacas, incluindo encurtamento fracionário, fração de ejeção e volume sistólico final no grupo tratado com gel de MSC.Além disso, a análise histológica exibiu menos fibrose, paredes infartadas mais espessas e menor tamanho de infarto no grupo tratado com gel de MSC do que nos outros grupos, indicando que esse protocolo atenuou significativamente o remodelamento do VE. Usando esta técnica, alcançamos células-tronco de longo prazo e proliferação e levamos a uma melhora significativa na estrutura e função cardíaca após infarto do miocárdio em modelo murino. Essa técnica pode ser estendida para uso em animais de grande porte e para tradução clínica como uma nova estratégia para prevenção de insuficiência cardíaca pós-infarto, proporcionando reparo e regeneração do tecido cardíaco.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo demonstra como usar um modelo rápido e confiável para o estudo de processos Pathobiological e fisiopatológicas da isquemia miocárdica.

LAD Ligadura: Um Modelo murino de Infarto do Miocárdio

Entrega célula intramio em modelos murinos de doenças cardiovasculares, como a hipertensão ou o enfarte do miocárdio, é amplamente utilizado para testar o potencial terapêutico de diferentes tipos celulares em estudos de regeneração. Portanto, uma descrição detalhada e uma visualização clara deste procedimento cirúrgico ajudará a definir os limites e as vantagens das análises terapêuticas celulares cardiovasculares em pequenos roedores.

Entrega celular intramiocárdico: Observações em murino Corações

Injeção intramiocárdica percutânea guiada por ecocardiografia representa uma modalidade eficiente, confiável e targetable para a entrega de agentes de transferência de genes ou células no coração murino. Seguindo os passos descritos neste protocolo, o operador pode rapidamente tornar-se competente nessa técnica versátil, minimamente invasiva.

Guiada por ultra-som transtorácica intramiocárdico Injection em Ratos

Este protocolo visa aliviar a limitação do enxerto celular deficiente para o tratamento de infartos do miocárdio com células-tronco por meio do uso de um sistema de hidrogel e uma cola à base de fibrina. Com essa abordagem, o contato célula a tecido pós-infarto pode ser mantido, aumentando o potencial terapêutico de agentes benéficos no local da lesão.

Um hidrogel Construir e fibrina à base de cola Approach to Deliver Therapeutics em um Infarto do Miocárdio modelo murino.

Murino estudos em modelos de inflamação do cólon têm demonstrado que uma pequena porcentagem (1-5%) de células-tronco mesenquimais (MSC) injetada por via intravenosa ou intraperitonealmente home ao cólon inflamado1,2. Este estudo mostra que guiada por ultra-som intracardíacos injeções de MSCs resultam em aumentada localização até o intestino.

Guiada por ultra-som intracardíaca injeção de células-tronco mesenquimais humanas para aumentar Homing para o intestino para uso em modelos murino de doenças intestinais inflamatórias Experimental

Neste protocolo, podemos demonstrar e elaborar sobre como usar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos para diferenciação e purificação de cardiomiócitos, e ainda, sobre como melhorar sua eficiência de transplante com inibidor de proteína quinase associada a Rho pré-tratamento em um modelo de infarto do miocárdio do camundongo.

Melhorar o Engraftment de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por uma inibição transitória da atividade da Rho kinase

Buscamos estabelecer um modelo suíno de insuficiência cardíaca induzido pelo bloqueio da artéria circunflexo esquerda e ritmo rápido para testar o efeito e a segurança da administração intramiocárdia de células-tronco para terapias baseadas em células.

Estabelecendo um modelo suíno de insuficiência cardíaca pós-miocárdio para tratamento de células-tronco

As células-hastes são continuamente investigadas como tratamentos potenciais para indivíduos com danos do miocárdio, no entanto, sua diminuição da viabilidade e retenção dentro do tecido lesionado pode afetar sua eficácia a longo prazo. Neste manuscrito descrevemos um método alternativo para a entrega de células-tronco em um modelo murino de lesão de reperfusão de isquemia.

Entrega intramiocárdica atrasada de células-tronco após lesão de reperfusão de Isquemia em um modelo murino

Este protocolo visa transplantar um patch bioimpresso 3D no epicárdio de camundongos infartados modelando insuficiência cardíaca. Inclui detalhes sobre anestesia, abertura do tórax cirúrgico, ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD) e aplicação de um patch bioimpresso na área infarto do coração.

Transplante de um Patch Bioimpresso 3D em um modelo murino de infarto do miocárdio

A entrega celular guiada por ultrassom ao redor do local do infarto do miocárdio em camundongos é uma maneira segura, eficaz e conveniente de transplante de células.

Implante de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Ultrassom em Camundongos Infartados do Miocárdio

Este artigo detalha um protocolo otimizado para injeções intramiocárdicas guiadas por ecocardiografia em modelos de infarto do miocárdio em ratos usando uma agulha de 29 G x 88 mm. Essa técnica garante a administração robusta, precisa e reprodutível de agentes terapêuticos diretamente na zona peri-infarto.

Injeção guiada por ecocardiografia para entrega de células-tronco intramiocárdicas direcionadas e confiáveis em um modelo de infarto do miocárdio em ratos

Aprenda a técnica de transplante intramiocárdico de células-tronco mesenquimais usando hidrogéis de gelatina injetáveis em modelo murino. Este método melhora a retenção e sobrevivência celular para reparação cardíaca após infarto do miocárdio.

Transplante intramial de hidrogéis injetáveis de carregamento de MSC após infarto do miocárdio em um modelo murino

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