Fracionamento de fluxo de fluxo assimétrico para dimensionamento de nanopartículas de ouro em suspensão

O uso de fracionamento de fluxo de fluxo assimétrico em combinação com calibração de tamanho externo é uma ferramenta poderosa para determinar com precisão a distribuição de tamanho de nanopartículas de ouro em suspensão. O AF4 cobre toda a faixa de tamanho, de um a 1000 nanômetros. É independente da composição da amostra dos constituintes da amostra e pode ser aplicado até mesmo a amostras pouco dispersas e complexas.

A beleza do AF4 é sua ampla gama de aplicações, que abrange não apenas nanopartículas de diferentes naturezas e tamanhos, mas também inclui proteínas, vírus ou macromoléculas sintéticas ou naturais. Comece voticando 50 miligramas por litro de um padrão arbitrário de tamanho de nanopartícula de ouro por dois minutos antes de diluir o padrão para uma proporção de um para quatro com água ultrapura. Em seguida, vórtice a solução diluída por mais dois minutos para obter uma suspensão homogeneizada.

Após a limpeza do sistema, abra o cartucho AF4 para permitir a substituição da membrana AF4. Enxágue a nova membrana com UPW e remonte o cartucho. Em seguida, reconecte o cartucho ao sistema AF4-UV-vis.

Lave o sistema AF4-UV-vis limpo com eluente filtrado e desgaseificado por pelo menos 30 minutos, aplicando uma taxa de fluxo de ponta de um mililitro por minuto, uma taxa de fluxo de foco de um mililitro por minuto e uma taxa de fluxo cruzado de 1.5 mililitros por minuto, para equilibrar a membrana, estabilizar o sistema e verificar se há possíveis vazamentos. A pressão do sistema deve atingir um nível constante entre quatro a 12 bar. Para qualificar o sistema AF4-UV-vis determinando a recuperação de massa e a variação do tempo de retenção usando um padrão arbitrário de tamanho de nanopartículas de ouro, execute uma injeção direta sem a aplicação de uma força de separação.

Em seguida, execute uma corrida de fracionamento com a aplicação de uma força de separação. Para preparar padrões de tamanho de nanopartículas de ouro para a calibração de tamanho externo, vórtice todos os padrões de tamanho de nanopartículas de ouro de 50 miligramas por litro por dois minutos e diluir cada amostra respectiva para análise em água ultrapura na proporção de um para quatro. Quando os padrões de tamanho forem preparados, na guia do método FFF, defina a taxa de fluxo do detector para 500 microlitros por minuto, a taxa de fluxo de injeção para 500 microlitros por minuto e o tempo de injeção para 0,1 minutos.

Defina uma duração de eluição de oito minutos sem força de separação definida e injete 10 microlitros do primeiro padrão no sistema. Quando todos os padrões de tamanho tiverem sido medidos, injete 50 microlitros do primeiro padrão no sistema. Defina a vazão do detector para 500 microlitros por minuto.

Defina o atraso para dois minutos, a vazão de injeção para 200 microlitros por minuto por cinco minutos e o tempo de transição para 0,2 minutos. A taxa de fluxo de foco será calculada automaticamente. Defina a duração da eluição para 60 minutos e a taxa de fluxo cruzado para um mililitro por minuto.

Este método AF4 usa uma taxa de fluxo cruzado constante que é seguida por um decaimento linear ao longo de 10 minutos até zero microlitros por minuto. Defina a etapa de enxágue de nove minutos com uma taxa de fluxo de ponta de 500 microlitros por minuto. Quando todos os padrões de tamanho de nanopartículas de ouro tiverem sido fracionados, prepare a amostra de nanopartículas de ouro desconhecida e execute uma medição de injeção direta e fracionamento da amostra de nanopartículas de ouro desconhecida, conforme demonstrado.

Para analisar os dados, importe os arquivos de dados para o software do sistema. Exiba as medições na guia de visão geral e selecione o sinal do detector UV-vis na lista de detectores. Defina uma região de interesse e uma linha de base para cada medição, ajustando o sinal e a visualização da linha de base conforme necessário.

Use a caixa de ferramentas de processamento de sinal para suavizar quaisquer sinais ruidosos e use a função atribuir parâmetros de processamento a outros ensaios para permitir que os parâmetros sejam alocados a outras medições. Para realizar um cálculo de recuperação de massa, abra as medições de injeção direta e os dados de fracionamento. Insira uma calibração de injeção direta e selecione as respectivas medições de injeção direta na visualização de configurações de calibração de injeção direta.

O volume de injeção e a concentração da amostra serão usados para correlacionar a área do pico com a quantidade injetada. Em seguida, use a função atribuir às predefinições de partículas selecionadas para atribuir a função de calibração obtida às respectivas medições de fracionamento. Em seguida, use a equação para calcular a recuperação de massa de nanopartículas de ouro comparando a área sob os respectivos picos UV-vis das medições de fracionamento e injeção direta.

Para exibir os resultados, abra o cálculo de resultados quantitativos. Uma concentração de massa com base na área do pico será apresentada. A recuperação de massa pode ser obtida comparando este valor com a concentração injetada.

Na guia tamanho de partícula na janela de calibração do tamanho de partícula, clique em cada medição apropriada na tabela selecionar referências para calibração para selecionar todas as execuções de calibração. As medidas serão exibidas em uma tabela à medida que forem selecionadas. Insira o raio hidrodinâmico para todas as medições de calibração.

A função e a equação serão exibidas na janela da função de calibração do tamanho das partículas. Para atribuir a função de calibração às medições da amostra de nanopartículas de ouro desconhecida, selecione os respectivos fracionamentos na lista de seleção de execuções para atribuição e abra um cálculo de distribuição de tamanho de partícula para exibir os resultados. O tamanho calculado será mostrado na janela de distribuição de tamanho, rotulado para o pico máximo.

E a calibração de tamanho de partícula criada anteriormente será listada como a calibração para as medições de amostra de nanopartículas de ouro desconhecidas. Para calcular a média de todas as medições de uma amostra, marque a caixa de seleção de sinais médios para amostra. O resultado será listado no rótulo de pico máximo.

Aqui, é mostrada uma sobreposição representativa dos padrões de tamanho de nanopartículas de ouro fracionadas por AF4 e detectadas por espectroscopia UV-vis da absorbância das partículas em um comprimento de onda de 532 nanômetros. O desvio padrão relativo de todos os tempos de retenção para cada nanopartícula em seu respectivo pico máximo de espectroscopia UV-vis obtido a partir de medições triplicadas foi inferior a 1,1%Uma análise de regressão linear desses dados resultou em uma função de calibração linear com um coeficiente de correlação ao quadrado, R ao quadrado, de 0,9958. Quando nove fractogramas de espectroscopia AF4-UV-vis foram obtidos a partir de amostras de nanopartículas de ouro desconhecidas, o desvio padrão relativo dos respectivos tempos de retenção foi significativamente baixo, variando entre 0,1 e 0,5%Usando a função de calibração de tamanho de partícula obtida a partir do fracionamento dos padrões de tamanho de nanopartículas de ouro e correlacionando esses dados com os tempos de retenção obtidos da amostra de nanopartículas de ouro desconhecida no pico máximo de espectroscopia UV-vis, um raio hidrodinâmico médio geral pode ser calculado.

Além disso, uma recuperação de massa razoável pode ser obtida, indicando que não há aglomeração ou dissolução significativa das amostras de nanopartículas de ouro ou adsorção considerável das partículas na superfície da membrana. Ao usar uma calibração de tamanho externo e análise AF4, é de extrema importância que o mesmo método AF4 seja aplicado de forma consistente a todos os padrões de tamanho e à própria amostra. O AF4 permite que os pesquisadores entendam melhor as propriedades de suas amostras de nanopartículas.

É, portanto, uma importante ferramenta de controle de qualidade que, em última análise, ajuda a melhorar a eficácia dos produtos nano-habilitados.