Quantificando os efeitos dos antimicrobianos na arquitetura de biofilme in vitro usando o software COMSTAT

A importância deste protocolo é que ele oferece uma estrutura simples e reprodutível para quantificar estruturas de biofilme in vitro sob diferentes condições antimicrobianas. A principal vantagem dessa técnica é que ela ajuda a eliminar variações subjetivas associadas à operação manual do COMSTAT, o que acaba facilitando a padronização e a transparência dos experimentos entre os centros de pesquisa. Para obter imagens das culturas de Pseudomonas aeruginosa, coloque a placa no estágio de um microscópio confocal, equipado com os comprimentos de onda de excitação a laser apropriados e conjuntos de filtros.

E use uma lente de imersão em água de 20 a 25x para capturar pelo menos seis imagens de pilha z em camadas do substrato até o topo de cada segmento de biofilme em incrementos de 0,3 micrômetro. Em seguida, salve as imagens como OME-TIFFs para análise COMSTAT. Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, abra o pacote COMSTAT2 no ImageJ e crie uma pasta de código-fonte na área de trabalho.

Adicione um único OME-TIFF à pasta e abra o OME-TIFF na pasta de origem. Exclua todas as camadas vazias que não contenham biomassa. Selecione Arquivo, Importar e Sequência de imagens para importar o arquivo para o ImageJ.

Localize e realce a pasta de origem sem abri-la e clique em Selecionar. Uma janela de opções de sequência aparecerá, clique em OK. Selecione Imagem, Transformar e Inverter Z para inverter a orientação do biofilme para que o substrato fique no topo da pilha. Para definir as propriedades da imagem, selecione Imagem e Propriedades, uma janela de origem será exibida.

Especifique a unidade de comprimento como mícron, defina a profundidade do voxel como 0,3 e clique em OK. Selecione Imagem, Ajustar e Limiar. Para ajustar o limite da imagem na janela de limite, posicione o controle deslizante inferior à direita para definir manualmente o valor do limite máximo e use o controle deslizante superior para definir o limite mínimo. Em seguida, use o controle deslizante na janela de imagem para rolar por cada camada para garantir que o ruído de fundo seja suficientemente removido em toda a pilha e selecione Definir para corrigir o valor de limite inferior.

Na janela definir níveis de limite, selecione OK e defina e corrija o valor máximo do limite da mesma forma. Selecione Aplicar, clique em OK na janela converter pilha em binário que aparece e saia da janela de limite. Selecione Plugins, Bio-Formats e Bio-Formats Exporter para salvar o arquivo com um novo nome de arquivo na pasta de origem.

Uma janela de vários arquivos do Bio-Formats Exporter aparecerá, selecione OK. Uma janela de opções do Exportador de Bioformatos aparecerá, selecione OK novamente. Para executar o COMSTAT, selecione plugins e COMSTAT2, uma janela sobre aparecerá, selecione OK.In janela Diretórios observados, selecione Adicionar, localize e destaque a pasta de origem, destaque e clique em Escolher. Uma janela Imagens em Diretórios será exibida listando os OME-TIFFs a serem analisados.

Na janela COMSTAT2.1, desmarque Limite Automático Método de Otsu e Filtragem de Volume Conectado para garantir que o software use valores de limite predefinidos para OME-TIFFs individuais. Na janela COMSTAT2.1, selecione Biomassa, Distribuição de espessura e Área de superfície e clique em Ir para executar o programa. Os dados de saída serão mostrados na janela de log.

As medições serão salvas automaticamente como arquivos TXT na pasta de origem. Nesta análise representativa, um isolado de Pseudomonas aeruginosa, cultivado de um paciente infectado com fibrose cística, foi usado para demonstrar os pontos fortes dessa abordagem, quantificando de forma imprecisa as alterações induzidas por antimicrobianos na arquitetura do biofilme in vitro. A imagem de células vivas também pode visualizar alterações na estrutura do biofilme de Pseudomonas aeruginosa antes e depois do tratamento monoclonal e tobramicina específico para biofilme.

A análise dos dados COMSTAT revelou diferenças significativas entre as estruturas de biofilme tratadas em comparação com as culturas controle. Nas culturas tratadas com tobramicina, foi observada uma clara redução na espessura média e na biomassa. No entanto, na presença de anticorpos, o biofilme de P. aeruginosa foi resistente a essas alterações estruturais induzidas pela tobramicina.

Ao examinar a relação superfície/biovolume, foi observada uma redução significativa na presença de anticorpos em biofilmes expostos e não expostos à tobramicina, indicando a formação de agregados em culturas tratadas com anticorpos. Este procedimento pode ser realizado para avaliar ou comparar quantitativamente os efeitos de diferentes antimicrobianos usados para romper matrizes de biofilme. Usando essa técnica como uma estrutura geral, os pesquisadores podem explorar diferentes maneiras de refinar o protocolo para incluir novos modelos matemáticos e plug-ins algorítmicos no ImageJ para melhor descrever a heterogeneidade do biofilme.