Name: Produção de Proteínas IgG Fusion Transitóriamente Expressa em Nicotiana benthamiana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 29 s
Description: Aprenda a expressão, extração e purificação de IgG humana recombinante fusionada a GFP em Nicotiana benthamiana usando cromatografia em coluna. Este método permite visualizar proteínas marcadas em laboratórios universitários.

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Agradecemos a Maria Pia DiPalma pela edição do vídeo. Agradecemos também ao Escritório de Divulgação Educacional e Serviços Estudantis da Universidade Estadual do Arizona por sua generosa assistência à taxa de publicação. A pesquisa para este protocolo foi apoiada pela School of Life Sciences da Universidade Estadual do Arizona.

1. Cultivar plantas N. benthamiana 
<ol><li>Coloque as pelotas de turfa do solo em uma bandeja e despeje previamente fervida, ainda quente (~40-45 °C), água sobre as pelotas de turfa para expansão total. Depois que as pelotas forem totalmente expandidas, coloque 2-3 sementes de N. benthamiana em cada pelota de turfa usando pinças.</li>
	<li>Despeje cerca de 0,5 em água para cobrir o fundo da bandeja. Rotule a bandeja com a data de semeadura. Continue regando as mudas diariamente com quantidades adequadas de fertilizante. A concentração de fertilizantes (alimentos vegetais solúveis em água) é geralmente de 2,5-2,8 g/L.</li>
	<li>Cubra a bandeja com um topo de humidome quando colocado na câmara de crescimento. Mantenha as pelotas de turfa semeadas na câmara de crescimento a 23-25 °C, com um fotoperíodo de 16 horas e 60% de umidade relativa.</li>
	<li>Após uma semana, remova plantas extras deixando cada pelota com apenas uma muda.</li>
	<li>Quando as plantas estiverem com 2-3 semanas de idade, transfira cada pelota de turfa para um pote individual contendo o solo de controle de umidade. Esta demonstração usou o controle de umidade Miracle-Gro em vasos de solo.</li>
	<li>Água diariamente com fertilizante 1 g/L. Nunca deixe o solo completamente seco. As plantas estão prontas para infiltração quando tiverem de 5 a 6 semanas.</li>
</ol>2. Preparação de tumefaciens de agrobacterium para infiltração
NOTA: Os construtos de fusão GFP-IgG podem ser obtidos conforme descrito neste artigo31. O gene asGFP foi obtido e otimizado a partir deste estudo45. As etapas a seguir devem ser feitas ao lado de um queimador Bunsen, e técnicas assépticas básicas devem ser aplicadas para evitar contaminação.
<ol><li>Streak A. tumefaciens EHA105 abrigando vírus anã amarelo-feijão (BeYDV)19 vetor de expressão vegetal para cada construção (asGFP-IgG, GFP-IgG, cadeia leve) de um estoque de glicerol no ágar LB (10 g/L Tryptone, 10 g/L NaCl, extrato de levedura de 5 g, 15 g/L agar, 50 μg/mL kanamycin).</li>
	<li>Cresça por um dia em uma incubadora em pé de 30 °C. Isole uma única colônia para verificação pelo protocolo PCR de tela colônia padrão.</li>
	<li>Use colônia verificada para cada construção. Encha o tubo cônico com 10 mL de mídia LB (10 g/L tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g de extrato de levedura, 50 μg/mL). Em seguida, adicione 10 μL de 100 μg/mL kanamycin. Adicione 10 μL de 2,5 μg/mL rifampicina para evitar a contaminação de E. coli. Incubar a 30°C e 120-150 rpm durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, se a cultura Agrobacterium for cultivada para OD600 = 0,6-0,9, ela poderá ser usada para infiltração. Se for overgrown (OD600 > 1), 1-2 mL deve ser transferido para LB fresco com antibióticos e cultivado para o OD600necessário . Dependendo da concentração da cultura inicial, pode levar dois dias para crescer até OD600 = 0,6-0,9.</li>
	<li>Uma vez no apropriado OD600, coloque as culturas em uma centrífuga, e pelota as bactérias por centrifugação a 4.500 x g por 20 min, temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Supernante decante de ambas as amostras, e então resuspenda cada pelota em 1x tampão de infiltração (10 mM 2-(N-morpholino) ácido esulfônico, 10 mM sulfato de magnésio, ajustado para pH 5,5 com KOH) para obter o LMfinal 600 = 0,4. Isso deve levar aproximadamente 15-45 mL de tampão de infiltração, dependendo da densidade da cultura inicial. Combine volumes iguais de cada construção de fusão IgG com a construção da cadeia de luz para obter ODfinal 600 = 0,2 por construção em cada tubo.</li>
</ol>3. Agroinfiltração de seringas sem agulha
<ol><li>Pegue um clipe de papel endireitado e plantas N. benthamiana de 5-6 semanas de idade a partir do passo 1. Usando a borda afiada do clipe de papel, faça uma pequena punção na primeira camada epidérmica da folha na superfície adaxial. Evite perfurar o tempo todo. NOTA: As folhas inferiores são mais fáceis de infiltrar, enquanto as folhas na parte superior da planta são mais duras. Geralmente, a expressão de proteínas recombinantes é mais alta nas folhas localizadas no meio de uma planta, e essas folhas também ficam menos necróticas.</li>
	<li>Encha uma seringa de 1 mL, sem agulha presa, com a solução agrobacterium preparada a partir do passo 2. Cubra o orifício feito na etapa anterior com a extremidade da seringa e empurre lentamente para injetar as bactérias na folha enquanto aplica contrapressão suave por trás da folha. Observe a folha escurecer à medida que a solução é injetada sem aplicar muita pressão sobre a seringa.</li>
	<li>Tente se infiltrar na maior parte da área da folha em um máximo de 3-4 vezes – danos excessivos nas folhas podem dificultar o rendimento da proteína. A folha de plantas infiltrada aparecerá na maior parte escura da vista inferior. NOTA: Esta solução bacteriana deve ser suficiente para pelo menos 3-4 plantas por construção. Autoclave qualquer solução bacteriana restante antes de descartar.</li>
</ol>4. Cresça e observe a N. benthamiana infiltrada
<ol><li>Coloque plantas infiltradas de volta na câmara de crescimento e continue a regar diariamente.</li>
	<li>Observe as folhas para clorose e necrose em áreas infiltradas. Observe as plantas para fluorescência GFP (se o GFP estiver presente) sob uma lâmpada UV de ondas longas e curtas.</li>
	<li>O dia 4-5 mostra a maior fluorescência de ambas as construções de GFP nas folhas. Colher todas as folhas em 4-5 dpi (dias pós-infiltração) e pesar o material total da folha.</li>
	<li>Use-o imediatamente para processamento a jusante ou armazene a -80 °C até estar pronto para uso.</li>
</ol>5. Extração de proteína
<ol><li>Mantenha tampões e copos de liquidificador no gelo ou a 4 °C antes de usar.</li>
	<li>Prepare 2-3 mL de tampão de extração gelada (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 com HCl) por 1 g de material vegetal. Adicione 2 mM de flúor de fenilmetilsulfonil (PMSF) do estoque (100 mM) e 50 mM de sódio ascorbate ao tampão de extração pouco antes da extração.</li>
	<li>Coloque o tecido vegetal do passo 4 no copo do liquidificador pré-ciclimado. Adicione uma quantidade medida de tampão de extração refrigerado ao copo do liquidificador (conforme indicado na etapa 5.2). Coloque o copo do liquidificador no liquidificador. Pegue uma folha pré-cortada de parafilm e estique-a sobre a parte superior do copo do liquidificador. Misture à homogeneidade com intervalos de 20 segundos, mexendo bem entre os ciclos de mistura conforme necessário.</li>
	<li>Transfira material misturado para um béquer. Adicione uma barra de mexida e mexa a 4 °C por 30 minutos para aumentar a solubilidade da proteína e permitir a precipitação de sólidos.</li>
	<li>Coloque 2 camadas de Miracloth sobre um béquer limpo no gelo e despeje o extrato através dele para remover grandes detritos de folhas. Depois de todo o extrato ser derramado, dobre o Pano de Mira para espremer o extrato residual da folha. O extrato deve parecer verde escuro sem partículas visíveis.</li>
	<li>Transfira 50 μL desta amostra para um novo tubo de 1,5 mL e rotule "extrato total" para análise posterior. Transfira o extrato para tubos de centrífuga. Centrifugar o restante do extrato vegetal a 16.000 x g por 20 min, 4 °C e transferir o sobrenante para um tubo cônico.</li>
	<li>Filtre o extrato solúvel utilizando uma seringa de 50 mL e filtro de fibra de vidro de seringa (0,75 μm).</li>
	<li>Colete 50 μL de uma amostra após a centrifugação, rotular "extrato solúvel" para análise posterior.</li>
</ol>6. Procedimento de cromatografia da coluna proteína G
NOTA: O protocolo descrito aqui é para cromatografia de fluxo de gravidade usando resina de agarose Pierce Protein G. Se usar uma resina diferente, consulte as instruções do fabricante para ajustes. Nunca deixe a resina secar e evite que todo o líquido se escorra. Recapitulando a tomada conforme necessário.
<ol><li>Configure uma coluna de polipropileno que contém 20 mL de amostra.</li>
	<li>Estimar a quantidade de chorume necessária dependendo do tipo de imunoglobulina alvo e sua afinidade com a resina. Geralmente, 3 mL de chorume total com volume de cama de 1,5 mL é suficiente para a purificação de vários miligramas de Ab.</li>
	<li>Despeje cuidadosamente a quantidade necessária de chorume resuspended na coluna tampada. Abra a saída da coluna a partir da parte inferior da coluna e deixe-a drenar até que a maior parte do buffer se vá.</li>
	<li>Despeje imediatamente 10 mL de tampão de lavagem 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7.4 com HCl) na parte superior. Deixe escorrer e repita esta etapa de lavagem 2x.</li>
	<li>Aplique a amostra filtrada da etapa 5 para a coluna e colete o fluxo — aliquot 50 μL de fluxo para análise posterior. Guarde o resto do fluxo no caso de o Ab não se ligar à resina. NOTA: Reaplicar fluxo através de uma nova coluna geralmente não resulta em um bom rendimento; por isso é aconselhável começar com novo material de folha.</li>
	<li>Lave a resina duas vezes com 10 mL de 1x PBS para reduzir a ligação não específica. Se desejar, alíquota de 50 μL de lavagem à medida que o buffer escorre pela coluna para verificar se o ab alvo não está elucido com um tampão de lavagem.</li>
	<li>Configurar e rotular cinco tubos com 125 μL de estéril 1 M Tris-HCl em pH 8. Isto é para neutralizar o Abs no tampão de eluição ácida para evitar possíveis mudanças estruturais. Alternativamente, adicione 30 μL de base de 2 M Tris para obter uma amostra menos diluída. ATENÇÃO: Durante a eluição, a luz UV pode ser usada para visualização. Isso não precisa ser feito durante a elução. Se o UV estiver sendo usado, certifique-se de usar EPI apropriado para evitar danos aos olhos e à pele. Uma luz UV não precisa ser usada durante a etapa de eluição.</li>
	<li>Elute o Abs aplicando 5 mL de tampão de elução (100 mM de glicina, pH 2.5 com HCl) na coluna e coletar frações de 1 mL a cada tubo designado da etapa anterior.</li>
	<li>Regenere imediatamente a coluna aplicando 20 mL de tampão de lavagem, seguido por 10 mL de tampão de lavagem. Certifique-se de que a resina não seja deixada em um ambiente ácido por um tempo prolongado. As eluções devem parecer fluorescentes, muitas vezes a maior fluorescência é vista na segunda elução, mas pode variar de extração para extração.</li>
	<li>Para armazenamento, lave a resina com 10 mL de 20% de etanol no PBS e deixe escorrer no meio do caminho. Recapitule a parte superior, depois a parte inferior da coluna, e mantenha-se ereto a 4 °C. NOTA: Geralmente, as resinas G da proteína podem ser reutilizadas até 10 vezes sem perda significativa de eficiência. Consulte as diretrizes do fabricante para obter detalhes específicos.</li>
	<li>Determine a concentração de Ab usando um espectrofotômetro medindo a absorvância a 280 nm, usando o tampão de elução como um branco. Armazene os eluatos em -80 °C e aliquot 50 μL de cada fração a um tubo separado para análise posterior.</li>
</ol>7. SDS-PAGE para detecção de fusão GFP-Ig
<ol><li>Prepare todas as amostras antes de configurar o SDS-PAGE.<ol>
<li>Adicionar 4 μL de tampão de amostra (6x reduzindo o tampão amostra: 3,0 mL de glicerol, 0,93 g de DTT, 1 g de SDS, 7 mL de 4x Tris (pH 6.8) 0,5 M, 1,2 mg de azul bromofenol); (6x tampão amostral não redutor: 3,0 mL de glicerol, 1 g de SDS, 7 mL de 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg de azul bromofenol) a 20 μL de cada amostra (extrato total, extrato solúvel, fluxo de fluxo, lavagem, todas as frações de elução) para análise. Certifique-se de que as tampas do tubo estão bem fixadas.</li>
		<li>Trate apenas amostras redutoras por 5 minutos em um banho de água fervente, e depois coloque amostras por 5 minutos no gelo. Gire amostras em um microcentrifuge para ~5 s e carregue 20 μL de cada amostra na ordem de coleta nos poços de gel. Carregue 3 μL de escada de proteína de cor dupla em um poço separado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute o gel SDS-PAGE a 100 V constantes até a separação desejada da banda de proteína; leva cerca de 1,5 horas. Monitore a escada como um indicador de separação de proteínas.</li>
	<li>Visualize o gel sob o UV para observar a fluorescência GFP.</li>
	<li>Se desejar, manche o gel com a mancha de Coomassie para avaliar a proteína total em cada amostra. Alternativamente, realize a mancha ocidental para avaliar a proteína alvo usando abdominais específicos. NOTA: Tanto a coloração coomassie quanto a mancha ocidental podem ser realizadas seguindo os protocolos padrão47,48.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo pode ser utilizado para a verificação visual de qualquer ab recombinante ou proteína recombinante produzida em plantas N. benthamiana, incluindo aquelas que requerem exposição temporária a ambientes ácidos para fins de purificação decolunas 42,43,44. Além disso, a fusão do asGFP para outras proteínas em diferentes sistemas de expressão pode ser uma ferramenta útil para visualização experimental e educação...

Relatórios da indústria indicam que treze dos vinte medicamentos de maior bilheteria nos Estados Unidos eram biológicos (medicamentos à base de proteína), dos quais nove eram anticorpos. Em 2019, foram mais de 570 terapêuticas de anticorpos (Ab) em várias fases de desenvolvimento clínico1,2,3. As vendas globais globais da Ab excedem 100 bilhões de USD, e o mercado terapêutico monoclonal Ab (mAb) deve gerar até 300 bilhões de USD até 20251,4. Com uma demanda tão alta e aumentos projetados na receita, pesquisadores têm trabalhado para desenvolver maneiras de produzir a terapêutica Ab em uma escala cada vez maior, com maior qualidade e custos mais baixos. Os sistemas de expressão à base de plantas têm várias vantagens sobre as linhas tradicionais de células mamíferas para a fabricação acessível e em larga escala da terapêutica Ab5,6. A produção de terapêutica proteica em plantas ("pharming molecular") não requer bioreatores caros ou instalações de cultura celular, assim como as técnicas tradicionais de cultura celular de mamíferos7,8. As plantas não podem contrair patógenos humanos, minimizando a contaminação potencial9. Tanto a expressão proteica transitória quanto transgênica à base de plantas pode ser utilizada como alternativas de menor custo aos sistemas de produção de mamíferos ou bacterianos10. Embora as plantas transgênicas sejam preferidas para a produção de culturas, a produção de proteínas recombinantes usando este método pode exigir de semanas a meses. Os avanços na expressão transitória utilizando vetores virais através da seringa ou da agroinfiltração a vácuo permitem a produção em pequena e grande escala, respectivamente, da proteína desejada nos dias11,12,13,14. A produção de mAbs contra o Ebola, a Dengue e o Zika, e inúmeras outras proteínas recombinantes, foram produzidas e purificadas de forma rápida e eficiente utilizando expressão transitória nas plantas de N. benthamiana 15,16,17,18,19. Essas circunstâncias tornam a expressão transitória baseada em plantas uma opção atraente para o desenvolvimento de múltiplas terapêuticas Ab e os métodos demonstrados neste protocolo20.
Os mAbs de primeira geração eram de derivação de murina, o que resultou em imunogenicidade não específica quando utilizados em testes em humanos21. Com o tempo, quiméricos, humanizados e, eventualmente, abs totalmente humanos foram produzidos para diminuir a imunogenicidade induzida pela terapêutica ab. Infelizmente, alguns desses Abs ainda causam imunogenicidade hospedeira devido a diferenças na glicossylation21. A evolução da engenharia vegetal permitiu a modificação dos glicos ab, o que é essencial, uma vez que a estabilidade e a função de um Ab podem ser significativamente afetadas pelo seu estado de glicosylation22. Os avanços permitiram a produção em sistemas vegetais de expressão de alto nível de mAbs humanizados, contendo glicanos humanos e, consequentemente, os traços biológicos desejados de um farmacêutico humano produzido em massa19,21.
Além do Abs recombinante, as moléculas de fusão Ab (fusões Ab) têm sido exploradas para vários propósitos nas últimas décadas. As fusões abs geralmente consistem em um fragmento ab ou ab fundido a uma molécula ou proteína e são projetadas para obter respostas de células efeitos imunológicos23. Essas moléculas foram criadas como potenciais intervenções terapêuticas para tratar diversas patologias, como câncer e doenças autoimunes24,25,26,27. Os complexos imunológicos recombinantes (RICs) são outra classe de fusões Ab que têm sido empregadas como candidatos à vacina28. Os RICs aproveitam a capacidade do sistema imunológico de reconhecer regiões de fusões ab e têm sido encontrados para melhorar a imunogenicidade quando combinados com outras plataformas de vacinas29,30,31.
Proteína Fluorescente Verde (GFP) é uma proteína bioluminescente derivada da água-viva Aequorea Victoria, que emite luz verde quando excitada pela luz ultravioleta32,33. Ao longo dos anos, o uso do GFP como marcador visual da expressão genética expandiu-se da expressão em Escherichia coli para numerosos sistemas de expressão proteica, incluindo as plantas N. benthamiana 34,35,36,37,38. Marcadores visíveis, como o GFP, têm implicações abundantes no ensino e aprendizagem de conceitos científicos. Inúmeros alunos de nível básico descrevem dificuldades para compreender conceitos científicos quando a ideia que está sendo ensinada não é visível a olho nu, como os conceitos de biologia molecular e campos relacionados39. Marcadores visuais, como o GFP, podem, assim, contribuir para o processamento de informações relacionadas aos processos científicos e podem ajudar a diminuir as dificuldades que os alunos relatam na aprendizagem de inúmeros conceitos científicos.
Embora o GFP seja frequentemente usado como marcador para indicar gene e expressão in vivo,é difícil visualizá-lo nos processos a jusante se usar condições ácidas. Esta circunstância é principalmente porque a GFP não mantém sua estrutura e fluorescência resultante a um pH40baixo . Ambientes ácidos temporários são frequentemente necessários em diversos processos de purificação, como proteína G, proteína A e cromatografia proteica L, muitas vezes utilizada para purificação de Ab41,42,43,44. Mutantes GFP têm sido usados para reter fluorescência sob condições ácidas45,46.
Aqui descrevemos um método simples de expressão, extração e purificação de proteínas de fusão IgG recombinantes em plantas N. benthamiana. Produzimos gfp tradicional fundido ao N-terminus de uma cadeia pesada IgG humanizada, criando uma fusão GFP-IgG. Simultaneamente, desenvolvemos a fusão de uma sequência otimizada por don de plantas para um GFP ácido-estável (asGFP) para o N-terminus de uma cadeia pesada IgG humanizada, criando uma fusão asGFP-IgG. As vantagens da produção de GFP-IgG incluem a capacidade de visualizar a presença de uma proteína alvo durante a expressão, enquanto asgFP-IgG permite ver a presença de proteína recombinante não apenas nas etapas de expressão e extração, mas também nas etapas de purificação da proteína. Este protocolo pode ser adaptado para a produção, purificação e visualização de uma gama de proteínas de fusão GFP produzidas em N. benthamiana e purificadas usando técnicas de cromatografia que requerem baixo pH. O processo também pode ser adaptado a várias quantidades de material de folha. Embora as proteínas abs e de fusão marcadas com GFP ou asGFP não sejam destinadas a ser usadas para terapias, esses métodos podem ser úteis como controles durante experimentos e também podem ser utilizados como uma ferramenta de ensino para biologia molecular e celular e biotecnologia, tanto presencialmente quanto virtualmente.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 5 mL</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 50 mL</td><td>qualquer</td> ágar <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A5306</td><td></td></tr><tr><td>Liquidificador com copos</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Ditiotreitol)</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>219482101</td><td></td></tr><tr><td>EDTA ( Ácido etilenoinitrilo)tetracético</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>E-6760</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>G-Biosciences</td><td>BTNM-0037</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G7126-500G</td><td></td></tr><tr><td>HCl (ácido clorídrico)</td><td>EMD MILLIPORE CORPORATION</td><td>HX0603-4</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de aquecimento</td><td>qualquer fornecedor respeitável</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Jiffy-7 727 com pellets de turfa</td><td>Hummert International</td><td>14237000</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Gold Biotechnology Inc</td><td>K-120-100</td><td></td></tr><tr><td>KCl (Cloreto de Potássio)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 (Fosfato de Potássio)</td><td>J.t.baker</td><td>3248-05</td><td></td></tr><tr><td>KOH (Hidróxido de Potássio)</td><td>VWR</td><td>BDH0262</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>MES (2- (N-Morfolino) ácido etanossulfônico)</td> <td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Millipore</td><td>4 75855-1R</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de envasamento de controle de umidade</td><td>Miracle-Gro</td><td>755783</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (Fosfato de Sódio)</td> <td>J.t.baker</td><td>3827-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (Cloreto de Sódio)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-203274C</td><td></td></tr><tr><td>Sementes de Nicotiana benthamiana</td><td>qualquer fornecedor respeitável</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (Fluoreto de Fenilmetilsulfonil)</td> <td>G-Biosciences</td><td>786-787</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de Polipropileno</td><td>qualquer</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Padrões de Cor Dupla Bio-Rad</td><td></td><td>1610394</td><td></td></tr><tr><td>Resina de proteína G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20399</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Gold Biotechnology Inc</td><td>R-120-25</td><td></td></tr><tr><td>SDS (Dodecil Sulfato de Sódio)</td> <td>G-Biosciences</td><td>DG093</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato de Sódio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A7631-500G</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>qualquer fornecedor respeitável</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Titan3 0.75 &micro; m filtro de fibra de vidro</td><td>ThermoScientific</td><td>40725-GM</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja para pellets de turfa com cúpula</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Base</td><td>J.t.baker</td><td>4109-02</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Amresco</td><td>M108-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>17221</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada UV</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Solúvel em Água para Todos os Fins Alimento vegetal</td><td>Extrato de levedura Miracle-Gro</td><td>2000992</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>9182</td><td></td></tr></tbody></table>

produção de proteínas igg fusion transitóriamente expressa em nicotiana benthamiana

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

A alta demanda por anticorpos como intervenções terapêuticas para várias doenças infecciosas, metabólicas, autoimunes, neoplásicas e outras doenças cria uma necessidade crescente de desenvolver métodos eficientes para a produção de anticorpos recombinantes. Em 2019, havia mais de 70 anticorpos monoclonais aprovados pela FDA, e há um potencial de crescimento exponencial. Apesar de sua promessa, fatores limitantes para o uso generalizado são os custos de fabricação e a complexidade. Potencialmente, as plantas oferecem estratégias de fabricação de proteínas de baixo custo, seguras e facilmente escaláveis. Plantas como Nicotiana benthamiana não só podem dobrar e montar proteínas mamíferas complexas, mas também podem adicionar modificações pós-translacionais críticas semelhantes às oferecidas pelas culturas de células mamíferas. Neste trabalho, utilizando GFP nativo e uma variante ácido-estável de proteína fluorescente verde (GFP) fundida a anticorpos monoclonais humanos, pudemos visualizar todo o processo de expressão e purificação de anticorpos transitórios das plantas N. benthamiana. Dependendo do propósito do experimento, a fusão GFP nativa pode garantir uma visualização mais fácil durante a fase de expressão nas plantas, enquanto a fusão GFP ácido-estável permite a visualização durante o processamento a jusante. Este procedimento escalável e simples pode ser realizado por um único pesquisador para produzir quantidades miligramas de proteínas de fusão de anticorpos ou anticorpos altamente puros em questão de dias usando apenas algumas pequenas plantas. Tal técnica pode ser estendida à visualização de qualquer tipo de processo de purificação de anticorpos e potencialmente muitas outras proteínas, tanto em sistemas de vegetação quanto em outros sistemas de expressão. Além disso, essas técnicas podem beneficiar instruções virtuais e serem executadas em um laboratório de ensino por estudantes de graduação que possuem experiência mínima prévia com técnicas de biologia molecular, fornecendo uma base para a exploração baseada em projetos com aplicações reais.

Este estudo demonstra um método fácil e rápido para produzir proteínas recombinantes e visualizá-las em todos os processos a jusante. Usando N. benthamiana e seguindo o protocolo fornecido, a produção de proteína recombinante descrita aqui pode ser alcançada em menos de uma semana. O fluxo de trabalho global da expressão, extração e purificação da planta é mostrado na Figura 1. Os estágios de crescimento vegetal de mudas de 2 semanas, plantas de 4 semanas de idade e plantas de 6 sem...

Descrevemos aqui um método simples de expressão, extração e purificação de IgG humano recombinante fundido ao GFP em Nicotiana benthamiana. Este protocolo pode ser estendido à purificação e visualização de inúmeras proteínas que utilizam cromatografia de coluna. Além disso, o protocolo é adaptável ao laboratório de ensino presencial e virtual universitário, proporcionando exploração baseada em projetos.

Produção de Proteínas IgG Fusion Transitóriamente Expressa em Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Esta é uma demonstração de um método simples de expressão, extração e purificação de IgG humano recombinante fundido à GFP em plantas nicotiana benthamiana relacionadas ao tabaco. Este protocolo pode ser utilizado para purificação e visualização de anticorpos produzidos por plantas, fusões de anticorpos e a maioria das proteínas que podem ser purificadas através da cromatografia da coluna. Este protocolo permite que pesquisadores e estudantes de laboratórios de trabalho universitário visualizem proteínas marcadas por GFP na maioria das etapas do processo de produção de proteínas.Coloque as pelotas de turfa do solo em uma bandeja e despeje previamente fervida, ainda água quente sobre as pelotas de turfa para expansão total. Pelotas levarão alguns minutos para se expandir totalmente. Depois que as paletes forem totalmente expandidas, coloque de duas a três sementes nicotiana benthamiana em cada pelota de turfa usando pinças.Depois que isso for feito, você precisará derramar cerca de 0,5 polegadas de água para cobrir o fundo da bandeja. Não se esqueça de rotular a bandeja com a data de semeadura. Continue regando as mudas diariamente com quantidades adequadas de fertilizante.A bandeja

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós desenvolvemos uma técnica para testar interações proteína-proteína na planta. A proteína fluorescente amarela (YFP) é dividido em dois fragmentos não-sobrepostas. Cada fragmento é clonado em-frame de um gene de interesse através do sistema Gateway, permitindo a expressão de proteínas de fusão. Reconstituição do sinal YFP só ocorre quando as proteínas interagem inquérito.

Detecção de interações proteína na planta através de um gateway de Complementação de fluorescência Compatível Bimolecular (BiFC) Sistema

Plantas oferecer um novo sistema para a produção de proteínas farmacêuticas, em escala comercial, que é mais escalável e de custo eficaz e segura que paradigmas expressão corrente. Neste estudo, apresentamos uma abordagem simples e conveniente, mas escalável para introduzir genes alvo...

Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

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Este trabalho descreve um novo método para alvejar seletivamente organelas subcelulares nas plantas, analisadas usando o BioRad Gene Gun.

Expressão Gênica transiente em tabaco usando Assembleia Gibson eo Gene Gun

Neste estudo, a expressão de uma proteína recombinante humana alvo em diferentes plataformas de produção foi comparada. Focamos em culturas tradicionais baseadas em fermentadores e em plantas, descrevendo a configuração de cada sistema e destacando, com base nos resultados relatados, os limites e vantagens inerentes a cada plataforma.

Uma análise comparativa de Expressão de proteínas recombinantes em Diferentes biofábricas: bactérias, células de insectos e Sistemas de Plantas

sistemas de expressão em células de insecto Nonlytic são pouco utilizados para a produção, o tráfico celular / localização, e a análise funcional da proteína recombinante. Aqui, nós descrevemos métodos para gerar vectores de express e subsequente expressão da proteína transiente em linhas de células de lepidópteros disponíveis comercialmente. A co-localizao de aquaporinas de Bemisia tabaci com proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares também é apresentada.

Expressão transitória e Celular Localização de proteínas recombinantes em células de cultura de insectos

Este manuscrito descreve um procedimento experimental de fácil e rápido para determinar interações da proteína-proteína, baseadas na medição da atividade de luciferase.

Luciferase complementação Imaging ensaio em folhas de Nicotiana benthamiana de transitoriamente determinação dinâmica da interação da proteína-proteína

Temos desenvolvido um novo método para expressar co várias proteínas da fusão fluorescente quimérico em plantas para superar as dificuldades dos métodos convencionais. Ele tira vantagem do uso de um plasmídeo de expressão única que contém várias proteínas funcionalmente independentes expressando cassettes para alcançar expressão co de proteína.

Co de expressão de várias proteínas da fusão fluorescente quimérico de forma eficiente em plantas

Expressão heteróloga transitória de enzimas biossintéticas em folhas de Nicotiana benthamiana pode desviar fontes endógenas de 2,3-oxidosqualene para a produção de novos produtos de alto valor triterpeno. Aqui é descrito um protocolo detalhado para produção em escala preparativa rápida (5 dias) de triterpenos e analogs utilizando esta poderosa plataforma baseada em vegetais.

Expressão transiente em Nicotiana Benthamiana deixa triterpeno produção em escala preparativa

Este destina-se como uma introdução para o patch clamp de gravação a partir de oócitos Xenopus laevis. Abrange vitelínico remoção da membrana, a formação de um selo gigaohm (gigaseal), ea conversão opcional do patch para a topologia de fora-out.

Gravação de patch-clamp de canais iônicos Expresso em Oócitos Xenopus

Aprenda a expressão, extração e purificação de IgG humana recombinante fusionada a GFP em Nicotiana benthamiana usando cromatografia em coluna. Este método permite visualizar proteínas marcadas em laboratórios universitários.

Produção de Proteínas IgG Fusion Transitóriamente Expressa em Nicotiana benthamiana

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