Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos

Esta técnica permitirá aos pesquisadores isolar células-tronco de câncer de mama com máxima pureza e viabilidade para a realização de ensaios de caracterização funcional in vitro e in vivo. As células-tronco isoladas do câncer de mama também podem ser usadas para ajudar a elucidar os eventos moleculares que controlam a tumorigenicidade e a metástase, e para projetar estratégias terapêuticas para atingir essas células. Com pequenas modificações específicas para os tipos de células e tecidos de interesse, este método também pode ser aplicado a outros sistemas.

Para gerar uma única suspensão celular a partir de uma cultura de células, lave uma cultura de células de câncer de mama 80% confluente com PBS e trate as células com uma solução de dissociação celular apropriada por cinco minutos em temperatura ambiente. Uma vez que as células tenham se destacado, adicione cinco mililitros de meio de cultura para neutralizar a solução de dissociação celular e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros para centrifugação. Ressuspenda o pellet em cinco mililitros de PBS para contagem.

Após a contagem, centrifugue as células novamente e, em seguida, ressuspenda as células de uma só vez 10 a seis células por mililitro de tampão substrato ALDH. Para gerar uma única suspensão celular a partir de uma amostra de tecido, use lâminas cirúrgicas em uma técnica cruzada para picar o tecido tumoral em pedaços de aproximadamente um milímetro. Coloque as peças em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de tampão de dissociação.

Sele o tubo com parafilme para uma incubação de 40 minutos a 37 graus Celsius em um agitador e sedimente os pedaços de tecido digeridos por centrifugação. Ressuspenda o pellet em cinco mililitros de tripsina usando uma pipeta de cinco mililitros e incube o tecido em banho-maria a 37 graus por cinco minutos. No final da incubação, pipetar vigorosamente o tecido várias vezes para liberar células individuais e adicionar meio DMEM/F-12 suficiente para elevar o volume total no tubo para 25 mililitros.

Colete as células por centrifugação, ressuspenda o pellet em um mililitro de Displace DNAse e incube por cinco minutos em banho-maria a 37 graus Celsius. No final da incubação, traga o volume total para 10 mililitros com PBS. Misture as células pipetando e passe-as por um filtro de células de 40 mícrons em um tubo de 50 mililitros.

Após a centrifugação, ressuspenda as células em cinco mililitros de PBS fresco para contagem. Para realizar um ensaio de formação de colônias, após a classificação, ressuspenda as células em meio completo e adicione o número apropriado de células-tronco de câncer de mama a cada um dos três tubos contendo dois mililitros de meio por tubo, rotulados um vezes 10 para o segundo, duas vezes 10 para o segundo ou cinco vezes 10 para as segundas células. Pipete para cima e para baixo cinco vezes para misturar completamente a suspensão celular e colocar as células em poços individuais de uma placa de seis poços.

Gire suavemente a placa para obter distribuições celulares uniformes e coloque a placa na incubadora de cultura de células até que as colônias apareçam. No final da incubação, lave as células com um mililitro de PBS por poço e core as células com 500 microlitros de solução violeta a 0,05% por poço por 30 segundos. No final da incubação, lave os poços duas vezes com dois mililitros de água por poço para remover o excesso de corante, e conte e registre o número total de colônias por poço por microscopia de luz com uma ampliação de quatro ou 10 vezes.

Para realizar um ensaio de mamosfera, após a classificação, ressuspenda as células em meio de mamosfera completo e coloque uma placa com uma densidade de assento de cinco vezes 10 das segundas células por centímetro quadrado de área por poço em uma placa de cultura de células de fixação ultrabaixa de 96 poços. Antes de contar o número de mamosferas por poço por microscopia de luz, coloque a placa na incubadora de cultura de células por cinco a 10 dias. Para configurar um modelo de cultura 3D, adicione cuidadosamente 50 microlitros de extrato de membrana basal a cada poço de uma placa de 96 poços sem bolhas e coloque a placa a 37 graus Celsius por uma hora para permitir que a solução polimerize.

Adicione 100 microlitros de PBS após 10 minutos para evitar o ressecamento da camada de gel. No final da incubação, suspenda as células classificadas em cinco a 50 vezes 10 para as terceiras células por 200 microlitros de concentração de meio de cultura 3D e substitua o PBS em cada poço da placa de 96 poços por 200 microlitros de meio contendo células. Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura de células por 10 a 14 dias antes de avaliar as culturas quanto à formação de organoides.

As células de câncer de mama humano que exibem atividade enzimática ALDH aumentada expressam altos níveis de CD44 e níveis baixos a negativos de expressão de CD24, e podem ser classificadas como células-tronco de câncer de mama. A proporção de células-tronco de câncer de mama na população em massa pode variar entre linhagens celulares ou pacientes e geralmente depende do estágio da doença, com o câncer de mama mais agressivo geralmente exibindo uma proporção maior de células-tronco de câncer de mama. A capacidade de uma única célula de câncer de mama de se auto-renovar e gerar colônias de 50 células pode ser avaliada por ensaios de formação de colônias.

A capacidade das células-tronco do câncer de mama de se auto-renovarem em condições experimentais independentes de ancoragem pode ser avaliada por ensaios de mamosfera. A cultura de células de câncer de mama e extrato de membrana basal permite que as células-tronco do câncer de mama formem estruturas 3D que recapitulam as condições in vivo. Além disso, modelos de xenoenxerto de camundongo in vivo podem ser usados para entender as diferenças no crescimento, auto-renovação, diferenciação e / ou capacidade de iniciar o tumor das células-tronco do câncer de mama em comparação com células-tronco não relacionadas ao câncer de mama ou populações de células em massa.

Após esse procedimento, as células-tronco isoladas do câncer de mama podem ser usadas em estudos transcriptômicos, cinômicos e metabolômicos. Este método oferece aos pesquisadores a oportunidade de explorar o papel das células-tronco do câncer de mama na iniciação do tumor, metástase, recorrência e resistência à terapia.