Name: Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco de câncer de mama com alta pureza e viabilidade para ensaios funcionais in vitro e in vivo. Este método auxilia pesquisadores a estudar tumorigenicidade e metástase.

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Agradecemos aos membros do nosso laboratório por suas discussões úteis e apoio. Nossa pesquisa sobre células-tronco de câncer de mama e o microambiente tumoral é financiada por doações do Instituto de Pesquisa da Sociedade Canadense de Pesquisa do Câncer e do Programa de Câncer de Mama do Departamento de Defesa do Exército dos EUA (Grant # BC160912). V.B. é apoiado por uma Western Postdoctoral Fellowship (Western University), e tanto a A.L.A. quanto a V.B. são apoiadas pela Breast Cancer Society of Canada. C.L. é apoiado por uma Bolsa de Pós-Graduação Vanier Canada do Governo do Canadá.

Os autores não têm nada a revelar.

A metástase do câncer de mama e a resistência à terapia tornaram-se a principal causa de mortalidade em mulheres em todo o mundo. A existência de uma subpopulação de células-tronco do câncer de mama (CBSCs) contribui para o aumento da metástase 26,43,44,45,46 e da resistência à terapia 21,47,48.</...

Compreender os mecanismos celulares e moleculares das células-tronco do câncer de mama humano (CBSCs) é crucial para enfrentar os desafios encontrados no tratamento do câncer de mama. O surgimento do conceito de CBSC remonta ao início doséculo 21, onde uma pequena população de células CD44+CD24-/baixo câncer de mama foi capaz de gerar tumores heterogêneos em camundongos 1,2. Posteriormente, observou-se que as células de câncer de mama humano com alta atividade enzimática da aldeído desidrogenase (ALDHalta) também apresentaram propriedades semelhantes às células-tronco3. Esses CBSCs representam uma pequena população de células capazes de auto-renovação e diferenciação, contribuindo para a natureza heterogênea dos tumores em massa 1,2,3. Evidências acumuladas sugerem que alterações nas vias de sinalização evolutivamente conservadas impulsionam a sobrevivência e a manutenção do CBSC 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Além disso, o microambiente extrínseco celular demonstrou desempenhar um papel fundamental na ditadura de diferentes funções do CBSC15,16,17. Essas vias moleculares e os fatores externos que regulam a função do CBSC contribuem para a recidiva do câncer de mama, metástase18 e desenvolvimento de resistência às terapias 19,20,21, sendo que a existência residual de CBSCs pós-tratamento representa um grande desafio para a sobrevida global de pacientes com câncer de mama 22,23 . A avaliação pré-clínica desses fatores é, portanto, muito importante para identificar terapias direcionadas ao BCSC que possam ser benéficas para alcançar melhores resultados de tratamento e melhorar a sobrevida global em pacientes com câncer de mama.
Vários modelos de linhagem celular de câncer de mama humano in vitro e modelos de xenoenxerto humano in vivo têm sido utilizados para caracterizar BCSCs24,25,26,27,28,29. A capacidade das linhagens celulares de repovoar continuamente após cada passagem sucessiva faz delas um sistema modelo ideal para realizar estudos farmacogenômicos e baseados em ômica. No entanto, as linhagens celulares muitas vezes não conseguem recapitular a heterogeneidade observada em amostras de pacientes. Por isso, é importante complementar os dados da linhagem celular com amostras derivadas do paciente. O isolamento de BCSCs em sua forma mais pura é importante para permitir a caracterização detalhada de BCSCs. Alcançar essa pureza depende da seleção de marcadores fenotípicos que são específicos para BCSCs. Atualmente, o fenótipo de células CD44 + CD24- de alta ALDH é mais comumente usado para distinguir e isolar BCSCs humanos de populações de células de câncer de mama em massa usando a classificaçãode células ativadas por fluorescência (FACS) para máxima pureza1, 3,26. Além disso, as propriedades de CBSCs isolados, como auto-renovação, proliferação e diferenciação, podem ser avaliadas usando técnicas in vitro e in vivo.
Por exemplo, ensaios de formação de colônias in vitro podem ser usados para avaliar a capacidade de uma única célula de se auto-renovar para formar uma colônia de 50 células ou mais na presença de diferentes condições de tratamento30. Os ensaios da mamosfera também podem ser usados para avaliar o potencial de auto-renovação das células de câncer de mama sob condições independentes de ancoragem. Este ensaio mede a capacidade de células individuais de gerar e crescer como esferas (mistura de BCSCs e não-BCSCs) a cada passagem sucessiva em condições de cultura não aderente livre de soro31. Além disso, modelos de cultura 3-Dimensional (3D) podem ser usados para avaliar a função do CBSC, incluindo interações célula-célula e célula-matriz que recapitulam de perto o microambiente in vivo e permitem a investigação da atividade de potenciais terapias direcionadas ao BCSC32. Apesar das diversas aplicações de modelos in vitro, é difícil modelar a complexidade de condições in vivo usando apenas ensaios in vitro. Esse desafio pode ser superado pelo uso de modelos de xenoenxerto de camundongos para avaliar o comportamento do CBSC in vivo. Em particular, tais modelos servem como um sistema ideal para avaliar a metástase do câncer de mama33, investigar as interações com o microambiente durante a progressão da doença 34, imagens in vivo 35 e para prever a toxicidade específica do paciente e a eficácia dos agentes antitumorais34.
Este protocolo fornece uma descrição detalhada para o isolamento de ALDH humanos CD44 + CD24-BCSCselevadosna pureza máxima de populações em massa de células heterogêneas de câncer de mama. Também fornecemos uma descrição detalhada de três técnicas in vitro (ensaio de formação de colônias, ensaio de mamosfera e modelo de cultura 3D) e um ensaio de xenoenxerto tumoral in vivo que pode ser usado para avaliar diferentes funções de CBSCs. Esses métodos seriam apropriados para uso por pesquisadores interessados em isolar e caracterizar BCSCs de linhagens celulares de câncer de mama humano ou células de câncer de mama derivadas de pacientes primários e tecido tumoral para fins de compreensão da biologia do BCSC e / ou investigação de novas terapias direcionadas ao BCSC.

<table><tbody><tr><td>7-Aminoactinomicina D (7AAD)</td><td>BD</td><td>51-68981E</td><td>sugerido: 0,25 &micro; g/1x106 células</td></tr> Acetona Substrato <tr><td>de aldeído desidrogenase (ALDH)</td><td>Fisher</td> A18-1 <td></td><td>Stemcell Technologies 1700 Vendido comercialmente como parte do kit de ensaio ALDEFLOUR; siga as instruções do fabricante para a preparação do substrato ALDH Extrato de</td></tr><tr><td>membrana de porão (BME)</td> <td>Corning</td><td>354234</td><td>Vendido sob o nome comercial Matrigel</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células: 6 poços</td><td>Corning</td><td>877218</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células: 60mm</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células: 96 poços de fixação ultrabaixa</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células: 40 mícrons</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7001</td><td>Preparar diluição de 1:30 de 3 mg/mL de colágeno em PBS</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>11088807001</td><td>1x</td></tr><tr><td>Tubos cônicos: 50 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>05-539-7</td><td></td></tr><tr><td>Cristal violeta</td><td>Sigma</td><td>C6158</td><td>Use solução de cristal violeta a 0,05% em água para coloração</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7913</td><td>5U/mL</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, Com L-glutamina e 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>D5052</td><td>0.1 mg/mL concentração final</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm Lifescience</td><td>97068-085</td><td><forte>&nbsp; < / tubos > fluxo forte</td></tr><tr><td>: 5ml</td><td>BD</td><td>352063</td><td>tubos de fundo redondo de polipropileno</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>84124</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-CD24 humano</td><td>BD</td><td>561646</td><td>R-ficoeritrina e corante de cianina conjugado Clone: ML5</td></tr><tr><td>anticorpo anti-CD44 humano</td><td>BD</td><td>555479</td><td>R-ficoeritrina conjugado, Clone: G44-26</td></tr><tr><td>N, N-dietilaminobenzaldeído (DEAB)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td>Vendido comercialmente como parte do kit de ensaio ALDEFLOUR; siga as instruções do fabricante Preparação DEAB</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent Inc</td><td>311-425-CL</td><td>1x, Sem cálcio e magnésio</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mammosphere Media Composição</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td>1x</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bioshop</td><td>ALB003</td><td>04%</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, Com L-glutamina e 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>16634</td><td>5 &micro; g/mL</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D Composição de Mídia Organoide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td>1x</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, Com L-glutamina e 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>1x</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>Neuregulina &beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td>5 nM</td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>R-spondin3</td><td>R& D</td><td>3500</td><td>250 ng/mL</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7067</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>5 &micro; O</td></tr></tbody></table>

isolamento e avaliação funcional de células-tronco de câncer de mama humano de amostras de células e tecidos

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

As células-tronco do câncer de mama (CBSCs) são células cancerígenas com características hereditárias ou adquiridas semelhantes a células-tronco. Apesar de sua baixa frequência, eles são os principais contribuintes para o início do câncer de mama, recaída, metástase e resistência à terapia. É imperativo entender a biologia das células-tronco do câncer de mama, a fim de identificar novos alvos terapêuticos para tratar o câncer de mama. As células-tronco do câncer de mama são isoladas e caracterizadas com base na expressão de marcadores únicos da superfície celular, como CD44, CD24 e atividade enzimática da aldeído desidrogenase (ALDH). Essas células CD44+CD24-altasde ALDH constituem a população de CBSC e podem ser isoladas por classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para estudos funcionais a jusante. Dependendo da questão científica, diferentes métodos in vitro e in vivo podem ser usados para avaliar as características funcionais dos CBSC. Aqui, fornecemos um protocolo experimental detalhado para o isolamento de BCSCs humanos de populações heterogêneas de células de câncer de mama, bem como tecido tumoral primário obtido de pacientes com câncer de mama. Além disso, destacamos ensaios funcionais in vitro e in vivo a jusante, incluindo ensaios de formação de colônias, ensaios de mamosfera, modelos de cultura 3D e ensaios de xenoenxerto tumoral que podem ser usados para avaliar a função do CBSC.

O protocolo descrito permite o isolamento de BCSCs humanos de uma população heterogênea de células de câncer de mama, seja de linhagens celulares ou de tecido tumoral dissociado. Para qualquer linhagem celular ou amostra de tecido, é crucial gerar uma suspensão celular única uniforme para isolar BCSCs na pureza máxima, pois a contaminação de populações não-BCSC pode resultar em respostas celulares variáveis, especialmente se o objetivo do estudo for avaliar a eficácia de agentes terapêuticos direcionados aos BCSCs. A apl...

Este protocolo experimental descreve o isolamento de CBSCs de amostras de células e tecidos de câncer de mama, bem como os ensaios in vitro e in vivo que podem ser usados para avaliar o fenótipo e a função do CBSC.

Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Esta técnica permitirá aos pesquisadores isolar células-tronco de câncer de mama com máxima pureza e viabilidade para a realização de ensaios de caracterização funcional in vitro e in vivo. As células-tronco isoladas do câncer de mama também podem ser usadas para ajudar a elucidar os eventos moleculares que controlam a tumorigenicidade e a metástase, e para projetar estratégias terapêuticas para atingir essas células. Com pequenas modificações específicas para os tipos de células e tecidos de interesse, este método também pode ser aplicado a outros sistemas.Para gerar uma única suspensão celular a partir de uma cultura de células, lave uma cultura de células de câncer de mama 80% confluente com PBS e trate as células com uma solução de dissociação celular apropriada por cinco minutos em temperatura ambiente. Uma vez que as células tenham se destacado, adicione cinco mililitros de meio de cultura para neutralizar a solução de dissociação celular e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros para centrifugação. Ressuspenda o pellet em cinco mililitros de PBS para contagem.Após a contagem, centrifugue as células novamente e, em seguida, ressuspenda as células de uma só vez 10 a seis células por mililitro de tampão substrato ALDH. Para gerar uma única suspensão celular a partir de uma amostra de tecido, use lâminas cirúrgicas em uma técnica cruzada para picar o tecido tumoral em pedaços de aproximadamente um milímetro. Coloque as peças em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de tampão de dissociação.Sele o tubo com parafilme para uma incubação de 40 minutos a 37 graus Celsius em um agitador e sedimente os pedaços de tecido digeridos por centrifugação. Ressuspenda o pellet em cinco mililitros de tripsina usando uma pipeta de cinco mililitros e incube o tecido em banho-maria a 37 graus por cinco minutos. No final da incubação, pipetar vigorosamente o tecido várias vezes para liberar células individuais e adicionar meio DMEM/F-12 suficiente para elevar o volume total no tubo para 25 mililitros.Colete as células por centrifugação, ressuspenda o pellet em um mililitro de Displace DNAse e incube por cinco minutos em banho-maria a 37 graus Celsius. No final da incubação, traga o volume total para 10 mililitros com PBS. Misture as células pipetando e passe-as por um filtro de células de 40 mícrons em um tubo de 50 mililitros.Após a centrifugação, ressuspenda as células em cinco mililitros de PBS fresco para contagem. Para realizar um ensaio de formação de colônias, após a classificação, ressuspenda as células em meio completo e adicione o número apropriado de células-tronco de câncer de mama a cada um dos três tubos contendo dois mililitros de meio por tubo, rotulados um vezes 10 para o segundo, duas vezes 10 para o segundo ou cinco vezes 10 para as segundas células. Pipete para cima e para baixo cinco vezes para misturar completamente a suspensão celular e colocar as células em poços individuais de uma placa de seis poços.Gire suavemente a placa para obter distribuições celulares uniformes e coloque a placa na incubadora de cultura de células até que as colônias apareçam. No final da incubação, lave as células com um mililitro de PBS por poço e core as células com 500 microlitros de solução violeta a 0,05% por poço por 30 segundos. No final da incubação, lave os poços duas vezes com dois mililitros de água por poço para remover o excesso de corante, e conte e registre o número total de colônias por poço por microscopia de luz com uma ampliação de quatro ou 10 vezes.Para realizar um ensaio de mamosfera, após a classificação, ressuspenda as células em meio de mamosfera completo e coloque uma placa com uma densidade de assento de cinco vezes 10 das segundas células por centímetro quadrado de área por poço em uma placa de cultura de células de fixação ultrabaixa de 96 poços. Antes de contar o número de mamosferas por poço por microscopia de luz, coloque a placa na incubadora de cultura de células por cinco a 10 dias. Para configurar um modelo de cultura 3D, adicione cuidadosamente 50 microlitros de extrato de membrana basal a cada poço de uma placa de 96 poços sem bolhas e coloque a placa a 37 graus Celsius por uma hora para permitir que a solução polimerize.Adicione 100 microlitros de PBS após 10 minutos para evitar o ressecamento da camada de gel. No final da incubação, suspenda as células classificadas em cinco a 50 vezes 10 para as terceiras células por 200 microlitros de concentração de meio de cultura 3D e substitua o PBS em cada poço da placa de 96 poços por 200 microlitros de meio contendo células. Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura de células por 10 a 14 dias antes de avaliar as culturas quanto à formação de organoides.As células de câncer de mama humano que exibem atividade enzimática ALDH aumentada expressam altos níveis de CD44 e níveis baixos a negativos de expressão de CD24, e podem ser classificadas como células-tronco de câncer de mama. A proporção de células-tronco de câncer de mama na população em massa pode variar entre linhagens celulares ou pacientes e geralmente depende do estágio da doença, com o câncer de mama mais agressivo geralmente exibindo uma proporção maior de células-tronco de câncer de mama. A capacidade de uma única célula de câncer de mama de se auto-renovar e gerar colônias de 50 células pode ser avaliada por ensaios de formação de colônias.A capacidade das células-tronco do câncer de mama de se auto-renovarem em condições experimentais independentes de ancoragem pode ser avaliada por ensaios de mamosfera. A cultura de células de câncer de mama e extrato de membrana basal permite que as células-tronco do câncer de mama formem estruturas 3D que recapitulam as condições in vivo. Além disso, modelos de xenoenxerto de camundongo in vivo podem ser usados para entender as diferenças no crescimento, auto-renovação, diferenciação e / ou capacidade de iniciar o tumor das células-tronco do câncer de mama em comparação com células-tronco não relacionadas ao câncer de mama ou populações de células em massa.Após esse procedimento, as células-tronco isoladas do câncer de mama podem ser usadas em estudos transcriptômicos, cinômicos e metabolômicos. Este método oferece aos pesquisadores a oportunidade de explorar o papel das células-tronco do câncer de mama na iniciação do tumor, metástase, recorrência e resistência à terapia.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Células-tronco cancerosas (CSCs) foram identificados em uma série de tumores malignos. Neste protocolo, descrevemos um método de citometria de fluxo utilizando atividade aldeído desidrogenase e CD44 e CD24 expressão para isolar CSCs de xenoenxertos adenocarcinoma pancreático humano. Estas células viáveis ​​podem então ser utilizados em estudos funcionais e analíticos.

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Processamento de tecido primário do tumor cerebral para Ensaios de Células Tronco e Fluxo de Classificando

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Avaliação das Propriedades Stem Cell em carcinomas de células do ovário humano utilizar multi e individuais baseados em células Esferas Ensaios

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Ensaio da Mamomosfera Revela Estalo Induzido por Api5 em Linhas Celulares Epiteliais da Mama Não Tumorigênicas

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