Name: Enumeração de folículo preciso em ovários de rato adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprenda a contar folículos ovarianos com precisão em tecidos de rato adulto usando estereologia e contagem direta. Este método ajuda pesquisadores a avaliar reservas ovarianas e selecionar a técnica mais adequada para seus estudos.

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Este trabalho foi viabilizado através do Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo do Estado vitoriano e do Governo Australiano NHMRC IRIISS e apoiado por financiamento do National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) e do Australian Research Council (KJH #FT190100265). Os autores gostariam de reconhecer o apoio técnico da Plataforma monash de pesquisa animal, da Plataforma de Histologia Monash e da instalação Monash Micro Imaging.

Os ovários foram coletados de camundongos C57BL6J femininos. Todos os procedimentos e experimentos em animais foram realizados de acordo com o Código australiano de Prática para o Cuidado e Uso de Animais e aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Plataforma de Pesquisa Animal de Monash.
NOTA: Um agente quimioterápico mostrou esgotar oócitos folículos primordiais, conforme determinado por meio da estereologia11 e conta 12diretas12,13 foi utilizado neste relatório para comparar os dois métodos de contagem no mesmo animal. Camundongos do sexo feminino, de 8 semanas de idade (adulto jovem) foram pesados antes de uma única injeção intraperitoneal de 75 mg/kg/peso corporal de ciclofosfamatida, ou controle de veículo salino (n=5/grupo). Esta dose tem sido demonstrada como causando um esgotamento aproximado de 50% dos folículos primordiais, mas não relatada para causar morbidade ou mortalidade em camundongos14. Os ovários foram colhidos 48 horas após o tratamento. Um ovário de cada animal foi fixado em 10% (v/v) solução de formalina tamponada neutra por 24 horas, e o outro fixado na solução de Bouin por 24 horas. O tecido foi então incorporado em resina glicolmethacrilato e seção serial em 20 μm, ou em parafina e seção serial em 5 μm. Todos os tecidos estavam manchados com ácido periódico Schiff e hematoxilina.
1. Preparação histológica: fixação, processamento, incorporação e secção de ovários de rato
<ol><li>Dissecar os ovários do rato aparando o oviduto e toda a gordura circundante, sem danificar ou cortar o ovário em si. Se necessário, utilize um microscópio de dissecação e lâmina fina para esta etapa(Figura 1A).</li>
	<li>Fixar os tecidos imediatamente colocando em um pequeno tubo rotulado contendo fixação (estereologia) de Bouin ou fixação formalina (contagens diretas) por 24 horas(Figura 1B),antes de transferir tecidos para 70% de etanol. NOTA: A morfologia folículo é melhor conservada dentro do tecido ovariano fixo de Bouin, embutido na resina glicolmetatocrila(Figura 2).</li>
	<li>Processe ovários fixos inteiros e, em seguida, incorpore resina glicolmethacrilato para estereologia(Arquivo Suplementar 1), ou cera de parafina para contagens diretas usando um protocolo histológico padrão. ATENÇÃO: A resina é tóxica, por isso certifique-se de que todas as etapas de processamento de tecidos sejam realizadas em um capô de fumaça e as luvas sejam usadas o tempo todo.</li>
	<li>Use um microtome de resina especializada(Figura 1C)equipado com uma faca de vidro (Figura 1D) para cortar exaustivamente seções de resina glicolmetatocrilato grossa (por exemplo, 20 μm). Colete as seções em um intervalo regular (por exemplo, cadaseção 3) em slides de microscópio de vidro para estereologia.</li>
	<li>Use um microtome padrão para cortar seções finas de parafina (por exemplo, 4-6 μm). Colete seções de tecido em um intervalo regular (por exemplo, a cada 9seção) em um slide de microscópio de vidro para contagem direta de folículos.</li>
	<li>Colorisse os slides com ácido periódico Schiff e hematomatoxilina(Arquivo Suplementar 2).</li>
	<li>Tampar com DPX padrão para seções de parafina, ou DPX espesso para seções de resina glicolmethacrila(Figura 1E). ATENÇÃO: Resina de glicolmetatocrila A DPX é perigosa, por isso realize esta etapa no capô da fumaça. NOTA: Resina glicolmetatocrila DPX é extremamente viscoso. A mancha de vidro deve ser aderida firmemente pressionando-a para baixo com uma espátula para garantir que o DPX esteja uniforme e finamente disperso, e não há bolhas de ar presentes sob o deslizamento de cobertura(Figura 1F).</li>
</ol>2. Estimativa esterológica do número do folículo primordial usando o fracionado óptico
<ol><li>Ligue o computador, a unidade de multicontrole, a câmera e a fonte de luz dentro da configuração de estereologia e defina o objetivo do microscópio para uma baixa ampliação (por exemplo, 10x).</li>
	<li>Abra o software de estereologia.</li>
	<li>Coloque o primeiro slide com segurança no estágio do microscópio.</li>
	<li>Ajuste a exposição à luz verificando-se automaticamente em exposição no painel Configurações da câmera (Figura Suplementar 1A). Alternativamente, ajuste manualmente a exposição à luz.</li>
	<li>Use o joystick para localizar a primeira amostra de tecido e colocar a amostra em foco.</li>
	<li>Ajuste o balanço de branco, clicando em Mais Configurações (localizado no canto inferior direito do painel Configurações da câmera) e clique em Balanço de Branco e clique em Automático ( FiguraSuplementar 1B). Como alternativa, clique no botão Balanço branco adjacente ao botão Mais Configurações (ou Selecione Área em Mais Configurações),para definir o balanço de branco manualmente selecionando uma área branca na seção.</li>
	<li>Vá para o menu de soltar sondas e clique em Optical Fractionator Workflow. Em seguida, clique em Iniciar novo projeto e clique em OK.
	<ol>
<li>Se uma configuração de amostragem existente tiver sido salva, sob parâmetros de amostragem clique em Sim | ...eu não vou. e selecione a configuração de amostragem desejada.</li>
		<li>Caso não, clique em Não e digite manualmente as informações da seção serial(Figura Suplementar 1C) e defina a configuração do teste na etapa 2.13.</li>
	</ol></li>
	<li>Clique em Next, defina o microscópio como Baixa Ampliação e escolha a ampliação de 10x no menu suspenso.</li>
	<li>Clique em Nexte, em seguida, trace toda a seção ovariana - comece pela esquerda clicando ao redor da seção e no final, clique com o botão direito do mouse e escolha Contorno Próximo.</li>
	<li>Clique em Next, defina o microscópio para Alta Ampliação e escolha a ampliação de óleo 100x no menu suspenso.</li>
	<li>Coloque uma gota de óleo na seção de tecido na lâmina e mova o objetivo do microscópio para a ampliação de 100x.</li>
	<li>Ajuste a exposição à luz (como na etapa 2.4) e clique em Next.</li>
	<li>Configure os Parâmetros de Amostragem para definir a configuração da sonda. Aqui, o quadro de contagem foi definido para 47,5 μm x 47,5 μm (2.256,25 μm2) e o comprimento da etapa foi definido para 100 μm x 100 μm (10.000 μm2)(Figura Suplementar 2). Uma vez estabelecidos os parâmetros de amostragem, salve o modelo e reassente novamente durante as sessões de análise subsequentes na etapa 2.7.</li>
	<li>Clique em Iniciar a Contagem (Figura Suplementar 1D). Concentre-se no topo da amostra, clique em OK e comece a contar.</li>
	<li>Use o botão de focalamento para mover-se através da profundidade amostral de 10 μm e contar quaisquer folículos primordiais cujo núcleo oócito entra em foco. Clique em Seguir para passar para a próxima área.<ol>
<li>Classificar folículos como primordial se o oócito estiver cercado por células escânneas (achatadas) de granulosa, mas sem células de granulosa cuboidal(Figura 2A). NOTA: Os folículos primordiais são distintos dos folículos intermediários/transitórios, que compreendem uma combinação de células de granulosa cuboidal e escamosa(Figura 2B),e folículos primários, que são cercados predominantemente por células de granulosa cuboidal(Figura 2C). Estas classes folículos devem ser quantificadas separadamente.</li>
		<li>Só contam folículos em que o núcleo oócito é visível. O núcleo oócito deve aparecer dentro do quadro de contagem ou estar tocando as linhas de inclusão verde do quadro de contagem (Figura Suplementar 1E,F).</li>
		<li>Se o núcleo oócito ficar fora do quadro de contagem(Figura Suplementar 1G) ou tocar nas linhas vermelhas de exclusão do quadro de contagem, não conte este folículo.</li>
		<li>Ao avaliar o esgotamento do folículo primordial em resposta a um produto químico exógeno (por exemplo, quimioterapia), certifique-se de que todos os folículos contados sejam saudáveis e, portanto, tenham morfologia normal(Figura 2). Conte todos os folículos anormais ou atreóticos separadamente. Muitas vezes, a morte folículo é induzida por insultos como a quimioterapia, e a quantificação dos folículos atreticos deve ser obtida separadamente, a fim de distinguir entre folículos saudáveis e atrápticos, pois apenas folículos saudáveis compõem a reserva ovariana15.</li>
	</ol></li>
	<li>Uma vez que a contagem esteja completa nessa seção, faça um dos seguintes:<ol>
<li>Clique em Adicionar nova seçãoe, em seguida, retorne ao passo 2.3 para configurar a próxima seção para contar.</li>
		<li>Clique em I've Finished Counting para terminar a sessão. Retorne o objetivo para 10x, saia do software de estereologia e desligue a fonte de luz, câmera, unidade multicontrole e computador.</li>
	</ol></li>
	<li>Obtenha a soma do número do folículo bruto (Q) de cada seção de tecido amostrada de todo o ovário, em seguida, usando uma planilha, use a equação abaixo para obter o valor final de cada animal de réplica (N)4. <img alt="Equação N = Q (1 / f1) (1 / f2) (1 / f3); projeto de sistema óptico; relações de distância focal da lente" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1">onde: N = Número total estimado de folículos dentro do ovário. Q = Contagem de folículos primordiais brutos. f1 = Intervalo amostral. A cada 3ª seção foi amostrada assim <img alt="Equação de simplificação de fração, expressão algébrica, fórmula matemática." src="/files/ftp_upload/61782/61782equ02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> . f2 = Relação entre o quadro de contagem (área de amostra) e o stepper, calculado como <img alt="Equação da área amostral sobre a área do passo; símbolo de cálculo de proporção para fins educacionais." src="/files/ftp_upload/61782/61782equ03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3"> . Uma vez que a área amostral foi de 2256 μm2 (47,5 μm x 47,5 μm) e a área do passo foi de 10000 μm2 (100 μm x 100 μm), <img alt="Cálculo óptico, fórmula de distância focal, diagrama, f2 = 2256/10000, 1 / f2 = 10000/2256." src="/files/ftp_upload/61782/61782equ04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 4"> . f3 = Fração de seção ovariana amostrada. Desde que 10 μm da seção de 20 μm foi amostrada, <img alt="Equação de refração óptica, fórmula matemática no diagrama para cálculo da distância focal, f3 = 10/20." src="/files/ftp_upload/61782/61782equ05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 5"> . Portanto, <img alt="N = Q (3/1) (10000/2256) (20/10), fórmula de cálculo do tamanho do grão, análise de engenharia." src="/files/ftp_upload/61782/61782equ06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 6"> . NOTA: Este protocolo descreve como aplicar esses princípios de análises esterológicas utilizando um software de estereologia amplamente citado (Tabela de Materiais); no entanto, outros softwares esterológicos estão disponíveis. Os princípios aplicados durante as análises eseléológicas dos folículos ovarianos são os mesmos, independentemente do software utilizado para configurar os parâmetros. A estereologia é mais precisa quando 100 ou mais objetos são contados em um ovário de rato adulto4, pois isso dá um coeficiente de erro para a estimativa abaixo de 10%16. Os parâmetros amostrais aqui descritos foram otimizados para garantir que um mínimo de aproximadamente 100 objetos (ou seja, folículos primordiais, transitórios e primários) possam ser contados no controle de ovários C57BL6J adultos. Um estudo piloto pode ser realizado incluindo um pequeno tamanho amostral para estabelecer os parâmetros amostrais ideais, como o intervalo e o número de seções a serem analisadas e o número de dissetores ópticos dentro das seções amostradas17.</li>
</ol>3. Estimativa do número do folículo primordial por contagem direta de folículo ovariano
<ol><li>Coloque o slide do microscópio com segurança sob um microscópio de luz padrão e execute contagens diretas para obter o número do folículo primordial bruto.<ol>
<li>Classificar folículos como primordial se o oócito for claramente visível e estiver cercado por células de granulosa escânparadas (achatadas), mas sem células de granulosa cuboidal(Figura 2D). NOTA: Os folículos primordiais são distintos dos folículos intermediários/transitórios, que compreendem uma combinação de células de granulosa cuboidal e es es escânnea(Figura 2E),e folículos primários, que são cercados predominantemente por células de granulosa cuboidal(Figura 2F). Estas classes folículos devem ser quantificadas separadamente.</li>
		<li>Certifique-se de que todos os folículos contados são saudáveis e, portanto, têm morfologia normal(Figura 2). Conte todos os folículos anormais ou atreóticos separadamente, pois apenas folículos saudáveis compõem a reserva ovariana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativamente, tome fotomicógrafos múltiplos ou costurados de alta potência (por exemplo, 20x) de toda a seção de tecido ovariano para executar a contagem, abrindo os arquivos de imagem(s). Isso pode ser feito manualmente ou usando um scanner de slides automatizado.</li>
	<li>Obtenha a soma do número do folículo bruto (Q) de cada seção de tecido amostrada de todo o ovário no intervalo predeterminado. Multiplique este número pelo inverso da fração amostral para obter o valor final para cada animal de réplica (N), utilizando a equação abaixo. <img alt="Equação para calcular N usando Q e inverso de f₁; conceito de cálculo analítico." src="/files/ftp_upload/61782/61782equ07.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 7">onde: N = Número total estimado de folículos dentro do ovário. Q = Contagem de folículos brutos (de cada tipo individual, calculado separadamente). f1 = Intervalo amostral. Todas as 9seções foram amostradas <img alt="Equação que ilustra o princípio matemático de frações recíprocas, mostrada no formato da fórmula." src="/files/ftp_upload/61782/61782equ08.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 8"> assim. Portanto, <img alt="Equação de equilíbrio estático N = Q × (9/1), fórmula matemática." src="/files/ftp_upload/61782/61782equ09.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 9"> .</li>
</ol>

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<li>Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+primordial+and+nongrowing+follicle+counts+according+to+the+Stages+of+Reproductive+Aging+Workshop+%28STRAW%29+staging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Menopause%22%5BJournal%5D)">Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system.</a> Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).</li>
<li>Hansen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+reproductive+aging%3A+the+decline+in+ovarian+non-growing+follicle+number+from+birth+to+menopause%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause.</a> Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).</li>
<li>Sonigo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ovarian+follicle+counting+by+an+innovative+deep+learning+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13499(2018).</li>
<li>McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+iDISCO+and+CUBIC+tissue+clearing+and+lightsheet+microscopy+for+in+toto+analysis+of+the+adult+mouse+ovarydagger%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger.</a> Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).</li>
<li>Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+evaluation+of+murine+ovarian+follicles+using+a+modified+CUBIC+tissue+clearing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72(2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo fornece um protocolo passo-a-passo para a técnica padrão-ouro para enumerar folículos primordiais do rato, estereologia e o método mais comumente empregado de contagem direta de folículos. O tratamento quimioterápico foi utilizado para comparar e contrastar os resultados obtidos a partir desses dois métodos diferentes dentro do ovário esquerdo e direito do mesmo animal. Ambos os métodos revelaram alta variabilidade inter-animal em números de folículos primordiais. Um esgotamento significativo da reserva ovari...

Os oócitos imaturos e meioticamente presos armazenados dentro de folículos primordiais no ovário são a unidade de armazenamento da germe feminina e compõem a reserva ovariana vitalícia de um indivíduo. Os números de folículos primordiais diminuem naturalmente com a idade1, ou alternativamente, podem ser prematuramente esgotados após a exposição a produtos químicos exógenos, incluindo alguns fármacos e tóxicos ambientais no ar, alimentos e água2. Dado que o número primordial do folículo é finito, a quantidade e a qualidade dos folículos presentes dentro do ovário determinam em grande parte a fertilidade feminina e a saúde dos filhos. Assim, a quantificação precisa do número de folículos primordiais nas mulheres é essencial para avaliar os impactos fora do alvo de insultos exógenos na reserva ovariana.
Nas mulheres, a análise de todo o ovário geralmente não é possível, portanto, medidas não invasivas de substituto da reserva ovariana devem ser utilizadas em um ambiente clínico. O hormônio anti-Mϋllerian (AMH) é o biomarcador substituto mais utilizado clinicamente3. Os níveis de AMH do soro são frequentemente medidos em mulheres com idade materna avançada, ou antes e depois do tratamento do câncer, como a quimioterapia. No entanto, a AMH é produzida por folículos crescentes e não por folículos primordiais, e, portanto, os níveis de soro não informam sobre o número absoluto de folículos primordiais.
Com a ausência de métodos para determinar com precisão o número de folículos primordiais em mulheres in situ, contar folículos ovarianos em pequenos modelos animais, como roedores, continua sendo uma ferramenta de pesquisa essencial para avaliar o grau pelo qual insultos exógenos impactam nos folículos primordiais e, portanto, na fertilidade. Infelizmente, porém, os relatos ao longo da literatura de números de folículos primordiais em modelos de roedores são altamentevariáveis 4. Uma das principais razões para isso são as diferenças técnicas amplamente relatadas no método de contagem empregado. Predominantemente, existem duas técnicas diferentes descritas na literatura para enumerar folículos primordiais em camundongos. Estes incluem estereologia, que emprega o método de dissetor óptico fracionado, e contagem direta de folículos.
A estereologia é amplamente considerada o padrão-ouro, pois utiliza amostragem aleatória uniforme sistemática5, tornando-se o método mais preciso de quantificar o número de folículo primordial em todo o rato, ou ovários de ratos4,6,7. A estereologia é imparcial, pois explica a estrutura tridimensional do objeto de interesse8. Utilizando um método de dissetor/fracionado óptico, três níveis de amostragem são aplicados para quantificar folículos primordiais usando seções de tecido grosso (por exemplo, 20 μm) dentro de uma fração conhecida do ovário total do rato. Em primeiro lugar, o intervalo amostral é escolhido (por exemplo, cada 3seção) em um início aleatório (fração amostral 1, f1)4. As seções são então amostradas de forma sistemática e uniforme a partir deste ponto através de todo o ovário. Em seguida, um quadro de contagem imparcial é sobreposto sobre a seção ovariana e movido progressivamente ao longo de uma grade de contagem definida e aleatória (fração amostral 2, f2)8. Por fim, uma fração conhecida da espessura da seção é amostrada opticamente (por exemplo, 10 μm) e folículos dentro desta área são contados (fração amostral 3, f3)4. O número do folículo bruto é multiplicado pelo inverso dessas frações amostrais para obter o valor final. Este método requer treinamento especializado e equipamentos, incluindo um microscópio com um estágio motorizado conduzido por software stereológico. Os tecidos devem ser preservados em um fixador especializado de Bouin, e embutidos na resina glicolmetatocrila para permitir que seções de tecido grosso sejam cortadas usando um microtome de resina glicolmetatocrila com uma faca de vidro. Este método é projetado para explicar o encolhimento e deformação tecidual, para preservar melhor a estrutura morfológica tridimensional do ovário e dos folículos9.
A contagem direta de folículos é o método mais utilizado para contar folículos10. Fixativos mais comuns (ou seja, formalina) podem ser usados, seguidos de incorporação de cera de parafina e seção serial exaustiva usando um microtome padrão com uma espessura entre 4-6 μm. Os folículos são sistematicamente contados em toda a seção tecidual em um intervalo definido e multiplicados pelo inverso do intervalo amostral para obter a estimativa total do folículo. Este método é rápido, fácil, pode ser realizado usando tecidos arquivados, e preparado usando técnicas histológicas padrão. Requer apenas um microscópio leve com recursos de imagem padrão. No entanto, apesar dessas vantagens, a contagem direta de folículos carece da precisão e dos rigorosos parâmetros de contagem de estereologia, tornando-o mais propenso ao viés do investigador. Além disso, os tecidos podem sofrer encolhimento e deformação durante o processamento, interrompendo a integridade e a morfologia do ovário e dificultando a classificação e quantificação do folículo.
O objetivo deste artigo é descrever dois métodos comumente utilizados para avaliar quantitativamente o número de folículos primordiais nos ovários do rato: estereologia e contagem direta de folículos. Forneceremos protocolos detalhados para esses dois métodos e destacaremos alguns de seus pontos fortes e fracos, a fim de melhorar a reprodutibilidade em nosso campo e permitir que os pesquisadores tossem uma decisão informada do método de contagem mais adequado para seus estudos.

<table><tbody><tr><td>1-Butanol (HPLC)</td><td>Fisher Chemical</td><td>#A383-1</td><td></td></tr><tr><td>Álcool ácido</td><td>Amber Scientific</td><td>#ACDL</td><td></td></tr><tr><td>Bouin' s fixador</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#HT10132</td><td>Ácido pícrico 0,9% (p/v), formaldeído 9% (v/v), ácido acético 5% (p/v)</td></tr><tr><td>Ciclofosfamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C0768-5G</td><td></td></tr><tr><td>Dibutilftalato Poliestireno Xileno (DPX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#06522</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Amber Scientific</td><td>#ETH</td><td>Etanol 100%</td></tr> <tr><td>Micro Bisturi oftálmico de penas com cabo de alumínio</td><td>Designs para Vision</td><td>#FEA-745-SR</td><td>Lâmina de penas para dissecações (visto na Figura 1)</td></tr><tr><td>Fixador de formalina</td><td>Australian Biostain</td><td>#ANBFC</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula de vidro</td><td>Thermo Scientific</td><td>#MENCS22501GP</td><td>22 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Resina de glicometacrilato RM2165 micrótomo</td><td>Leica Microsystems</td><td>#RM2165</td><td></td></tr><tr><td>Glicolmetacrilato DPX</td><td>*fabricado internamente</td><td></td><td>*Misture 1,5 L de xileno; 800 g de pellets de poliestireno; 100mL de ftalato de dibutila por 3 semanas</td></tr><tr><td>Histolene</td><td>Trajan</td><td>#11031</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s hematoxilina</td><td>Amber Scientific</td><td>#MH</td><td></td></tr><tr><td>microscópio Olympus BX50</td><td>Olympus</td><td>#BX50</td><td>microscópio de campo claro equipado com objetiva de imersão em óleo seco e 100x (abertura numérica 1.3)</td></tr><tr><td>Óleo de imersão Olympus tipo-F</td><td>Olympus</td><td>#IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>Olympus TH4-200 fonte de luz</td><td>Olympus</td><td>#TH4-200</td><td></td></tr><tr><td>Cera</td> <td>de parafinaSigma-Aldrich</td><td>#03987</td><td></td></tr><tr><td>Ácido periódico</td><td>Trajano</td><td>#PERI1%</td><td>Ácido periódico 1%</td></tr><tr><td>Micrótomo rotativo CUT 4060</td><td>MicroTec</td><td>#4060R/F</td><td>Usado para cortar seções de parafina</td></tr><tr><td>Schiff' s reagente</td><td>Trajano</td><td>#SCHF</td><td></td></tr><tr><td>água da torneira de Scott</td><td>Amber Scientific</td><td>#SCOT</td><td>Carbonato de potássio, sulfato de magnésio, água</td></tr><tr><td>Sistema StereoInvestigator Stereological</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td>Inclui software StereoInvestigator, unidade de controle múltiplo, platina automática e joystick</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio Superfrost</td><td>Thermo Scientific</td><td>#MENSF41296SP</td><td>1 mm, 72 pcs</td></tr><tr><td>Technovit 7100 Sistema de incorporação de plástico</td><td>Emgrid Austrália</td> <td># 64709003</td><td>500 mL / 5 x 1 g / 40 mL</td></tr><tr><td>Technovit 3040 amarelo</td><td>Emgrid Austrália</td> <td># 64708805</td><td>100 g / 80 mL</td></tr></tbody></table>

enumeração de folículo preciso em ovários de rato adulto

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Mamíferos fêmeas sexualmente reprodutos nascem com todo o seu suprimento de oócitos. Oócitos imaturos e quiescentes são encontrados dentro de folículos primordiais, a unidade de armazenamento da germina feminina. Eles não são renováveis, assim seu número ao nascer e a taxa subsequente de perda dita em grande parte a vida fértil feminina. A quantificação precisa dos números de folículos primordiais em mulheres e animais é essencial para determinar o impacto de medicamentos e toxicantes na reserva ovariana. Também é necessário avaliar a necessidade e o sucesso das técnicas de preservação da fertilidade existentes e emergentes. Atualmente, não existem métodos para medir com precisão o número de folículos primordiais que compõem a reserva ovariana em mulheres. Além disso, a obtenção de tecido ovariano de animais grandes ou espécies ameaçadas para experimentação muitas vezes não é viável. Assim, os camundongos tornaram-se um modelo essencial para tais estudos, e a capacidade de avaliar números de folículos primordiais em ovários inteiros de camundongos é uma ferramenta crítica. No entanto, os relatos de números absolutos de folículos em ovários de camundongos na literatura são altamente variáveis, dificultando a comparação e/ou replicação de dados. Isso se deve a uma série de fatores, incluindo tensão, idade, grupos de tratamento, bem como diferenças técnicas nos métodos de contagem empregados. Neste artigo, fornecemos um guia instrutivo passo a passo para preparar seções histológicas e contar folículos primordiais em ovários de camundongos usando dois métodos diferentes: [1] estereologia, que conta com a técnica de dissetor fracionado/óptico; e [2] a técnica de contagem direta. Algumas das principais vantagens e desvantagens de cada método serão destacadas para que a reprodutibilidade possa ser melhorada no campo e para permitir que os pesquisadores selecionem o método mais adequado para seus estudos.

Utilizou-se um modelo bem caracterizado de esgotamento folículo, pelo qual foram administrados camundongos adultos jovens de uma única dose de quimioterapia ciclofosfamida, ou controle de veículo salino (n=5/grupo) e ambos os ovários foram colhidos de cada animal após 48 horas. Um ovário por animal foi preparado como descrito no Passo 1 para cada um dos dois métodos: estereologia ou contagem direta. O ovário esquerdo e direito de cada animal foi aleatoriamente atribuído a cada grupo. Esses dados mostram que, ao usar este...

Aqui, descrevemos, comparamos e contrastamos duas técnicas diferentes para a contagem precisa de folículos de tecidos ovarianos fixos do rato.

Enumeração de folículo preciso em ovários de rato adulto

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Esperamos que esses protocolos aprofundados ajudem a melhorar a reprodutibilidade em nosso campo, ao mesmo tempo em que permitem que os pesquisadores tomem uma decisão informada ao selecionar o método contábil para seus estudos. Como usa vários parâmetros de amostragem, a estereologia é altamente sensível e precisa. No entanto, as contagens diretas são mais rápidas e fáceis e podem ser realizadas em amostras preparadas com técnicas histológicas padrão.A estereologia é usada em estudos de biologia ovariana para avaliar o impacto de tóxicos nas reservas ovarianas. Também pode ser aplicado às ciências da vida para o estudo do rim e do cérebro. Familiarizar-se com a morfologia dos folículos requer experiência.O uso de estudos anteriores para definir a morfologia, juntamente com o estabelecimento de critérios padronizados de classificação, pode ajudar na consistência. Para estimar o número do folículo primordial por estereologia usando um fracionador óptico, ligue o computador, a unidade de controle múltiplo, a câmera e a fonte de luz dentro da configuração de estereologia e defina a objetiva do microscópio para uma ampliação baixa. Abra o software de estereologia e coloque a primeira l

accurate-follicle-enumeration-in-adult-mouse-ovaries

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este protocolo descreve a cultura primária / co-cultura de tecido ovariano rato, usando ovários de camundongos recém-nascidos e folículos ovarianos individuais de ratos pré-púberes. As técnicas de cultura de suportar o desenvolvimento de uma forma altamente fisiológico, que permita a investigação do efeito de agentes extrínsecos no ovário, e das interacções entre os folículos do ovário.

Cultura e Co-Culture of Mouse ovários e folículos ovarianos

Uma técnica altamente promissora para gerar tecido constrói sem usar matriz é a células de cultura em uma condição de microgravidade simulado. Usando um sistema rotativo de cultura, nós examinamos o crescimento do folículo ovariano e a maturação do oócito em termos de função oócito sob a condição de microgravidade simulado, morfologia, crescimento e sobrevivência do folículo.

In Vitro Crescimento do folículo pré-antral do Mouse sob microgravidade simulado

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliação não invasiva de competência no desenvolvimento de oócito realizada durante sua em vitro maturação da vesícula germinal à fase de metáfase II. Este método combina imagens de lapso de tempo com análises de rede neural e Velocimetria por imagem (PIV).

Uma identificação baseado em Rede Neural de ovócitos já crescido mentalmente competente ou incompetente do Mouse

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar os folículos nos ovários culturas de ratos jovens sem seccionamento serial. Usando a imunofluorescência todo órgão e tecido de compensação, seccionamento físico é substituído com seccionamento óptico. Este método de preparação da amostra e visualização mantém a integridade do órgão e facilita a quantificação automatizada de células específicas.

Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta

Culturas de tecido ovarianos podem ser usadas como modelos de atresia de folículo, ovulação e desenvolvimento do folículo e indicar mecanismos reguladores de processos dinâmicos de ovário.

Cultura do tecido ovariano Visualizar fenômenos no ovário de Mouse

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para imagens de ovários inteiros para análises quantitativas e qualitativas utilizando imunosscopia de montagem integral, microscopia multifotínica e visualização e análise 3D. Este protocolo acomoda um processamento de alto rendimento, confiável e repetível que é aplicável para toxicologia, diagnóstico clínico e ensaios genômicos da função ovariana.

Imunofluorescência total do ovário, compensação e microscopia multifotínica para análise quantitativa 3D da reserva ovariana em desenvolvimento em mouse

Este protocolo descreve um método preciso, barato, rápido e não tóxico para determinar o sexo do embrião suíno do dia 30 usando o método de PCR após moer um embrião em pó sem extração de clorofórmio fenol e purificação da coluna de DNA.

Precisas e Fenol DNA Sexagem gratuito do dia 30 de Porcina embriões por PCR

Um modelo ideal para estudar a biologia de células-tronco adultas é o folículo piloso de camundongo. Aqui apresentamos um protocolo para isolar diferentes populações de folículos pilosos, células-tronco e queratinócitos epidérmicos, empregando digestão enzimática da pele dorsal de camundongos seguida de análise FACS.

Isolando células-tronco do folículo piloso e epidérmico queratinócitos da Dorsal rato Pele

Este protocolo descreve a dissecção e imunocoloração de adultos Drosophila melanogaster tecidos do cérebro. Especificamente, este protocolo destaca o uso da Drosophila cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios como subconjuntos neuronal de exemplo que podem ser usados com precisão para descobrir princípios gerais subjacentes a muitos aspectos do desenvolvimento neuronal.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nós fornecemos um protocolo para o pH intracelular de uma linhagem de células-tronco epiteliais em tecido ovariano de Drosophila vivo de imagem. Descrevemos a métodos para gerar moscas transgênicas expressando um biosensor pH, mCherry::pHluorin, imagem o biosensor utilizando imagens de fluorescência quantitativa, gerar curvas padrão e converter valores de intensidade de fluorescência para valores de pH.

Métodos para o pH intracelular Imaging da linhagem de células-tronco do folículo em tecido ovariano de Drosophila

Aprenda a contar folículos ovarianos com precisão em tecidos de rato adulto usando estereologia e contagem direta. Este método ajuda pesquisadores a avaliar reservas ovarianas e selecionar a técnica mais adequada para seus estudos.

Enumeração de folículo preciso em ovários de rato adulto

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