Um modelo tridimensional de esferoides para estudar células-tronco de câncer de cólon
22 de janeiro de 2021
Este protocolo apresenta um novo, robusto e reprodutível sistema cultural para gerar e cultivar esferoides tridimensionais a partir de células de adenocarcinoma de cólon caco2. Os resultados fornecem a primeira prova de conceito para a adequação dessa abordagem para estudar a biologia das células-tronco do câncer, incluindo a resposta à quimioterapia.
Este novo método de culturas esferoides pode ser usado para estudar a tumorigenicidade para analisar a presença de diferentes populações de células-tronco cancerígenas e também pode ser bem aplicado através de tela de alta colocação para novas drogas. Trata-se de um sistema robusto e repetitivo para gerar um grande número de esferoides de tamanho homogêneo. Além disso, esses esferoides podem ser usados para estudar células-tronco cancerígenas.
Este método é criado para estudar a biologia crônica do câncer, mas pode ser facilmente criado para estudar outros cânceres alterando as condições de cultura 3D. Certifique-se de observar bolhas no meio, para não mover muito a placa durante a formação de esferoides e ter cuidado ao colher os esferoides no coador. Comece por pré-tratar os poços de uma placa de 24 poços com 500 micro litros de Solução anti-adesão por poço.
Depois de alguns segundos centrifugar a placa em rotor de balde balançando e enxaguar cada poço com 2 mililitros de meio basal quente. Observe a placa sob o microscópio para garantir que as bolhas tenham sido completamente removidas dos micro-poços. Se não forem observadas bolhas, enxágue os poços novamente antes de adicionar um mililitro de matriz de membrana de porão de DMEM quente meio para cada poço.
Para induzir a formação de esferoides, consulte a concentração desejada de células Caco-2 em uma camada mono 2D em um prato de 10 centímetros em DMEM suplementado com 10% de FBS e 1%antibióticos. Para a cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma atmosfera umidificada. Quando uma confluência de 80%, lave as células com cinco mililitros de PBS antes de tratar a cultura com dois mililitros de Trypsin-EDTA por dois a cinco minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Quando as células se separarem neutralizar a Trippsina com quatro mililitros de DMEM completos. Após a contagem, colete as células por centrifugação e resuspense a paleta no volume apropriado do meio de matriz de membrana de porão do DMEM para alcançar a concentração desejada das células em um mililitro de médio por poço. Adicione um mililitro de células a cada poço da placa pré-paga de 24 poços, seguido pela adição de um mililitro de matriz de membrana de porão DMEM médio para cada poço.
Após a semeadura, centrifufique imediatamente a placa e use um microscópio leve para verificar se as células foram distribuídas uniformemente pelos micro poços. Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura celular por 48 horas sem perturbar as células. Para colher os esferoides, no final da incubação, use uma pipeta sorológica e metade do supernazio em cada poço para desalojar suavemente os esferoides de seus micro poços.
Quando todos os esferoides tiverem sido destacados use a pipeta para transferir cuidadosamente as culturas 3D de cada poço para um coador reversível de 37 mícrons em cima de um tubo cônico de 15 mililitros. Lave cada poço três vezes com um mililitro de meio basal pré-armado por lavagem para coletar quaisquer esferoides restantes e adicione estes esferoides adicionais ao coador. Após a última lavagem verifique a placa sob o microscópio para confirmar que todos os esferoides foram removidos dos micro poços.
Em seguida, inverta o coador sobre um novo tubo de 15 mililitros e lave a parte inferior do coador com o meio de matriz de membrana de porão DMEM fresco para coletar os esferoides no tubo. Os spheróides estão subindo de 500 células demonstram o aumento mais homogêneo do tamanho ao longo do tempo. Com 500 e 600 células por esferoide determinam ser o número ideal de células sob as quais um bom crescimento e baixa variabilidade podem ser alcançados.
A adição da matriz de membrana do porão aumenta o crescimento esferoide e a homogeneidade. Na cultura de longo prazo, as células aparecem como densas multi camadas no terceiro dia. Enquanto células achatadas dispostas em camadas mono são claramente visíveis no dia 10.
Curiosamente, um lúmen aparece dentro dos esferoides a partir do quinto dia. Além disso, um claro aumento na proliferação de células nucleares células positivas células células positivas é observado nos dias cinco e sete que diminui até o dia 10. Surpreendentemente, o Caspace 3 ativado é observado em pouquíssimas células apenas nos dias três e cinco.
Enquanto altos níveis de expressão beta-catenin são observados em todos os pontos de tempo. O potencial dos esferoides para se diferenciar em anterosites é evidenciado por sua expressão alkalina fosfattase e séute carrier 2A5 mRNA. Além disso, esses esferoides expressam marcadores típicos de células-tronco do câncer e respondem a tratamentos de quimioterapia combinados rotineiramente administrados a pacientes com câncer colorretal.
Então os esferoides são compostos de diferentes populações celulares. Eles então podem ser bem usados para analisar respostas específicas das células a estímulos como refratários e, eventualmente, para respostas de medicamentos.
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Visão Geral
Este protocolo apresenta um sistema de cultura robusto para gerar esferoides tridimensionais a partir de células de adenocarcinoma de cólon Caco2. Este método permite o estudo da biologia das células-tronco cancerígenas e sua resposta à quimioterapia.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oncologia
- Biologia Celular
Antecedentes
- Compreender as células-tronco cancerígenas é fundamental para desenvolver terapias eficazes.
- Culturas de esferoides tridimensionais imitam ambientes tumorais in vivo.
- Este método pode ser adaptado para diversos tipos de câncer.
- Robustez e reprodutibilidade são essenciais para a validade experimental.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método confiável para o cultivo de esferoides a partir de células Caco2.
- Investigar a tumorigenicidade e as populações de células-tronco cancerígenas.
- Facilitar a triagem em alto rendimento de novas drogas.
Métodos Utilizados
- Pré-tratamento dos poços com Solução de Enxágue Antiaderente.
- Manuseio cuidadoso para evitar bolhas durante a formação de esferoides.
- Coleta de esferoides utilizando um filtro.
- Monitoramento das condições de cultura para crescimento ideal.
Resultados Principais
- Geração bem-sucedida de esferoides com tamanho homogêneo.
- Aplicabilidade comprovada para o estudo de células-tronco cancerígenas.
- Potencial para aplicações em triagem de fármacos.
- Adaptabilidade a outros tipos de câncer mediante modificação das condições de cultura.
Conclusões
- Este método fornece uma nova ferramenta para a pesquisa do câncer.
- Ele aprimora a compreensão da dinâmica das células-tronco cancerígenas.
- Estudos futuros podem aproveitar este sistema para o desenvolvimento de terapias.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo de esferoide tridimensional atende à necessidade crítica de sistemas pré-clínicos que recapitulam a heterogeneidade tumoral e os fenótipos de células-tronco cancerígenas (CSC), permitindo uma avaliação mais preditiva de alvos terapêuticos e respostas medicamentosas na pesquisa do câncer colorretal. Ao fornecer uma plataforma reprodutível para o enriquecimento prolongado de CSC e avaliação da resposta à quimioterapia, o método apoia esforços de validação precoce de alvos e identificação de compostos promissores com maior confiança translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da heterogeneidade das Células-Tronco Cancerígenas (CSC) e do potencial tumorigênico por meio de padrões diferenciais de proliferação e estruturas semelhantes a lúmen dentro de esferoides.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao enriquecer células-tronco cancerígenas que expressam marcadores estabelecidos, facilitando a redução de riscos mecanicistas em hipóteses terapêuticas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera esferoides de tamanho homogêneo a partir de entradas celulares definidas, criando um sistema padronizado para análise quantitativa da resposta a fármacos.
- Valor Operacional: Compatível com fluxos de trabalho de triagem de alto rendimento devido à robustez, reprodutibilidade e facilidade de colheita de esferoides utilizando métodos baseados em peneiras.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Demonstra a expressão de marcadores de CTCs e a resposta à quimioterapia combinada clinicamente relevante, permitindo a modelagem pré-clínica da resistência e sensibilidade ao tratamento.
- Valor Operacional: Mantém os fenótipos de CTCs durante cultivos de longo prazo, apoiando estudos longitudinais da eficácia de fármacos e dos mecanismos de recorrência tumoral.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a identificação de compostos promissores e a validação pré-clínica, especialmente para programas de oncologia focados em terapias direcionadas às células-tronco cancerígenas e nos mecanismos de resistência.
- Biologia da Descoberta: Facilita a elucidação de vias e a redução de riscos biológicos ao modelar nichos de Células-Tronco Cancerígenas (CSC) e respostas diferenciais a fármacos em um contexto tridimensional.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio da formação de esferoides com tamanho homogêneo, apoiando a triagem confiável de compostos frente a populações enriquecidas em CSC.
- Análises: Oferece leituras quantitativas por meio da expressão de marcadores de CSC, marcadores de proliferação (PCNA) e marcadores de apoptose (Caspase-3 ativada) para comparar condições de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar a resposta à quimioterapia em um sistema relevante para a doença, que reflete a heterogeneidade do adenocarcinoma colorretal.
- Reutilização Corporativa: Adaptável a outros tipos de câncer mediante modificação das condições de cultura tridimensional, posicionando-se como uma plataforma reutilizável em diversos programas de descoberta oncológica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao capturar a heterogeneidade tumoral impulsionada por CSCs e as propriedades funcionais de potencial de células-tronco ausentes em modelos 2D.
- Valor Operacional: Oferece reprodutibilidade e escalabilidade por meio do semeamento padronizado, pré-tratamento antiaderente e colheita baseada em peneiras, reduzindo a variabilidade na geração de esferoides.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção ao permitir a avaliação precoce de compostos direcionados a CSCs e mecanismos de resistência, reduzindo riscos biológicos em fases tardias.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos com base em dados de modulação de CSCs e resposta à quimioterapia obtidos a partir de um modelo fisiologicamente relevante.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em técnicas de cultivo celular tridimensional, incluindo tratamento de superfícies antiaderentes e manipulação cuidadosa para prevenir a formação de bolhas durante a iniciação dos esferoides.
- Depende do acesso à matriz da membrana basal (por exemplo, Matrigel) e ao equipamento padrão de cultivo celular, incluindo centrífugas, peneiras (37 mícrons) e microscópios invertidos para monitoramento.
- Necessita padronização entre equipes quanto à densidade de semeadura (500–600 células/esferoide) e ao tempo de incubação, para garantir homogeneidade e reprodutibilidade entre experimentos.
- A adaptação a outros tipos de câncer exige otimização da concentração da matriz da membrana basal e da duração do cultivo, com base na adesão específica da linhagem celular e na cinética de formação de esferoides.
- As limitações práticas incluem a necessidade de manipulação suave durante a colheita para evitar a desintegração dos esferoides e a variabilidade potencial no tempo de formação da luz entre diferentes lotes.
