Medindo atividade antifúngica volátil e não volátil de produtos de biocontrole

Este protocolo fornece um método para fazer comparações precisas lado a lado da eficácia relativa de compostos antifúngicos voláteis e não voláteis em diferentes estágios de crescimento fúngico. Este método é adequado para avaliar a atividade antifúngica de produtos derivados de plantas usados em formas secas ou líquidas que contêm uma ampla diversidade de moléculas. Este método pode fornecer informações valiosas sobre o modo de aplicação de produtos derivados de plantas e é particularmente adequado no campo do biocontrole.

Demonstrando o procedimento estará Valentina Gligorijevic, engenheira assistente do laboratório Sup'Biotech. Para a coleta de conídios, coloque três mililitros de 0,05% Tween 20 em uma cultura de micélio de trichoderma e use um ancinho para liberar os conídios dos conidióforos, tomando cuidado para não pressionar o micélio para evitar que as hifas sejam arrancadas. Quando todos os conídios tiverem sido liberados, use uma micropipeta para recuperar rapidamente e adicione a solução de conídios a um tubo de 15 mililitros para contagem.

Para preparar placas fúngicas, deposite 100 microlitros de esporos em uma concentração de três vezes 10 a seis esporos por mililitro em uma placa de Petri de nove centímetros contendo meio PDA e use uma espátula estéril para adicionar 10 gramas de esferas de vidro de dois milímetros de diâmetro à placa. Em seguida, agite suavemente a placa para frente e para trás e gire e gire a placa em segmentos de 90 graus até que ela tenha sido totalmente girada para distribuir uniformemente os esporos pela superfície do ágar. Em seguida, incube a placa a 30 graus Celsius até a análise de inibição do crescimento.

Para realizar um ensaio de inibição de contato com alho em pó, use uma espátula estéril para pesar a quantidade desejada de alho em pó em tubos individuais de 50 mililitros. para obter concentrações geralmente variando de 0,25 a 16 miligramas por mililitro. Adicione 10 mililitros de aproximadamente 45 graus Celsius PDA a cada tubo e inverta cuidadosamente cada tubo várias vezes para distribuir uniformemente o pó por todo o ágar.

Rapidamente, despeje as suspensões homogeneizadas em placas de Petri de cinco centímetros de diâmetro e deixe o ágar solidificar à temperatura ambiente. Para realizar um ensaio de inibição de contato, use um tubo de aço inoxidável estéril de cinco milímetros de diâmetro para traçar um círculo no centro do ágar nos pratos tratados com compostos antifúngicos e de controle e use um palito estéril para descartar os cilindros de ágar. Em seguida, use um novo tubo de aço inoxidável de cinco milímetros de diâmetro para traçar de 15 a 20 círculos aleatoriamente nas placas fúngicas e use palitos de dente estéreis para transferir cuidadosamente os esporos, hifas ou cilindros cobertos de micélio para as regiões vazias das placas de PDA.

Em seguida, retorne as placas para a incubadora de 30 graus Celsius. Para preparar uma placa para um ensaio de inibição antifúngica em fase de vapor, despeje 10 mililitros de meio PDA na tampa de uma placa de Petri de cinco centímetros de diâmetro contendo 10 mililitros de meio PDA contendo compostos antifúngicos ou meio PDA sozinho e deixe o ágar solidificar à temperatura ambiente. Usando um tubo centrífugo de 50 mililitros como ferramenta de calibração, faça um círculo de PDA no centro do ágar e use uma espátula estéril para remover o ágar ao redor do círculo.

Use um tubo de aço inoxidável estéril de cinco milímetros de diâmetro para traçar um círculo no centro do meio na tampa e use um palito estéril para descartar o cilindro do sem-fim. Em seguida, use um tubo de aço inoxidável estéril de cinco milímetros de diâmetro para fazer plugues aleatoriamente nas placas fúngicas preparadas e use um palito estéril para transferir cuidadosamente esporos, hifas ou tampões revestidos de micélio para as tampas das placas de ensaio. Nesta análise, a inibição do crescimento da espécie de trichoderma SBT 10-2018 desencadeada por três compostos antifúngicos foi avaliada usando ensaios de inibição de contato e fase de vapor, conforme demonstrado para cada estágio fúngico.

Uma maior sensibilidade dos esporos ao carbendazim foi observada em comparação com as primeiras redes de hifas e micélio quando o tricoderma e os compostos antifúngicos estavam em contato. Em contraste, o carbendozim não teve efeito antifúngico sobre o trichoderma quando o fungo foi colocado a uma distância do fungicida de acordo com a baixa volatilidade dessa substância. Quando o óleo essencial de timo vulgar foi usado como composto antifúngico, uma maior sensibilidade foi observada para esporos e hifas precoces em comparação com a inibição do crescimento do micélio a 0,025% do óleo essencial.

Como esperado, o óleo essencial de timo vulgar apresentou atividade antifúngica idêntica, independentemente da distância entre o fungo e o óleo. Quando o alho em pó foi usado, foi observada uma eficácia maior contra a germinação de esporos e alongamento precoce das hifas do que para o crescimento de micélio. Atenção especial deve ser dada durante a preparação da placa fúngica para garantir que os esporos sejam distribuídos uniformemente na superfície da placa de ágar para garantir resultados comparáveis.