Análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática

A peptoglicômica usa espectrometria de massa avançada combinada com análise de dados de bioinformática de alta potência para examinar a composição do peptidoglicano em detalhes. O uso de algoritmos de bioinformática permite a análise, extração e comparação de dados de espectrometria de massa em uma coleção de arquivos de dados simultaneamente, diminuindo a carga de trabalho e aumentando a precisão. Compreender as diversas variações e modificações do peptidoglicano tem implicações na compreensão dos processos celulares, incluindo crescimento e divisão, evasão imune do hospedeiro e resistência antimicrobiana.

Recomendamos preparar e analisar um pequeno subconjunto de amostras primeiro para se familiarizar com o protocolo e atuar como um projeto piloto para avaliar os parâmetros experimentais. Como o software de análise de dados de espectrometria de massa geralmente varia nas definições usadas ao descrever recursos e funções, a demonstração visual ajudará os usuários a aplicar esse protocolo em todas as plataformas. Para extração de peptidoglicano sacculi, ressuspenda os grânulos de células congeladas em aproximadamente um a 10 do volume de cultura original em fosfato de sódio 20 milimolar a quatro graus Celsius antes de adicionar a suspensão celular gota a gota para ferver 8% SDS em fosfato de sódio 20 milimolar a um volume final de um para um.

Mantenha uma fervura suave por 30 minutos a três horas com agitação para garantir a dissociação completa da membrana. A mistura resultante deve ser completamente límpida, sem aglomerados celulares ou viscosidade remanescentes. Quando a solução esfriar à temperatura ambiente, colete os sacculi por ultracentrifugação, seguida de cinco a sete lavagens em aproximadamente 50 mililitros de fosfato de sódio 20 milimolares em temperatura ambiente por lavagem até que o tampão de lavagem tenha uma concentração de SDS de aproximadamente 0,001% conforme determinado por corante colorimétrico.

Após a última lavagem, ressuspenda os saculi em 5 a 10 mililitros de fosfato de sódio a 20 milimolares em temperatura ambiente e complemente a amostra com 50 microgramas por mililitro de amilase, DNase e RNase em sulfato de magnésio 10 milimolar para uma incubação de uma hora com agitação ou nutação a 37 graus Celsius. No final da incubação, digerir a reação durante a noite com 100 microgramas por mililitro de pronase a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, após a ultracentrifugação, ferva a amostra por uma hora em 25 mililitros de 2% SDS e fosfato de sódio 20 milimolar em um vaporizador.

No final da incubação, lave a amostra cinco a sete vezes com 50 mililitros de água bidestilada à temperatura ambiente, conforme demonstrado. Quando a concentração de SDS atingir aproximadamente 0,001%, ressuspenda o pellet em quantidade suficiente de água bidestilada para obter uma suspensão de sacculi e lave o recipiente. Após armazenamento noturno a 80 graus Celsius negativos, liofilize a amostra congelada antes de diluir os sacículos a 10 miligramas de peptidoglicano por mililitro de concentração de água destilada duplamente.

Para análise LC-MS, inicie um novo projeto no software do instrumento e atribua os arquivos de dados LC-MS QTOF apropriados à condição experimental de interesse. Execute a extração de recursos recursivos em lote do assistente de processamento de dados e defina os filtros de processamento de dados para corresponder aos parâmetros das condições e instrumentação de LC-MS para identificar com precisão o grupo e verificar os picos de massa para carga que representam muropeptídeos individuais. Revise os resultados no final da extração de recursos.

Se um número significativo de recursos não for alinhado em um grupo, ajuste os parâmetros de filtragem recursiva para ampliar ou restringir a janela de detecção conforme necessário. Em seguida, exporte os dados como um arquivo de troca composto. Para análise de características espectrais diferenciais, inicie um novo projeto no software do sistema e siga as instruções para importação de dados.

Durante a análise de dados, selecione a significância e a alteração de dobra para análise diferencial e defina os dados da linha de base para a intensidade mediana em todos os arquivos de dados. Uma vez concluída a análise, examine as análises gráficas e estatísticas resultantes para identificar muropeptídeos que demonstrem uma mudança significativa de abundância entre as condições experimentais testadas. No navegador do projeto, clique com o botão direito do mouse nas várias análises e selecione uma opção de exportação para salvar os detalhes do recurso como um arquivo tsv.

Certifique-se de salvar várias análises para obter todos os dados relevantes. No software de análise diferencial, em interpretação de resultados, selecione o navegador ID, adicione uma biblioteca de estruturas de muropeptídeos esperadas e selecione parâmetros semelhantes, conforme demonstrado para a extração de recursos, para produzir uma anotação de muropeptídeo prevista para cada recurso identificado. Para confirmar manualmente a anotação de muropeptídeo prevista, compare os picos da razão massa-carga do cromatograma de espectrometria de massa em tandem com a relação massa-carga prevista de todas as possíveis fragmentações de uma estrutura de muropeptídeo conhecida.

Use um editor molecular para desenhar a estrutura de muropeptídeo prevista usando a ferramenta de fragmentação de massa para mostrar a relação massa-carga dos fragmentos de espectrometria de massa quando cada ligação é quebrada individualmente ou em combinação e, em seguida, compare todas as possíveis fragmentações da estrutura do muropeptídeo com o cromatograma de espectrometria de massa em tandem. Para confirmar a anotação do muropeptídeo, os picos da razão massa-carga de vários fragmentos devem ser encontrados no cromatograma de espectrometria de massa em tandem com uma janela mínima de alinhamento da relação massa-carga. Para avaliar as mudanças globais nas modificações de muropeptídeos, edite o arquivo tsv dos muropeptídeos de alta alteração de alta dobra estatisticamente significativos para incluir uma única coluna para cada modificação de muropeptídeo.

Preencha esta coluna com uma designação para cada muropeptídeo anotado e carregue o arquivo tsv modificado no Perseus. Em anotar linhas, clique em anotar linhas categoricamente e adicione arquivos de dados a cada parâmetro experimental. Em seguida, em teste, clique em dois testes de amostra para realizar o teste T de um aluno e clique em 1D para realizar a anotação 1D.

Uma maior sensibilidade de detecção de máquinas de espectrometria de massa, juntamente com um software de reconhecimento de pico de alta potência, melhorou a capacidade de isolar, monitorar e analisar composições de substâncias de amostras complexas em detalhes muito minuciosos. A associação de cada pico de massa para carga extraído dos dados de espectrometria de massa a um muropeptídeo específico é facilitada pela referência cruzada com um banco de dados de estruturas de muropeptídeos conhecidas e previstas. O cromatograma de espectrometria de massa em tandem de fragmentação para cada característica extraída pode ser comparado ao perfil de fragmentação do muropeptídeo proposto usando o banco de dados.

Gráficos de vulcões podem ser usados para destacar muropeptídeos que demonstram uma mudança estatisticamente significativa de alta magnitude de abundância entre as condições testadas. Quando examinados em conjunto, vários muropeptídeos que possuem a mesma modificação podem ser examinados quanto a uma tendência em direção a uma condição experimental e todo o grupo pode ser avaliado quanto à significância. Rastrear uma modificação de muropeptídeo dessa maneira pode identificar uma atividade enzimática específica que é afetada pelo parâmetro experimental.

Além disso, outliers dessa tendência podem revelar atividades enzimáticas com uma especificidade ou função biológica particular. Este procedimento examina as mudanças bioquímicas e as variações biológicas nos polímeros, fornecendo assim informações sobre a atividade enzimática que atua no PG in vivo. Examinar a composição do PG na verificação de detalhes ajudará na compreensão de estruturas celulares complexas, o que tem implicações para muitos processos fisiológicos críticos.