Name: Análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática. Este método computacional permite examinar a composição de peptidoglicanos em detalhe, auxiliando pesquisadores a compreender processos celulares bacterianos.

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Os autores gostariam de agradecer à Dra. Jennifer Geddes-McAlister e ao Dr. Anthony Clarke por suas contribuições no refinamento deste protocolo. Este trabalho foi apoiado por subvenções de funcionamento da CIHR concedidas à C.M.K (PJT 156111) e por um NSERC Alexander Graham Bell CGS D atribuído à E.M.A. Figuras foram criadas em BioRender.com.

<ol><li>Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+structure+and+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan structure and architecture.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).</li>
<li>Pazos, M., Peters, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan%5BTitle%5D)+AND+%22Sub-cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan.</a> Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).</li>
<li>Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+regulation+of+peptidoglycan+synthesis+to+bacterial+growth+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology.</a> Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).</li>
<li>Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+strategies+to+preserve+cell+wall+integrity+against+environmental+threats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2064(2018).</li>
<li>Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+pathogenic+staphylococci+so+lysozyme+resistant%3F+The+peptidoglycan+O-acetyltransferase+OatA+is+the+major+determinant+for+lysozyme+resistance+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).</li>
<li>Brott, A. S., Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+O-acetylation+as+a+virulence+factor%3A+its+effect+on+lysozyme+in+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system.</a> Antibiotics. 8 (3), 94(2019).</li>
<li>Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+assay+for+D-Ala-D-Lac%3A+A+key+intermediate+for+vancomycin+resistance+in+vancomycin-resistant+Enterococci%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci.</a> Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).</li>
<li>Arthur, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+vivo+incorporation+of+D-lactate+into+peptidoglycan+precursors+of+vancomycin-resistant+Enterococci%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).</li>
<li>Mardarowicz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolierung+und+Charakterisierung+des+Murein-Sacculus+von+Brucella%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Naturforsdig%22%5BJournal%5D)">Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella.</a> Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).</li>
<li>Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+of+the+murein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The composition of the murein of Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).</li>
<li>Glauner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+quantification+of+muropeptides+with+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography.</a> Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).</li>
<li>Anderson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycomics+reveals+compositional+changes+in+peptidoglycan+between+biofilm-+and+planktonic-derived+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa.</a> The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).</li>
<li>van der Aart, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+of+the+peptidoglycan+composition+in+Streptomyces+coelicolor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor.</a> Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290(2018).</li>
<li>Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+an+automated+analysis+of+bacterial+peptidoglycan+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).</li>
<li>Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+the+enzymes+catalyzing+the+O-acetylation+of+bacterial+cell+wall+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides.</a> Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).</li>
<li>Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+analysis+of+peptidoglycan+by+high-performance+anion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography.</a> Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).</li>
<li>Rusconi, F., Douard Valton, É, Nguyen, R., Dufourc, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+sodium+dodecyl+sulfate+in+microliter-volume+biochemical+samples+by+visible+light+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy.</a> Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).</li>
<li>Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+fragmentation+of+Escherichia+coli+sacculi+by+sonication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication.</a> Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+false+discovery+rate%3A+A+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%3A+Series+B+%28Methodological%29%22%5BJournal%5D)">Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li>
<li>Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+in+untargeted+metabolomics%3A+state+of+the+art+in+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23(2015).</li>
<li>Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+analysis+and+modeling+of+mass+spectrometry-based+metabolomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1D+and+2D+annotation+enrichment%3A+a+statistical+method+integrating+quantitative+proteomics+with+complementary+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data.</a> BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12(2012).</li>
<li>Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Staphylococcus+aureus+cell+wall+biosynthesis+by+desleucyl-oritavancin%3A+A+quantitative+peptidoglycan+composition+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278(2017).</li>
<li>Glauner, B., Höltje, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+pattern+of+the+murein+sacculus+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).</li>
<li>Espaillat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemometric+analysis+of+bacterial+peptidoglycan+reveals+atypical+modifications+that+empower+the+cell+wall+against+predatory+enzymes+and+fly+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).</li>
<li>Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+peptidoglycan+structural+parameters+in+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).</li>
<li>Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+structural+divergence+among+Thermus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Cell wall structural divergence among Thermus spp.</a> FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).</li>
<li>Torrens, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+peptidoglycans+from+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+recovered+from+chronic+and+acute+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 0868(2019).</li>
<li>Antignac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+structural+analysis+of+the+peptidoglycan+of+the+human+pathogen+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).</li>
<li>De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+composition+of+a+highly+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+strain.+The+role+of+penicillin+binding+protein+2A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muropeptides+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+their+role+as+elicitors+of+%CE%B2-lactam-antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+-+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).</li>
<li>Schumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan Structure.</a> Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).</li>
<li>Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amount+of+peptidoglycan+in+cell+walls+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Este protocolo descreve um método para purificar peptidoglicanos de culturas bacterianas, processo para detecção de LC-MS e analisar a composição usando técnicas de bioinformática. Aqui, nos concentramos em bactérias Gram-negativas e algumas pequenas modificações serão necessárias para permitir a análise de bactérias Gram-positivas.
A preparação de muropeptídeos tem permanecido praticamente a mesma desde que foi produzida pela primeira vezna década de 19609,11,15.<...

O peptidoglicano (PG) é uma característica definidora de bactérias que serve para manter a morfologia celular, ao mesmo tempo em que fornece suporte estrutural para proteínas e outros componentes celulares 1,2. A espinha dorsal do PG é composta pelo ácido N-acetil murâmico ligado ao β-1,4 (MurNAc) e N-acetilglucosamina (GlcNAc)1,2. Cada MurNAc possui um peptídeo curto ligado ao resíduo ᴅ-lactílico que pode ser reticulado com peptídeos adjacentes ligados ao dissacarídeo (Figura 1A,B). Essa reticulação produz uma estrutura semelhante a uma malha que abrange toda a célula e é frequentemente referida como um sáculo (Figura 1C). Durante a síntese de PG, precursores são gerados no citoplasma e transportados através da membrana citoplasmática por flippases. Os precursores são posteriormente incorporados à PG madura pelas enzimas transglicosilase e transpeptidase, que produzem as ligações glicosídica e peptídica, respectivamente3. No entanto, uma vez montadas, existem inúmeras enzimas produzidas pelas bactérias que modificam e/ou degradam o PG para realizar uma série de processos celulares, incluindo crescimento e divisão. Além disso, várias modificações do PG têm demonstrado conferir adaptações específicas à linhagem, condições de crescimento e estresse ambiental, que têm sido implicadas na sinalização celular, resistência antimicrobiana e evasão imune do hospedeiro4. Como exemplos, uma modificação comum é a adição de um grupo acetila C6 no MurNAc que confere resistência limitando o acesso às ligações glicânicas β-1,4 às enzimas lisozimas produzidas pelo hospedeiro que degradam PG 4,5,6. Em Enterococos, a substituição do ᴅ-Ala terminal da cadeia lateral do peptídeo por ᴅ-Lac confere maior resistência ao antimicrobiano, a vancomicina 7,8.
O procedimento geral de isolamento e purificação do PG permaneceu relativamente inalterado desde que foi descritona década de 19609. As membranas bacterianas são dissolvidas através de tratamento térmico com SDS, seguido de remoção enzimática de proteínas ligadas, glicolipídios e DNA remanescente. O sáculo intacto purificado pode ser posteriormente digerido nos componentes individuais por hidrólise da ligação β-1,4 entre GlcNAc e MurNAc. Essa digestão produz dissacarídeos GlcNAc-MurNAc com quaisquer modificações estruturais e/ou ligações cruzadas intactas e são chamados de muropeptídeos (Figura 1B).
A análise composicional do PG foi inicialmente realizada por separação por cromatografia líquida de alta pressão (CLAE) para purificação de cada muropeptídeo, seguida da identificação manual dos muropeptídeos10,11. Desde então, isso foi substituído pela cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS), que aumenta a sensibilidade de detecção e diminui a carga de trabalho manual de purificação de cada muropeptídeo individual. Entretanto, a demora e complexidade da identificação manual de muropeptídeos tem permanecido um fator limitante, reduzindo o número de estudos realizados. Nos últimos anos, com o surgimento de tecnologias "ômicas", a extração automatizada de recursos LC-MS tornou-se uma ferramenta poderosa, permitindo a rápida detecção e identificação de compostos individuais em amostras complexas de conjuntos de dados muito grandes. Uma vez identificadas as características, um software de bioinformática compara estatisticamente a variação entre as amostras por meio da análise diferencial, isolando diferenças mínimas entre o complexo conjunto de dados e exibindo-as graficamente ao usuário. A aplicação de softwares de extração de características para análise da composição de PG apenas começou a ser explorada 12,13,14 e acoplada à análise bioinformática 12. Ao contrário da análise proteômica, que se beneficia dos bancos de dados de proteínas prontamente disponíveis que predizem a fragmentação peptídica, permitindo a identificação totalmente automatizada, nenhuma biblioteca de fragmentação existe atualmente para peptidoglicômica. No entanto, a extração de características pode ser acoplada a bancos de dados estruturais conhecidos e previstos para prever a identificação de muropeptídeos12. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para o uso da extração de características baseada em LC-MS combinada com uma biblioteca de muropeptídeos para identificação automatizada e análise diferencial bioinformática da composição PG (Figura 2).

<table><tbody><tr><td><forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr>coluna <tr><td>de fase reversa C18 - Coluna de Peptídeos AdvanceBio (100 mm x 2,1 mm 2,7 &micro; m)</td> <td>Agilent</td><td></td><td>LC-MS aquisição de dados</td></tr><tr><td>Controlador de manto de aquecimento, Optichem</td><td>Fisher</td><td>50-401-788</td><td>para 4% de fervura SDS</td></tr><tr><td>Manto de aquecimento, 1000mL Hemisférico</td><td>Fisher</td><td>CG1000008</td><td>para 4%</td></tr><tr><td>SDS ferver Incubadora, 37&deg; C</td><td></td><td></td><td>para purificação de sacculi e preparação de amostras MS</td></tr><tr><td>Condensador Leibig, 300MM 24/40,</td> <td>Fisher</td><td>CG121805</td><td>para 4% de fervura SDS</td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Labconco</td><td></td><td>para liofilização de sacculi</td></tr><tr><td>Agitador Magentic</td><td>Fisher</td><td>90-691-18</td> para espectrômetro de massa de <td>fervura SDS a 4%</td></tr><tr><td>Q-Tof modelo UHD 6530</td><td>Aglient</td><td></td><td>LC-MS</td> aquisição de dados</tr><tr><td>filtros de microcentrífuga, Nanosep MF 0.2 &micro; m</td><td>Fisher</td><td>50-197-9573</td><td>limpeza da amostra antes da injeção de MS</td></tr><tr><td>Suporte de retorta</td><td>Fisher</td><td>12-000-102</td><td>para fervura SDS a 4%</td></tr><tr><td>Braçadeira de retorta</td><td>Fisher</td><td>S02629</td><td>para fervura SDS a 4%</td></tr><tr><td>frasco de fundo redondo - pirex de 1 litro Fisher</td><td></td><td>07-250-084</td><td>para fervura SDS a 4%</td></tr><tr><td>Sonicator modelo 120</td><td>Fisher</td><td>FB120</td><td>para purificação de sacculi</td></tr><tr><td>Sonicator - micro ponta</td><td>Fisher</td><td>FB4422</td><td>para purificação de sacculi</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td></td><td>sacculi etapas de lavagem</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge garrafas, Ti45</td><td>Fisher</td><td>NC9691797</td><td>sacculi etapas de lavagem</td></tr><tr><td>Abastecimento de água</td><td>Cidade</td><td></td><td>para condensador</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> refrigerado a água<tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemdraw</td><td>Cambridgesoft</td><td></td><td>editor molecular para previsão de fragmentação de muropeptídeos</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>listas de visualização de muropeptídeos anotados, abundância, padrões isotópicos, etc.</td></tr><tr><td>MassHunter Acquisition</td><td>Aglient</td><td></td><td>executando o instrumento QTOF</td></tr><tr><td>MassHunter Mass Profiler Professional</td><td>Aglient</td><td></td><td>bioinformática análise diferencial</td></tr><tr><td>MassHunter Personal Compound Database and Library Manager</td><td>Aglient</td><td></td><td>muropeptide m/z MS database</td></tr><tr><td>MassHunter Profinder</td><td>Aglient</td><td></td><td>extração de recursos</td></tr> <tr><td>recursivosMassHunter Análise qualitativa</td> Visualização <td>agliente</td><td></td><td>de cromatogramas MS e MS/MS</td></tr><tr><td>Prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td>Software gráfico</td></tr><tr><td>Perseus</td><td>Max Plank Institute of Biochemistry</td><td></td><td>1D annotation</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Fisher</td><td>A998-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amônio</td><td>Fisher</td><td>A637</td><td></td></tr><tr><td>Amilase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6380</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Fisher</td><td>BP168-1</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Fisher</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27001-500ML-R</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS mistura de ajuste - HP0321</td><td>Agilent</td><td>G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolisina de Streptomyces globisporus ATCC 21553</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Gás nitrogênio (>99% de pureza)</td><td>Praxair</td><td>NI 5.0UH-T</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfórico</td><td>Fisher</td><td>A242</td><td></td></tr><tr><td>Pronase E de Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Fisher</td><td>S0489</td><td></td></tr><tr><td>Borohidreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452890</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Fisher</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Sódio Fosfato (dibásico)</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio (monobásico)</td><td>Fisher</td><td>S369</td><td></td></tr><tr><td>Corantes-todos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9379</td><td></td></tr></tbody></table>

análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

O peptidoglicano é um importante componente da parede celular bacteriana e um alvo celular comum para antimicrobianos. Embora os aspectos da estrutura do peptidoglicano sejam bastante conservados em todas as bactérias, também há uma variação considerável entre Gram-positivos/negativos e entre espécies. Além disso, existem inúmeras variações, modificações ou adaptações conhecidas ao peptidoglicano que podem ocorrer dentro de uma espécie bacteriana em resposta à fase de crescimento e/ou estímulos ambientais. Essas variações produzem uma estrutura altamente dinâmica que é conhecida por participar de muitas funções celulares, incluindo crescimento/divisão, resistência a antibióticos e evitação de defesa do hospedeiro. Para entender a variação dentro do peptidoglicano, a estrutura geral deve ser quebrada em suas partes constitutivas (conhecidas como muropeptídeos) e avaliada para a composição celular geral. A peptidoglicômica usa espectrometria de massa avançada combinada com análise de dados bioinformáticos de alta potência para examinar a composição de peptidoglicanos em detalhes finos. O protocolo a seguir descreve a purificação de peptidoglicanos de culturas bacterianas, a aquisição de dados de intensidade de muropeptídeos através de um cromatógrafo líquido – espectrômetro de massas e a análise diferencial da composição de peptidoglicanos usando bioinformática.

O aumento da sensibilidade de detecção das máquinas MS, juntamente com o software de reconhecimento de pico de alta potência, melhorou a capacidade de isolar, monitorar e analisar composições de substâncias de amostras complexas em detalhes minuciosos. Utilizando esses avanços tecnológicos, estudos recentes sobre a composição de peptidoglicanos começaram a utilizar técnicas automatizadas de extração de características LC-MS 12,13,14,24 em detrimento de metodologias mais antigas baseadas em HPLC<su...

Este protocolo abrange uma análise detalhada da composição de peptidoglicanos usando cromatografia líquida, espectrometria de massas acoplada com extração avançada de recursos e software de análise bioinformática.

Análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

A peptoglicômica usa espectrometria de massa avançada combinada com análise de dados de bioinformática de alta potência para examinar a composição do peptidoglicano em detalhes. O uso de algoritmos de bioinformática permite a análise, extração e comparação de dados de espectrometria de massa em uma coleção de arquivos de dados simultaneamente, diminuindo a carga de trabalho e aumentando a precisão. Compreender as diversas variações e modificações do peptidoglicano tem implicações na compreensão dos processos celulares, incluindo crescimento e divisão, evasão imune do hospedeiro e resistência antimicrobiana.Recomendamos preparar e analisar um pequeno subconjunto de amostras primeiro para se familiarizar com o protocolo e atuar como um projeto piloto para avaliar os parâmetros experimentais. Como o software de análise de dados de espectrometria de massa geralmente varia nas definições usadas ao descrever recursos e funções, a demonstração visual ajudará os usuários a aplicar esse protocolo em todas as plataformas. Para extração de peptidoglicano sacculi, ressuspenda os grânulos de células congeladas em aproximadamente um a 10 do volume de cultura original em fosfato de sódio 20 milimolar a quatro graus Celsius antes de adicionar a suspensão celular gota a gota para ferver 8% SDS em fosfato de sódio 20 milimolar a um volume final de um para um.Mantenha uma fervura suave por 30 minutos a três horas com agitação para garantir a dissociação completa da membrana. A mistura resultante deve ser completamente límpida, sem aglomerados celulares ou viscosidade remanescentes. Quando a solução esfriar à temperatura ambiente, colete os sacculi por ultracentrifugação, seguida de cinco a sete lavagens em aproximadamente 50 mililitros de fosfato de sódio 20 milimolares em temperatura ambiente por lavagem até que o tampão de lavagem tenha uma concentração de SDS de aproximadamente 0,001% conforme determinado por corante colorimétrico.Após a última lavagem, ressuspenda os saculi em 5 a 10 mililitros de fosfato de sódio a 20 milimolares em temperatura ambiente e complemente a amostra com 50 microgramas por mililitro de amilase, DNase e RNase em sulfato de magnésio 10 milimolar para uma incubação de uma hora com agitação ou nutação a 37 graus Celsius. No final da incubação, digerir a reação durante a noite com 100 microgramas por mililitro de pronase a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, após a ultracentrifugação, ferva a amostra por uma hora em 25 mililitros de 2% SDS e fosfato de sódio 20 milimolar em um vaporizador.No final da incubação, lave a amostra cinco a sete vezes com 50 mililitros de água bidestilada à temperatura ambiente, conforme demonstrado. Quando a concentração de SDS atingir aproximadamente 0,001%, ressuspenda o pellet em quantidade suficiente de água bidestilada para obter uma suspensão de sacculi e lave o recipiente. Após armazenamento noturno a 80 graus Celsius negativos, liofilize a amostra congelada antes de diluir os sacículos a 10 miligramas de peptidoglicano por mililitro de concentração de água destilada duplamente.Para análise LC-MS, inicie um novo projeto no software do instrumento e atribua os arquivos de dados LC-MS QTOF apropriados à condição experimental de interesse. Execute a extração de recursos recursivos em lote do assistente de processamento de dados e defina os filtros de processamento de dados para corresponder aos parâmetros das condições e instrumentação de LC-MS para identificar com precisão o grupo e verificar os picos de massa para carga que representam muropeptídeos individuais. Revise os resultados no final da extração de recursos.Se um número significativo de recursos não for alinhado em um grupo, ajuste os parâmetros de filtragem recursiva para ampliar ou restringir a janela de detecção conforme necessário. Em seguida, exporte os dados como um arquivo de troca composto. Para análise de características espectrais diferenciais, inicie um novo projeto no software do sistema e siga as instruções para importação de dados.Durante a análise de dados, selecione a significância e a alteração de dobra para análise diferencial e defina os dados da linha de base para a intensidade mediana em todos os arquivos de dados. Uma vez concluída a análise, examine as análises gráficas e estatísticas resultantes para identificar muropeptídeos que demonstrem uma mudança significativa de abundância entre as condições experimentais testadas. No navegador do projeto, clique com o botão direito do mouse nas várias análises e selecione uma opção de exportação para salvar os detalhes do recurso como um arquivo tsv.Certifique-se de salvar várias análises para obter todos os dados relevantes. No software de análise diferencial, em interpretação de resultados, selecione o navegador ID, adicione uma biblioteca de estruturas de muropeptídeos esperadas e selecione parâmetros semelhantes, conforme demonstrado para a extração de recursos, para produzir uma anotação de muropeptídeo prevista para cada recurso identificado. Para confirmar manualmente a anotação de muropeptídeo prevista, compare os picos da razão massa-carga do cromatograma de espectrometria de massa em tandem com a relação massa-carga prevista de todas as possíveis fragmentações de uma estrutura de muropeptídeo conhecida.Use um editor molecular para desenhar a estrutura de muropeptídeo prevista usando a ferramenta de fragmentação de massa para mostrar a relação massa-carga dos fragmentos de espectrometria de massa quando cada ligação é quebrada individualmente ou em combinação e, em seguida, compare todas as possíveis fragmentações da estrutura do muropeptídeo com o cromatograma de espectrometria de massa em tandem. Para confirmar a anotação do muropeptídeo, os picos da razão massa-carga de vários fragmentos devem ser encontrados no cromatograma de espectrometria de massa em tandem com uma janela mínima de alinhamento da relação massa-carga. Para avaliar as mudanças globais nas modificações de muropeptídeos, edite o arquivo tsv dos muropeptídeos de alta alteração de alta dobra estatisticamente significativos para incluir uma única coluna para cada modificação de muropeptídeo.Preencha esta coluna com uma designação para cada muropeptídeo anotado e carregue o arquivo tsv modificado no Perseus. Em anotar linhas, clique em anotar linhas categoricamente e adicione arquivos de dados a cada parâmetro experimental. Em seguida, em teste, clique em dois testes de amostra para realizar o teste T de um aluno e clique em 1D para realizar a anotação 1D.Uma maior sensibilidade de detecção de máquinas de espectrometria de massa, juntamente com um software de reconhecimento de pico de alta potência, melhorou a capacidade de isolar, monitorar e analisar composições de substâncias de amostras complexas em detalhes muito minuciosos. A associação de cada pico de massa para carga extraído dos dados de espectrometria de massa a um muropeptídeo específico é facilitada pela referência cruzada com um banco de dados de estruturas de muropeptídeos conhecidas e previstas. O cromatograma de espectrometria de massa em tandem de fragmentação para cada característica extraída pode ser comparado ao perfil de fragmentação do muropeptídeo proposto usando o banco de dados.Gráficos de vulcões podem ser usados para destacar muropeptídeos que demonstram uma mudança estatisticamente significativa de alta magnitude de abundância entre as condições testadas. Quando examinados em conjunto, vários muropeptídeos que possuem a mesma modificação podem ser examinados quanto a uma tendência em direção a uma condição experimental e todo o grupo pode ser avaliado quanto à significância. Rastrear uma modificação de muropeptídeo dessa maneira pode identificar uma atividade enzimática específica que é afetada pelo parâmetro experimental.Além disso, outliers dessa tendência podem revelar atividades enzimáticas com uma especificidade ou função biológica particular. Este procedimento examina as mudanças bioquímicas e as variações biológicas nos polímeros, fornecendo assim informações sobre a atividade enzimática que atua no PG in vivo. Examinar a composição do PG na verificação de detalhes ajudará na compreensão de estruturas celulares complexas, o que tem implicações para muitos processos fisiológicos críticos.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Considerando coleta de saliva para uma futura aplicação clínica, um pirulito, como ultrafiltração sonda (LLUF) foi fabricada para caber na cavidade bucal humana. Análise directa da saliva não digerido por espectrometria de massa nanoLC-LTQ demonstraram a capacidade das sondas de LLUF para remover as proteínas grandes e proteínas de abundância elevadas, e fazer de baixa abundantes péptidos mais detectável.

Amostragem Peptidome saliva humana Indígena Usando uma sonda de Ultrafiltração Lollipop-Like: simplificar e melhorar a detecção Peptide de Espectrometria de Massa Clínica

A parede celular bacteriana é composta de peptidoglycan, uma rede macromolecular de fios de açúcar cruzados por peptídeos. A Cromatografia Líquida Ultra Performance fornece alta resolução e throughput para novas descobertas da composição peptidoglycan. Apresentamos um procedimento para o isolamento das paredes celulares (sacculi) e sua posterior preparação para análise via UPLC.

Isolamento e Preparação de Paredes Celulares Bacterianas para Análise Composicional por Cromatografia Líquida de Ultra Desempenho

O onipresente segundo mensageiro c-di-GMP controla o crescimento e o comportamento de muitas bactérias. Desenvolvemos uma nova tecnologia baseada em espectrometria de massa composta de captura para identificar e caracterizar bioquimicamente as proteínas de ligação c-di-GMP em praticamente qualquer espécie bacteriana.

Captura de Espectrometria de Massa Compound - uma ferramenta poderosa para identificar novos c-di-GMP efetoras Proteínas

Um protocolo de alto rendimento foi desenvolvido para purificação combinada de proteômica e glicômica e quantificação de LC-MS/MS no plasma. A análise de desamidação de motivos de glicosilação ligados a N foi específica para locais desglicosilados. A quantificação precisa de N-glicanos foi alcançada acoplando a separação de N-glicanos auxiliada por filtro à normalização da individualidade ao marcar com a estratégia de marcadores de hidrazida de glicano.

A Quantitative Glycomics e Proteomics Combinada estratégia de purificação

Massa phyloproteomics à base de espectrometria (MSPP) foi usado para digitar uma coleção de Campylobacter jejuni ssp. Doylei isola a nível da estirpe em comparação com digitação sequência multilocus (MLST).

subtipagem de<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolados Utilizando PhyloProteomics baseados em espectrometria de massa (MSPP)

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Um protocolo é descrito para a síntese manual de oligo-peptoids seguido por análise de sequência por espectrometria de massa.

Síntese e análise de espectrometria de massa de Oligo-peptoids

O enriquecimento de lipoproteínas bacterianas usando uma fase de tensoativo não-iônico, método de particionamento é descrito para utilização directa em ensaios TLR ou outras aplicações. Novos passos são detalhados para preparar tryptic lipopeptides N-terminal para caracterização estrutural por espectrometria de massa.

Enriquecimento de lipoproteínas bacterianas e preparação do N-terminal Lipopeptides de determinação estrutural por espectrometria de massa

Aqui, apresentamos a quantificação imparcial de ocupação acetilação e/ou succinylation proteína site-specific (estequiometria) de um proteome inteira através de uma análise ratiometric de modificações endógenas às modificações introduzidas após quantitativa química acilação usando anidridos rotulado de isótopo estáveis. Em combinação com a espectrometria de massa sensível aquisição de dados independente, obtêm-se medições de ocupação do local exato.

Quantificação de Estoicometria de Acetilação e Succinilação de Lisinas Proteicas em Sítios Específicos Usando Espectrometria de Massa de Aquisição de Dados Independente

Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem para identificar e quantificar os principais lipídios celulares em Saccharomyces cerevisiae. O método descrito para uma avaliação quantitativa das principais classes lipídicas dentro de uma célula de levedura é versátil, robusto e sensível.

Análise Quantitativa do Lipidome Celular de Saccharomyces Cerevisiae Usando Cromatografia Líquida Juntamente com Espectrometria de Massa de Tandem

A busca aberta permite identificar glycopeptídeos decorados com composições glican até então desconhecidas. Dentro deste artigo, uma abordagem simplificada para realizar buscas abertas e subsequentes pesquisas de gliocopeptídio focadas em glycan são apresentadas para amostras bacterianas usando Acinetobacter baumannii como modelo.

A aplicação de abordagens baseadas em pesquisa aberta para a identificação de Glycopeptides ligados ao Acinetobacter baumannii O

Aprenda análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática. Este método computacional permite examinar a composição de peptidoglicanos em detalhe, auxiliando pesquisadores a compreender processos celulares bacterianos.

Análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática

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