Dissecção assistida por transilluminação de etapas específicas do ciclo epitelial seminifero do rato para análises de imunostaining a jusante

Este método facilita a identificação e dissecção de segmentos tubários seminíferos específicos do estágio, permitindo o estudo de etapas muito específicas da espermatogênese. Os estágios do ciclo epitelial seminífero podem ser reconhecidos em túbulos frescos e não fixos e, portanto, podemos selecionar apenas os estágios de interesse para análises a jusante. Requer alguma prática para aprender a reconhecer os estágios com base em seus padrões de transiluminação, mas este protocolo deve garantir seu sucesso.

Demonstrando o procedimento estará Opeyemi Olotu, que é candidato a Ph.D em meu laboratório. Comece colocando um camundongo macho adulto de pelo menos 8 semanas de idade na posição supina e desinfetando o abdômen ventral com etanol a 70%. Use uma tesoura estéril para fazer uma incisão em forma de V na região pélvica abdominal e use uma pinça estéril para puxar a almofada de gordura do epidídimo para localizar os testículos.

Use uma tesoura para dissecar os testículos, colocando os tecidos em uma placa de Petri estéril de 100 milímetros com PBS à medida que são colhidos. Use uma tesoura de ponta fina para cortar uma fenda na túnica albugínea, a espessa folha fibrosa que encapsula os testículos, e use uma pinça para rasgar a túnica e forçar os túbulos para fora. Coloque os túbulos seminíferos descapsulados em uma nova placa de Petri e adicione PBS estéril suficiente para cobrir o fundo da placa.

Em seguida, use a pinça para separar suavemente os túbulos sem danificar os tecidos. Para a dissecção dos túbulos, cole o prato em um microscópio de dissecação e ligue a transiluminação. Use uma pinça fina para mover cuidadosamente os feixes de túbulos para se familiarizar com os padrões de absorção e dispersão de luz dos diferentes estágios.

Em seguida, use uma pinça com uma ponta em forma de gancho para levantar um túbulo de interesse e use uma tesoura de microdissecção para cortar um segmento de comprimento apropriado. Depois de cortar os segmentos do túbulo específicos do estágio, use uma pipeta para coletar um segmento de interesse em um volume de 10 microlitros de PBS e coloque o segmento em uma lâmina de microscópio. Pressione cuidadosamente uma lamínula de 20 por 20 milímetros no túbulo sem esmagar muito as células e coloque a lâmina no palco de um microscópio de contraste de fase.

Coloque um papel de filtro na borda da lamínula para facilitar a propagação das células em uma monocamada e use a objetiva de 40 vezes para verificar os estágios da célula. Uma vez que as células tenham formado uma monocamada redonda de ambas as extremidades do túbulo, mergulhe a lâmina em um recipiente de nitrogênio líquido por 10 segundos. Use um bisturi para retirar a lamínula das células e coloque imediatamente a lâmina em etanol a 90% por 2 a 5 minutos.

Em seguida, seque ao ar e guarde a lâmina em temperatura ambiente por vários dias. Para imunocoloração de montagem total dos túbulos seminíferos, use uma pipeta para transferir segmentos de interesse para um tubo cônico de 15 mililitros de PBS gelado no gelo. Depois de permitir que os segmentos sedimentem, remova cuidadosamente o PBS.

Adicione 10 mililitros de PBS fresco gelado e misture por inversão. Deixe os túbulos assentarem por alguns minutos antes de remover o sobrenadante novamente, conforme demonstrado. Quando todo o sobrenadante tiver sido removido, fixe os túbulos em 5 mililitros de paraformaldeído por cinco horas a 20 a 30 rotações por minuto a 4 graus Celsius.

No final da incubação, deixar os túbulos assentarem durante alguns minutos antes de lavar a amostra três vezes em PBS fresco a 4 graus Celsius durante 10 minutos por lavagem com rotação. Após a última lavagem, use uma pipeta de 1 mililitro para transferir 10 a 20 segmentos de túbulos fixos para um tubo inferior redondo de 2 mililitros. Quando os segmentos estiverem assentados, substitua o sobrenadante por 1 mililitro de 2%BSA e 10%FBS em PBSX para uma hora de incubação à temperatura ambiente e 20 a 30 rotações por minuto.

No final da incubação de bloqueio, lavar as amostras com 1 mililitro de PBSX. Antes de rotular os túbulos com 250 microlitros de anticorpo primário, dilua-o em 1%BSA em PBSX por duas horas em temperatura ambiente de 20 a 30 rotações por minuto. No final da incubação, lavar os túbulos três vezes em PBSX, conforme demonstrado, antes de rotular as amostras com 250 microlitros dos anticorpos secundários apropriados por uma hora, protegidos da luz à temperatura ambiente e de 20 a 30 rotações por minuto.

No final da incubação, lave os túbulos três vezes antes de decantar os túbulos em uma lâmina de microscópio em um pequeno volume de sobrenadante. Em seguida, use pontas de carregamento de gel para organizar os túbulos em tiras lineares e drenar o excesso de tampão. Em seguida, adicione 1 a 2 gotas de meio de montagem antes de montar o slide com uma lamínula.

Sob transiluminação, os estágios 7 a 8 parecem homogeneamente escuros porque contêm um grande número de espermátides alongadas totalmente condensadas que estão alinhadas na superfície apical do epitélio. Depois que os espermatozóides maduros são liberados no lúmen durante a espermiação, o túbulo parece muito pálido nos estágios 9 a 10 devido à ausência de espermátides alongadas condensadas dentro do epitélio. Esta zona pálida é seguida pela zona de ponto fraco, cuja aparência manchada se origina da organização de espermátides alongadas com cromatina condensada em feixes.

Esses feixes tornam-se muito proeminentes na zona de ponto forte subsequente. Os feixes de espermátides migram para os núcleos das células de Sertoli que estão localizados perto da lâmina basal, o que se reflete como uma aparência listrada dos túbulos do estágio 2 a 5 quando transiluminados. Os feixes finalmente se dispersam no estágio 6, e as espermátides alongadas condensadas se aproximam do lúmen para serem liberadas do epitélio no estágio 8.

O estágio exato do segmento do túbulo pode ser verificado com precisão por microscopia de contraste de fase das preparações de abóbora. A imunocoloração de preparações de abóbora estadiadas pode ser usada para estudar a expressão e localização de proteínas de interesse no epitélio seminífero. A coloração de montagem total do túbulo seminífero é normalmente usada para estudar os tipos de células que estão em contato com a membrana basal do epitélio seminífero, seja no lado tubular ou intersticial.

O método também pode ser usado para estudar células ou estruturas localizadas mais profundamente no epitélio, como a barreira hemato-testículo ou células germinativas pós-meióticas. Além da imunocoloração, podemos usar segmentos tubários em estágio para muitas outras análises a jusante, incluindo ensaios bioquímicos de RNA e proteínas, citometria de fluxo e cultura tubária ex vivo. Como esse método permite uma análise muito detalhada da espermatogênese, ele realmente fornece uma ferramenta útil para estudar todos os processos importantes necessários para a produção de espermatozóides e a fertilidade masculina.