Name: Dissecção assistida por transilluminação de etapas específicas do ciclo epitelial seminifero do rato para análises de imunostaining a jusante (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Aprenda a dissecção assistida por transiluminação de túbulos seminíferos de rato para análise de estágios específicos da espermatogênese. Este método permite identificar padrões de luz e realizar imunocoloração para estudar processos celulares.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios da Academia da Finlândia [315948, 314387 a N.K.]; Fundação Sigrid Jusélius [para N.K., J.T.]; Fundação Emil Aaltonen [para J.-A.M., T.L.]; Programa de Doutorado em Medicina Molecular de Turku [S.C.-M., O.O.].

A manutenção de ratos de laboratório e todos os experimentos animais foi feita de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes para o cuidado e uso de animais de laboratório na Universidade de Turku.
1. Preparação de túbulos seminiferos para microdisseção
<ol><li>Sacrifique um camundongo adulto (≥8 semanas de idade, teste 80-120 mgs dependendo da cepa e idade) via asfixia de CO2 seguida de deslocamento cervical. NOTA: O rato deve ser sexualmente maduro, e de preferência com pelo menos 8 semanas de idade. O padrão de transilluminação de camundongos juvenis difere do adulto porque a onda do epitélio seminifero ainda não foi totalmente estabelecida, e o tempo da primeira onda de espermatogênese é distinto21,22. A falta de espermatozoides alongados em camundongos machos de 4 semanas de idade impede seu uso para microdisseção assistida por transilluminação. Todas as cepas de camundongos que têm espermatogênese normal podem ser usadas.</li>
	<li>Pulverize o abdômen ventral com 70% de etanol. Abra a cavidade abdominopela usando uma tesoura estéril, fazendo uma abertura em forma de V.</li>
	<li>Puxando a almofada de gordura epidídil com fórceps estéreis, localize os testículos, disseque-os usando uma tesoura e coloque-os em uma placa de Petri estéril de 100 mm contendo PBS. NOTA: Para manter a esterilidade, certifique-se de que todos os labware e ferramentas cirúrgicas estejam estéreis.</li>
	<li>Usando tesouras finas decapsulam os testículos cortando uma fenda na tunica albuginea, a folha fibrosa grossa encapsulando o testículo. Em seguida, rasgar a tunica aberta usando um par de fórceps. Force os túbulos para fora pressionando com fórceps e descarte a tunica. NOTA: Ao descartar a tunica, pode ser benéfico para algumas aplicações a jusante que arteria testicularis seja removida juntamente com a tunica. Evite danificar os túbulos seminiferos.</li>
	<li>Mova os túbulos seminiferos para uma nova placa de Petri e despeje PBS estéril suficiente para cobrir o fundo da placa de Petri. Em seguida, puxe suavemente os túbulos, mas evite danificar os túbulos. NOTA: Muito estresse mecânico afetará o padrão de transilluminação e afetará a viabilidade do tecido e sua arquitetura celular. Os túbulos também podem ser processados para imunostainings de montagem inteira a partir deste ponto sem encenação (3B). Às vezes é suficiente definir o estágio retrospectivamente, incluindo anticorpos contra proteínas expressas na diferenciação de espermatogógonas, como SALL4, c-KIT e DNMT3A18,23. A densidade da espermatogonia é um indicador de estágio relativamente confiável(Figura 2).</li>
</ol>2. Microdisseção assistida por transilluminação
<ol><li>Coloque a placa de Petri sob um microscópio de dissecção firmemente, gravando-a no palco. NOTA: É importante gravar bem a placa de Petri para evitar seu movimento que poderia causar a mistura dos segmentos de túbulos seminiferos coletados.</li>
	<li>Para revelar o padrão de absorção de luz dos túbulos seminiferos em foco, certifique-se de que a amostra esteja iluminada de baixo e a luz passe pela amostra,ou seja, é transilluminada. NOTA: A quantidade de luz absorvida/dispersa é relativa ao nível de condensação de cromatina em espermatóides alongados e seu agrupamento dentro do túbulo seminifero: quanto mais condensado, mais luz é absorvida, ou seja,mais escura parece mais escura.</li>
	<li>Conheça o padrão de absorção de luz de diferentes estágios, conforme descrito na Figura 2, Figura 5A e Figura S1, movendo cuidadosamente feixes de túbulos usando fórceps finos. NOTA: Os estágios sempre seguem-se em uma ordem lógica, formando a onda de epitélio seminifero. No entanto, é importante saber que a direção da onda espermatogênica ocasionalmente se inverte e depois volta novamente (também conhecida como modulações4,9 ), àsvezescomplicando o procedimento. Além disso, o comprimento de cada etapa, em termos de quantos mm de túbulo, varia consideravelmente.</li>
	<li>Levante cuidadosamente o túbulo de interesse usando fórceps com ponta fisada e, em seguida, corte um segmento de comprimento apropriado usando uma tesoura de microdisseção (ver Vídeo Suplementar 1). Um gancho na ponta dos fórceps facilita o levantamento e a segurando um túbulo e ajuda a evitar espremê-lo. NOTA: O comprimento dos segmentos a serem cortados depende de aplicações a jusante. Para a coleta de pedaços de túbulos agrupados de um estágio específico para análise de proteína ou RNA12,13 (II-V, VII-VIII e IX-XI, Figura 5B) o comprimento é tipicamente de 2-5 mm. Quando a extração padrão de fenol-clorofórmio é usada, cerca de 200 ng de RNA podem ser derivados de 1 mm de túbulo. Para a coloração total dos segmentos de túbulos encenados, o comprimento dos segmentos deve ser de >5 mm. Para preparações de abóbora, o comprimento dos segmentos não deve exceder de 1 a 2 mm porque as células no meio do segmento podem não sair se for muito longo. Use uma balança mm sob a placa de Petri para uma medição precisa do comprimento do túbulo.</li>
</ol>3. Imunostaining de diferentes preparações
<ol><li>Preparação de abóbora: verificação de etapa e imunostaining NOTA: As peças de túbulos específicas do estágio podem ser esmagadas em um slide de microscópio com um vidro de cobertura para realizar análise morfológica de células vivas por microscopia de contraste de fase e imunostaining subsequente. Recomenda-se que um iniciante use esta abordagem para verificar as etapas ao se familiarizar com o método de microdissecção assistido pela transilluminação.<ol>
<li>Colete o segmento em um volume de 10 μL usando uma pipeta e mova-o para um slide de microscópio.</li>
		<li>Esmague o túbulo colocando um copo de cobertura (20 mm x 20 mm) cuidadosamente no túbulo. Como resultado, as células fluirão para fora do túbulo e formarão uma monocamada de célula viva. Coloque um papel filtro na borda do vidro de cobertura para facilitar a disseminação das células. Evite esmagar as células demais para mantê-las vivas.</li>
		<li>Monitore célula se espalhando sob um microscópio. Use um microscópio de contraste de fase em 40x objetivo para verificar o reconhecimento de estágio examinando os tipos de células presentes (Figura 2, Figura S2).</li>
		<li>Uma vez que as células tenham se espalhado para formar uma monocamada redonda de ambas as extremidades do túbulo, mergulhe o slide em um recipiente contendo nitrogênio líquido enquanto segura-o com fórceps. Mantenha-o submerso por 10 s. Alternativamente, coloque o slide em uma placa de gelo seca para congelar.</li>
		<li>Remova o vidro da tampa, desligando-o usando um bisturi.</li>
		<li>Sem demora, proceda com a fixação e coloque rapidamente o deslizamento em um recipiente com 90% de etanol por 2-5 min. NOTA: Certifique-se de que a preparação da abóbora não descongele antes de colocá-la em 90% de etanol. Outros fixativos também podem ser usados, como acetona, por 10 minutos.</li>
		<li>A seco ao ar e armazena à temperatura ambiente (RT) (até alguns dias) ou a -80 °C (longo prazo).</li>
		<li>Para imunostaining, pós-fixar as amostras em 4% de paraformaldeído (PFA) por 10 min na RT.</li>
		<li>Enxágüe em PBS e permeabilize com Triton X-100 de 0,1% em PBS por 5 min.</li>
		<li>Enxágüe em PBS e desenhe um anel de graxa em torno de cada amostra de abóbora.</li>
		<li>Adicione 50-100 μL de 10% BSA (albumina de soro bovino) em 0,1% Tween em PBS (PBST) dentro do anel de graxa e bloco amostras por 30 minutos na RT.</li>
		<li>Remova a solução BSA e incuba com um anticorpo primário diluído em 10% de BSA em PBST por 1 h no RT.</li>
		<li>Lave 3x por 5 min com PBST.</li>
		<li>Incubar com um anticorpo secundário diluído em 10% de BSA em PBST. NOTA: Para manchar os acroosos, as amostras podem ser incubadas com anticorpo de aglutina de amendoim rotulado por Rhodamina (PNA, 1:1000) em 10% BSA em PBST por 1 h na RT(Figura S3) em vez de anticorpos primários e secundários específicos.</li>
		<li>Lave 3x por 5 min cada com PBST, enxágue com PBS e monte com um montador contendo DAPI.</li>
	</ol></li>
	<li>Imunostaining integral de túbulos seminiferos NOTA: O protocolo abaixo descreve a coloração de montagem total para os segmentos de túbulos encenados (a partir da etapa 2.4). Se um pesquisador quiser realizar coloração de montagem integral sem encenação (a partir da etapa 1.5), preste atenção às notas em 3.2.1 e 3.2.7.<ol>
<li>Usando uma pipeta, transfira os segmentos de túbulos (da etapa 2.4) em PBS gelado para um tubo cônico de 15 mL e permita-lhes sedimentar no gelo. NOTA: Se usar túbulos não encenados a partir de 1,5., separe os túbulos em uma placa de Petri, pipetting para cima e para trás em uma placa inclinada várias vezes. Use uma pipeta de 1 mL com uma ponta de corte. Esta etapa visa abrir a estrutura do tecido. No entanto, evite muita tubulação, pois pode danificar os túbulos. A sedimentação dos túbulos levará algumas dezenas de segundos. Pequenos fragmentos de túbulos, células intersticiais e detritos celulares permanecem no supernante.</li>
		<li>Remova cuidadosamente o supernatante (SN) por pipetação ou com um aspirador. Adicione 10 mL de PBS gelado e misture por inversão.</li>
		<li>Deixe sedimentar e, em seguida, remova o SN como antes.</li>
		<li>Adicione 5 mL de 4% PFA e fixe por 5h em uma mesa rotativa (20-30 rpm) a +4 °C. NOTA: O tempo de fixação depende das proteínas de interesse e de sua localização subcelular. Para proteínas nucleares e citoplasmáticas, uma fixação de 2 h é tipicamente suficiente, no entanto, marcadores de membrana, como GFRα1 (receptor da família GDNF alfa 1; Figura 6A,B), beneficiar de uma fixação mais longa, até 6 h.</li>
		<li>Deixe sedimentar, remova o SN (PFA) como antes e enxágue brevemente adicionando 10 mL de PBS e invertendo o tubo.</li>
		<li>Deixe sedimentar, remova o SN como antes e repita a etapa de lavagem do PBS três vezes por pelo menos 10 minutos cada em uma mesa rotativa a +4 °C e continue com a coloração ou armazene a +4 °C. NOTA: Se as condições de trabalho forem estéreis e limpas, as amostras podem ser armazenadas e usadas por pelo menos algumas semanas. Alternativamente, adicione azida de sódio a uma concentração final de 0,02% (c/v) de uma solução de estoque de 2% para ajudar a preservar os túbulos antes de armazenar a +4 °C.</li>
		<li>Usando uma pipeta de 1 mL, mova 10-20 segmentos de túbulos fixos para um tubo de fundo redondo de 2 mL. Deixe sedimentar e remova o SN. NOTA: Se trabalhar com túbulos longos que não foram encenados, despeje os túbulos em uma placa de Petri e usando tesouras de microdisseção e segmentos de corte de fórceps de cerca de 5 a 20 mm. Segmentos muito longos se emaranharão durante o procedimento de coloração, enquanto segmentos muito curtos são facilmente perdidos.</li>
		<li>Adicione 1 mL de 2% BSA + 10% FBS (soro bovino fetal) em 0,3% Triton X-100 em PBS (PBSX). Bloqueie por pelo menos 1h em uma mesa rotativa (20-30 rpm) no RT.</li>
		<li>Enxágüe com 1 mL de PBSX, remova o SN por pipetação e adicione 250 μL de anticorpo primário diluído em 1% de BSA em PBSX (1:100-1:2000 diluição). Incubar por 2 h no RT ou durante a noite a +4 °C em uma mesa rotativa (20-30 rpm).</li>
		<li>Remova a solução de anticorpos por pipetação e enxágue os túbulos com 1 mL de PBSX como acima. Lave três vezes por 1h em PBSX em uma mesa rotativa (20-30 rpm) no RT. NOTA: Após esta primeira lavagem, a amostra pode ser deixada durante a noite a +4 °C, se necessário.</li>
		<li>Remova o SN e adicione 250 μL de anticorpo secundário diluído em 1% de BSA em PBSX (tipicamente diluição de 1:500 de um anticorpo rotulado fluorescente). Cubra em papel alumínio e incuba em uma mesa rotativa (20-30 rpm) no RT por 1h.</li>
		<li>Repita 3.2.10.</li>
		<li>Por fim, remova o SN e despeje os túbulos em um slide de microscópio. Separe suavemente e organize os túbulos em tiras lineares usando pontas de carregamento de gel. Escorra o excesso de tampão e adicione o meio de montagem e uma mancha de cobertura. NOTA: Evite secar os túbulos enquanto os organiza. A contra-coloração dos núcleos com DAPI não é necessária na maioria dos casos. Sele a borda da tampa com esmalte para evitar a secagem e a deterioração da amostra. Os slides podem ser armazenados por 1-2 semanas a +4 °C antes da imagem.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método de microdissecção assistido pela transilluminação que descrevemos acima permite uma abordagem orientada para o estágio para o estudo da espermatogênese. A espermatogênese é um processo altamente sincronizado, e todas as etapas-chave durante a diferenciação espermatogênica são reguladas e executadas de forma dependente de etapas, como comprometimento de diferenciação (nas etapas VII-VIII), início da meiose (VII-VIII), divisões meioticas (XII), início de alongamento esperscopado (VIII) e espermicidade (VIII)1,26,27. A análise orientada ao palco fornece uma ferramenta poderosa para estudar esses eventos particulares que se restringem a etapas específicas da espermatogênese e, portanto, encontradas apenas em estágios definidos do ciclo epitelial seminiferous. Dominar o método requer alguma prática e o uso de um microscópio de dissecção de boa qualidade e condições de iluminação adequadas são fundamentais para o sucesso. Implementar este método como parte do kit de ferramentas cotidiana tem a capacidade de melhorar muito o impacto e a relevância biológica da pesquisa sobre funções reprodutivas masculinas, permitindo uma dissecção mais precisa de eventos moleculares durante a espermatogênese.
Todas as cepas de camundongos WT que estudamos exibem um padrão de transilaminação semelhante e exibem associações celulares conservadas em estágios do ciclo epitelial seminiferous. Na condição de que a diferenciação espersiogênica das células germinativas não seja grosseiramente diferente dos camundongos WT, o mesmo também se aplica a todos os modelos de camundongos eliminados que estudamos. Além disso, pode ser aplicado a outras espécies que exibem arranjo segmentar longitudinal de etapas do ciclo epitelial seminifero7. No entanto, espécies com estágios não segmentais (como o humano) não podem ser utilizadas. Dado o papel essencial da condensação da cromatina na alongamento dos espermatóides na definição do padrão de transilluminação, é evidente que qualquer má regulação desse processo inevitavelmente implicará na implementação deste método. Em camundongos juvenis e adultos jovens (5-6 semanas) o padrão de transilluminação ainda não foi totalmente estabelecido e, portanto, apenas camundongos com mais de 8 semanas devem ser usados. Também é importante ter em mente que apertar e puxar os túbulos inevitavelmente implicará no padrão de transilluminação porque distorce a arquitetura celular dentro do epitélio seminiferous.
Os segmentos isolados de túbulos seminiferos também podem ser cultivados permitindo a observação ex vivo e a manipulação de processos acoplados à espermatogênese, incluindo a meiose. Para garantir a viabilidade do tecido e para evitar a degradação do RNA e da proteína, as amostras devem ser coletadas e processadas no máximo 2 horas após o sacrifício do camundongo. Para a cultura ex vivo de túbulos seminiferos, o tempo do sacrifício ao início da cultura não deve exceder 1 hora. A integridade dos fragmentos de túbulos pode normalmente ser mantida até 72 horas in vitro se colhida corretamente.
O estágio do ciclo epitelial seminifero pode ser verificado e ainda mais precisamente definido utilizando microcopia de contraste de fase das preparações de abóbora16. A microscopia é realizada em células vivas, o que fornece uma dimensão adicional na análise e permite a observação de organela ou movimentos celulares em estágios específicos de espermatogênese28,29,30. A microscopia de contraste de fase fornece um estágio exato para a imunossuagem subsequente, que permite uma análise muito detalhada da expressão proteica e da dinâmica de localização durante a espermatogênese, incluindo alterações específicas do estágio.
Enquanto as células são liberadas do contexto epitelial em preparações de abóbora, imunossuagens de montagem total de segmentos de túbulos permitem o estudo de células espermatogênicas em seu ambiente fisiológico. Portanto, os preparativos de montagem inteira podem fornecer uma melhor visualização da arquitetura do túbulo seminiferante e seus contatos intercelulares do que imunostaining em seções transversais. É importante ressaltar que a encenação assistida pela transilação dos segmentos de túbulos antes da imunossuagem torna a abordagem ainda mais poderosa, incluindo informações sobre o estágio específico de um determinado segmento. A coloração de montagem total é uma ferramenta particularmente útil para o estudo de células na periferia de túbulos seminiferos, como células myoid peritubulares, macrófagos peritubulares e espermatogonia, mas também pode abrir novas percepções sobre pesquisas sobre células germinativas médias e pós-meióticas.

A diferenciação das células germinativas masculinas da espermatogonia diploide para a espermatozoide haploide madura, ou seja,a espermatogênese, é um processo complexo que ocorre no epitélio dos túbulos seminiferos nos testículos de um indivíduo sexualmente maduro1. Descendentes mitóticos da espermatogonia A1 primeiro dividem-se cinco vezes para expandir a população comprometida com a diferenciação, em seguida, entram em meiose como espermatocitotas que, em última análise, dão origem a espermatoides haploides. A diferenciação de espermatozoides redondos em espermatozoides, ou seja,espermagênese, envolve mudanças complexas na morfologia celular, incluindo compactação nuclear e construção de estruturas específicas de esperma, como o acrossomo e o flagelo. No camundongo, todo o processo de espermatogênese leva 35 dias para completar2,3.
Em qualquer local, o epitélio seminifero hospeda até cinco coortes de células germinativas diferenciadoras, além das células germinais/progenitoras e as células somáticas sertoli1. As células germinativas diferenciadoras formam camadas concêntricas da composição da qual é previsível, e as células haploides em um dado passo de desenvolvimento sempre associam-se a certos tipos de espermatotocrócitos e espermatogonia4,5. Portanto, qualquer seção transversal de um túbulo hospeda coortes de células germinativas de uma composição constante. Essas associações celulares específicas são definidas como os estágios do epitélio seminifero. Os estágios em si não apresentam estados estagnados como pontos de verificação, mas desenvolvem-se continuamente à medida que a diferenciação das coortes de células germinativas progride em sincronia1,2,6. Em camundongos, existem 12 estágios (I-XII)2 que são dispostos de forma segmental ao longo do eixo longitudinal do túbulo seminifero, e seguem-se em uma ordem lógica formando assim a onda de epitélio seminifero, ou onda espermatogênica7,8,9 (Figura 1). A conclusão da espermatogênese leva quatro ciclos, e camadas hierárquicas ou coortes de células germinativas diferenciadas dentro de qualquer seção transversal de túbulo seminiferou são temporalmente um ciclo seminiferous separados um do outro. O comprimento do ciclo é dependente de espécies e no camundongo cada ciclo leva 8,6 dias10.
Os estágios podem ser identificados com base na composição celular e organização do epitélio seminifero nas seções de testítio histológico5 (Figura 1 e Figura 2). No entanto, a análise histológica é trabalhosa, demorada e requer fixação e coloração, e não pode, portanto, ser aplicada ao tecido vivo. É importante ressaltar que o estadiamento também pode ser realizado em tecido vivo sob um microscópio de dissecção, aproveitando padrões distintos de absorção/dispersão de luz exibidos por diferentes estágios do ciclo(Figura 2). A capacidade de cada estágio de absorver e dispersar a luz é relativa ao nível de condensação de cromatina de espermatâmicos pós-meioticos tardios que qualquer estágio hospeda e a embalagem dessas células em feixes7,11. A diferenciação de espermatozoides, ou seja,a espermagogênese, é ainda dividida em 16 etapas de desenvolvimento, incluindo 8 passos de espermatização redonda (passo 1-8) e 8 passos de alongamento da espermicidade (passos 9-16) de diferenciação(Figura 1). Os espermatozoides alongados do passo 9-11 (estágio IX-XI) exibem apenas um baixo nível de condensação de cromatina, resultando em baixa quantidade de luz sendo absorvida. A condensação da cromatina começa na etapa 11 de espermatozoides (estágio XI), e os espermatóides alongados do passo 15-16 (estágio IV-VIII) contêm cromatina totalmente condensada e, portanto, exibem absorção máxima de luz(Figura 3). A cromatina precisa ser condensada para ser bem embalada na cabeça do esperma. Fatores adicionais que contribuem para o padrão de absorção de luz são a localização de espermatozoides alongados dentro do epitélio (basal vs. apical) e agrupamento de espermatóides alongados (pronunciados nos estágios II-V)11 (Figura 3). Os feixes são vistos como pontos no meio dos túbulos e como listras nas bordas sob um microscópio de dissecção e quanto mais condensado a cromatina, mais escura a mancha/listra11.
Este artigo descreve o uso do método de microdisseção assistido pela transilação para o isolamento de segmentos de túbulos seminiferos representando estágios específicos do ciclo epitelial seminifero. Uma vez isolados, os segmentos de túbulos encenados podem estar sujeitos a diversas análises a jusante, incluindo análises bioquímicas de RNA e proteínas12,13,14,15,citometria de fluxo16,cultura do túbulo ex vivo 17 e imunostaining18. Aqui também fornecemos protocolos detalhados a jusante para preparar monocamadas esmagadas de segmentos de túbulos encenados para análise morfológica de células vivas e imunostainings subsequentes, bem como imunostainings de montagem inteira de segmentos de túbulos. O fluxo de trabalho em poucas palavras descrita na Figura 4.
O método de microdisseção assistido pela transilluminação permite identificação e isolamento precisos de células germinativas em etapas específicas de diferenciação graças à composição celular sincronizada dos estágios. É importante ressaltar que também permite o estudo de eventos dependentes de estágio durante a espermatogênese no tecido vivo. Dada a falta de modelos in vitro escaláveis para espermatogênese, este método também tem uma vantagem única de permitir estudos de desenvolvimento e toxicológicos direcionados a curto prazo em segmentos de túbulos específicos do palco ex vivo12,17. Embora descrevamos o método aqui para o camundongo, o mesmo procedimento pode ser aplicado a qualquer espécie de mamífero com arranjo longitudinal e segmental de estágios epiteliais seminiferosos, como o rato4,7,15,19,20.

<table><tbody><tr><td>albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>vidro de cobertura 20x20 mm</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td>11961988</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico Falcon 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>soro bovino fetal (FBS)</td><td>Caneta de graxa Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>(ImmEdge)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>lâmina de microscópio Superfrost Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>Parafolmaldeído (PFA)</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (100 mm)</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>11503387</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>aglutinina de amendoim marcada com rodamina (PNA)</td><td>Vector Laboratories</td><td>RL-1072</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr></tbody></table>

dissecção assistida por transilluminação de etapas específicas do ciclo epitelial seminifero do rato para análises de imunostaining a jusante

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

A espermatogênese é um processo de diferenciação único que, em última análise, dá origem a um dos tipos celulares mais distintos do corpo, o espermatozoide. A diferenciação das células germinativas ocorre nos bolsões citoplasmáticos de células somáticas de Sertoli que hospedam de 4 a 5 gerações de células germinativas simultaneamente e coordenam e sincronizam seu desenvolvimento. Portanto, a composição dos tipos de células germinativas dentro de uma seção transversal é constante, e essas associações celulares também são conhecidas como estágios (I-XII) do ciclo epitelial seminiferous. É importante ressaltar que os estágios também podem ser identificados a partir de túbulos seminiferos intactos com base em suas características diferenciais de absorção/dispersão de luz reveladas pela transilação, e o fato de que os estágios se seguem ao longo do túbulo em uma ordem numérica. Este artigo descreve um método de microdissecção assistido pela transilação para o isolamento de segmentos de túbulos seminiferos representando estágios específicos do ciclo epitelial seminifero do rato. O padrão de absorção de luz de túbulos seminiferos é primeiro inspecionado sob um microscópio de dissecção, e, em seguida, segmentos de túbulos representando estágios específicos são cortados e usados para aplicações a jusante. Aqui descrevemos protocolos de imunossuagem para preparações de abóbora específicas para o estágio e para segmentos de túbulos intactos. Este método permite que um pesquisador se concentre em eventos biológicos que ocorrem em fases específicas da espermatogênese, fornecendo assim uma ferramenta única para estudos de desenvolvimento, toxicológicos e citológicos de espermatogênese e mecanismos moleculares subjacentes.

Este protocolo descreve a microdisseção assistida pela transilação de segmentos de túbulos seminiferos adultos representando estágios específicos do ciclo epitelial seminiferante, e tipos de células, e posterior imunossuagem de preparações de abóbora e segmentos de tubulações intactas.

Dissecção assistida por transilluminação de etapas específicas do ciclo epitelial seminifero do rato para análises de imunostaining a jusante

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

Este método facilita a identificação e dissecção de segmentos tubários seminíferos específicos do estágio, permitindo o estudo de etapas muito específicas da espermatogênese. Os estágios do ciclo epitelial seminífero podem ser reconhecidos em túbulos frescos e não fixos e, portanto, podemos selecionar apenas os estágios de interesse para análises a jusante. Requer alguma prática para aprender a reconhecer os estágios com base em seus padrões de transiluminação, mas este protocolo deve garantir seu sucesso.Demonstrando o procedimento estará Opeyemi Olotu, que é candidato a Ph.D em meu laboratório. Comece colocando um camundongo macho adulto de pelo menos 8 semanas de idade na posição supina e desinfetando o abdômen ventral com etanol a 70%. Use uma tesoura estéril para fazer uma incisão em forma de V na região pélvica abdominal e use uma pinça estéril para puxar a almofada de gordura do epidídimo para localizar os testículos.Use uma tesoura para dissecar os testículos, colocando os tecidos em uma placa de Petri estéril de 100 milímetros com PBS à medida que são colhidos. Use uma tesoura de ponta fina para cortar uma fenda na túnica albugínea, a espessa folha fibrosa que encapsula os testículos, e use uma pinça para rasgar a túnica e forçar os túbulos para fora. Coloque os túbulos seminíferos descapsulados em uma nova placa de Petri e adicione PBS estéril suficiente para cobrir o fundo da placa.Em seguida, use a pinça para separar suavemente os túbulos sem danificar os tecidos. Para a dissecção dos túbulos, cole o prato em um microscópio de dissecação e ligue a transiluminação. Use uma pinça fina para mover cuidadosamente os feixes de túbulos para se familiarizar com os padrões de absorção e dispersão de luz dos diferentes estágios.Em seguida, use uma pinça com uma ponta em forma de gancho para levantar um túbulo de interesse e use uma tesoura de microdissecção para cortar um segmento de comprimento apropriado. Depois de cortar os segmentos do túbulo específicos do estágio, use uma pipeta para coletar um segmento de interesse em um volume de 10 microlitros de PBS e coloque o segmento em uma lâmina de microscópio. Pressione cuidadosamente uma lamínula de 20 por 20 milímetros no túbulo sem esmagar muito as células e coloque a lâmina no palco de um microscópio de contraste de fase.Coloque um papel de filtro na borda da lamínula para facilitar a propagação das células em uma monocamada e use a objetiva de 40 vezes para verificar os estágios da célula. Uma vez que as células tenham formado uma monocamada redonda de ambas as extremidades do túbulo, mergulhe a lâmina em um recipiente de nitrogênio líquido por 10 segundos. Use um bisturi para retirar a lamínula das células e coloque imediatamente a lâmina em etanol a 90% por 2 a 5 minutos.Em seguida, seque ao ar e guarde a lâmina em temperatura ambiente por vários dias. Para imunocoloração de montagem total dos túbulos seminíferos, use uma pipeta para transferir segmentos de interesse para um tubo cônico de 15 mililitros de PBS gelado no gelo. Depois de permitir que os segmentos sedimentem, remova cuidadosamente o PBS.Adicione 10 mililitros de PBS fresco gelado e misture por inversão. Deixe os túbulos assentarem por alguns minutos antes de remover o sobrenadante novamente, conforme demonstrado. Quando todo o sobrenadante tiver sido removido, fixe os túbulos em 5 mililitros de paraformaldeído por cinco horas a 20 a 30 rotações por minuto a 4 graus Celsius.No final da incubação, deixar os túbulos assentarem durante alguns minutos antes de lavar a amostra três vezes em PBS fresco a 4 graus Celsius durante 10 minutos por lavagem com rotação. Após a última lavagem, use uma pipeta de 1 mililitro para transferir 10 a 20 segmentos de túbulos fixos para um tubo inferior redondo de 2 mililitros. Quando os segmentos estiverem assentados, substitua o sobrenadante por 1 mililitro de 2%BSA e 10%FBS em PBSX para uma hora de incubação à temperatura ambiente e 20 a 30 rotações por minuto.No final da incubação de bloqueio, lavar as amostras com 1 mililitro de PBSX. Antes de rotular os túbulos com 250 microlitros de anticorpo primário, dilua-o em 1%BSA em PBSX por duas horas em temperatura ambiente de 20 a 30 rotações por minuto. No final da incubação, lavar os túbulos três vezes em PBSX, conforme demonstrado, antes de rotular as amostras com 250 microlitros dos anticorpos secundários apropriados por uma hora, protegidos da luz à temperatura ambiente e de 20 a 30 rotações por minuto.No final da incubação, lave os túbulos três vezes antes de decantar os túbulos em uma lâmina de microscópio em um pequeno volume de sobrenadante. Em seguida, use pontas de carregamento de gel para organizar os túbulos em tiras lineares e drenar o excesso de tampão. Em seguida, adicione 1 a 2 gotas de meio de montagem antes de montar o slide com uma lamínula.Sob transiluminação, os estágios 7 a 8 parecem homogeneamente escuros porque contêm um grande número de espermátides alongadas totalmente condensadas que estão alinhadas na superfície apical do epitélio. Depois que os espermatozóides maduros são liberados no lúmen durante a espermiação, o túbulo parece muito pálido nos estágios 9 a 10 devido à ausência de espermátides alongadas condensadas dentro do epitélio. Esta zona pálida é seguida pela zona de ponto fraco, cuja aparência manchada se origina da organização de espermátides alongadas com cromatina condensada em feixes.Esses feixes tornam-se muito proeminentes na zona de ponto forte subsequente. Os feixes de espermátides migram para os núcleos das células de Sertoli que estão localizados perto da lâmina basal, o que se reflete como uma aparência listrada dos túbulos do estágio 2 a 5 quando transiluminados. Os feixes finalmente se dispersam no estágio 6, e as espermátides alongadas condensadas se aproximam do lúmen para serem liberadas do epitélio no estágio 8.O estágio exato do segmento do túbulo pode ser verificado com precisão por microscopia de contraste de fase das preparações de abóbora. A imunocoloração de preparações de abóbora estadiadas pode ser usada para estudar a expressão e localização de proteínas de interesse no epitélio seminífero. A coloração de montagem total do túbulo seminífero é normalmente usada para estudar os tipos de células que estão em contato com a membrana basal do epitélio seminífero, seja no lado tubular ou intersticial.O método também pode ser usado para estudar células ou estruturas localizadas mais profundamente no epitélio, como a barreira hemato-testículo ou células germinativas pós-meióticas. Além da imunocoloração, podemos usar segmentos tubários em estágio para muitas outras análises a jusante, incluindo ensaios bioquímicos de RNA e proteínas, citometria de fluxo e cultura tubária ex vivo. Como esse método permite uma análise muito detalhada da espermatogênese, ele realmente fornece uma ferramenta útil para estudar todos os processos importantes necessários para a produção de espermatozóides e a fertilidade masculina.

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Research

JoVE Journal

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