Duas abordagens citométricas de fluxo de detecção de superfície de ligante NKG2D para distinguir células-tronco de subpopulações a granel em leucemia mielóide aguda
21 de fevereiro de 2021
Apresentamos dois protocolos de coloração diferentes para detecção de ligantes NKG2D (NKG2DL) em amostras de leucemia mielóide aguda primária humana (LMA). A primeira abordagem é baseada em uma proteína de fusão, capaz de reconhecer todos os ligantes conhecidos e potencialmente ainda desconhecidos, enquanto o segundo protocolo conta com a adição de múltiplos anticorpos anti-NKG2DL.
Este protocolo mostra duas maneiras distintas de detectar NKG2DLs na superfície das células AML. A técnica fornece um método de coloração rápido e fácil de usar para detectar todos os NKG2DLs conhecidos e possivelmente desconhecidos. Este método permite a separação de células-tronco leucêmicas de células AML a granel, o que torna possível caracterizar ainda mais essas células.
Comece descongelando a biotina e os tubos de proteína de fusão NKG2D à temperatura ambiente. Gire rapidamente o pó NKG2D FC, depois adicione 500 microliters de PBS para reconstituir o pó e misture completamente usando uma micropipette P-1000. Adicione 100 microliters da proteína de fusão NKG2DL a um tubo de biotina para obter uma concentração final de 10 microgramas por mililitro, e misture a solução completamente com uma micropipette P-100.
Para descongelar as células AML, remova o criovial contendo LMA primária do armazenamento de nitrogênio líquido e coloque-a imediatamente em um banho de água de 37 graus Celsius. Mova suavemente o tubo para frente e para trás na água, permitindo que o conteúdo do frasco descongele até que haja apenas um pequeno cristal de gelo. Transfira imediatamente as células descongeladas para o tubo médio contendo e enxágue o frasco usando um mililitro de meio.
Centrifugar as células a 300 vezes G por 10 minutos e descartar o supernatante sem perturbar a pelota. Lave as células com cinco mililitros de meio RPMI contendo 10% DE FCS e repita a centrifugação. Resuspengem a pelota celular com tampão de coloração a uma concentração final de 0,5 vezes 10 para a sétima célula por mililitro.
Em seguida, transfira 100 microliters da suspensão celular para uma cultura celular 96 bem placa de fundo U e centrifugar a placa a 300 vezes G por 10 minutos. Descarte o supernatante sem perturbar a pelota. Prepare uma mistura mestre de proteína de fusão NKG2D biotinilada para que as células sejam resuspengiadas em um volume final de 50 microliters por poço com uma concentração final de NKG2D de 10 microgramas por mililitro por poço.
Adicione a mistura mestre preparada e resuspenja as pelotas celulares com uma pipeta de 200 microliter. Incubar e centrifugar a placa como descrito no manuscrito do texto. Prepare uma mistura mestra usando streptavidin PE para que as células sejam resuspendidas em um volume final de 50 microliters.
Adicione a mistura mestra às células e resuspenja as pelotas com uma pipeta multicanal de 300 microliter. Depois de centrifugar a placa e descartar o supernascer, use uma micropipette multicanal de 300 microlitrais para resuspencar as pelotas celulares em 200 microliters de tampão de coloração mais 7-AAD. Em seguida, analise as células usando um dispositivo de citometria de fluxo.
As amostras de LMA analisadas são positivas para CD34 e NKG2DL, mas também existem subpopulações negativas, com quatro populações diferentes no total. A estratégia típica de gating começa com a seleção da população principal de células através de seu FSC e SSC. Doublets e células mortas são excluídos na análise a jusante.
Os portões são ajustados usando controles FMO para garantir a identificação adequada das células positivas. As intensidades de fluorescência das células positivas para CD34 versus NKG2DL são destacadas aqui. As células AML positivas para CD34 mostram uma expressão superficial mais baixa de NKG2DL, indicando que a expressão NKG2DL está associada à falta de caule.
Três amostras primárias de LMA demonstraram eventos 19,8, 49,8 e 89,4% positivos para a coloração da proteína de fusão contra 20,4, 50,4 e 90,6% para a coloração de anticorpos anti-NKG2DL agrupadas. Por outro lado, a coloração de ligas simples mostrou uma gama de eventos positivos de até 92%, com os percentuais variando de acordo com o ligante. Ao tentar este método, é muito importante ser rápido ao descongelar as células LMA primárias, pois elas são frágeis e podem morrer facilmente durante esta etapa.
Após a realização deste protocolo, uma espécie de célula baseada no sinal NKG2DL pode ser realizada para investigar melhor as populações.
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Visão Geral
Este protocolo apresenta dois métodos de coloração distintos para detectar ligantes do NKG2D (NKG2DLs) em amostras primárias humanas de leucemia mieloide aguda (LMA). As técnicas permitem a separação de células-tronco leucêmicas das células de LMA em massa para caracterização adicional.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Oncologia
Contexto
- Os ligantes do NKG2D são importantes para o reconhecimento imune no câncer.
- A leucemia mieloide aguda (AML) apresenta desafios na caracterização celular.
- Os métodos atuais podem não distinguir eficazmente as células-tronco leucêmicas.
- Novos protocolos de coloração podem aumentar as capacidades de detecção.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver protocolos de coloração eficientes para a detecção de NKG2DL.
- Facilitar a separação de células-tronco leucêmicas das células AML em massa.
- Aprimorar a caracterização de amostras de AML.
Métodos Utilizados
- Utilização de uma proteína de fusão para reconhecer NKG2DLs.
- Aplicação de múltiplos anticorpos anti-NKG2DL.
- Descongelamento e reconstituição de biotina e proteína de fusão NKG2D.
- Mistura de soluções para obter as concentrações desejadas para coloração.
Resultados Principais
- Ambos os protocolos detectam efetivamente NKG2DLs conhecidos e desconhecidos.
- É realizada a separação de células-tronco leucêmicas das células AML em massa.
- Os métodos são fáceis de usar e rápidos.
- É possível uma caracterização aprimorada das células AML.
Conclusões
- Novos protocolos de coloração melhoram a detecção de NKG2DLs.
- Esses métodos podem auxiliar na compreensão da biologia da LMA.
- Pesquisas futuras podem se basear nessas técnicas para obter insights terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Distinguir as células-tronco leucêmicas das populações principais de LMA continua sendo um desafio crítico na validação de alvos e no desenvolvimento de modelos pré-clínicos. A capacidade de isolar subpopulações negativas para NKG2DL com propriedades de células-tronco permite a desmistificação mecanicista de hipóteses terapêuticas e reforça a confiança preditiva em fluxos de trabalho iniciais de descoberta. Essa abordagem orienta diretamente o triagem de portfólios ao identificar sistemas relevantes para a doença com maior potencial tumorigênico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante o isolamento de células-tronco leucêmicas com base na expressão de NKG2DL na superfície celular.
- Valor Operacional: Oferece um método rápido e de fácil utilização para distinguir subpopulações com características de células-tronco de células de LMA diferenciadas.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação biológica por meio da validação funcional das propriedades de células-tronco em frações negativas para NKG2DL.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas de citometria de fluxo para comparar a expressão de NKG2DL entre abordagens de marcação específicas para ligantes e pan-ligantes.
- Valor Operacional: Fornece protocolos de marcação padronizados e reprodutíveis, compatíveis com a preparação para triagem em alta produtividade.
- Valor Científico: Permite a preparação de sistemas biológicos validados para estudos posteriores de triagem de compostos e de engajamento de alvos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita o alinhamento translacional de biomarcadores ao associar a supressão de NKG2DL a mecanismos de escape imune em células tronco leucêmicas (LSCs).
- Valor Operacional: Apoia a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, permitindo o isolamento de células iniciadoras da doença.
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao utilizar o status de NKG2DL para estratificar subpopulações de LMA com potencial tumorigênico diferencial.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao contínuo de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e avaliação pré-clínica, permitindo o isolamento de subpopulações definidas mecanisticamente.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao separar LSCs negativas para NKG2DL de células de AML positivas para NKG2DL.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio da detecção padronizada e quantitativa na superfície celular, compatível com plataformas de triagem baseadas em citometria de fluxo.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de variáveis dependentes (porcentagem de eventos positivos, intensidade de fluorescência), permitindo a comparação de métodos de marcação e frequências de subpopulações.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao permitir o isolamento de LSCs para validação funcional em modelos relevantes para a doença.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável de enriquecimento de células-tronco aplicável a diferentes amostras de AML e adaptável a outros tipos de câncer com mecanismos semelhantes de evasão imunológica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva no enriquecimento de células-tronco, redução da ambiguidade mecanicista na identificação de Células-Tronco Leucêmicas (LSC).
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade da detecção de NKG2DL em múltiplas amostras de LMA.
- Valor Estratégico: Decisões aprimoradas de seguir/não seguir na validação de alvos, eficiência no uso de capital por meio da redução precoce de riscos, redução do risco biológico em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de alvos com base no potencial de enriquecimento de LSC e no fenótipo de escape imune.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em citometria de fluxo, coloração de células e manipulação de amostras primárias de LMA.
- Depende do acesso a citômetros de fluxo, equipamentos de centrifugação e reagentes, incluindo biotina, proteína de fusão NKG2D, estreptavidina PE e 7-AAD.
- Necessita padronização entre equipes das estratégias de seleção de eventos (gating), controles FMO e ajustes de compensação para resultados consistentes.
- Requer considerações de adaptação ao ser aplicado em diferentes sistemas modelo, devido à variabilidade nos padrões de expressão de NKG2DL.
- As limitações práticas incluem a fragilidade das células primárias de LMA durante o descongelamento, exigindo processamento rápido para manter a viabilidade.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Biotinylation of the NKG2D Fusion Protein and Thawing of Primary AML Cells
2:00
Staining of Primary AML Cells with the Biotinylated NKG2D Fusion Protein
3:24
Results: Gating Strategy and Staining Protocol Comparison
4:49
Conclusion
