Name: Usando análise de imagem baseada em computador para melhorar a quantificação da metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a quantificar metástase pulmonar em modelo pré-clínico de câncer de mama 4T1 usando análise de imagem computadorizada com Fiji-ImageJ. Este método aumenta a precisão, reduz erros humanos e acelera resultados consistentes para pesquisa oncológica.

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Este trabalho foi apoiado pela Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), pelo Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) e pelos Institutos Nacionais de Saúde R21EB028429 (IA).

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Virginia Tech e de acordo com o Guia Nacional dos Institutos de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A realização deste protocolo requer permissão das instituições competentes e adesão a todas as diretrizes adequadas.
1. Cultura celular
<ol><li>Faça mídia de cultura completa (RPMI + 10% soro bovino fetal +1% Pen Strep). Reviva células 4T1 de acordo com o Protocolo ATCC10 e incubar a 37 °C e 5% de CO2 em um frasco T-25 até confluente. Mude a mídia no dia seguinte à revitalização para remover células mortas, e novamente se a mídia for gasta antes que as células sejam confluentes o suficiente para a passagem.</li>
	<li>Uma vez que o frasco T-25 é confluente, as células de passagem para um frasco T-75 descartando mídia, lavando frasco com 5 mL de 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), e adicionando 500 μL de Trypsin-EDTA. Incubar por 5-10 minutos a 37 °C até que as células se desprendem.<ol>
<li>Uma vez destacado, adicione 5 mL de mídia de cultura completa aquecida às células. Aspire e transfira os 5 mL para um frasco T-75 contendo 15 mL de mídia cultural completa aquecida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Células de passagem em frascos T-75 pelo menos quatro vezes. Faça isso uma vez que o frasco é confluente lavando com 8 mL de 1x DPBS, adicionando 1 mL de Trypsin-EDTA para desacoplar células, adicionando 10 mL de mídia aquecida às células, e diluindo 1:6-1:8 em um novo frasco T-75 contendo 20 mL de mídia cultura completa aquecida.</li>
	<li>Células de passagem até o número apropriado de frascos T-150 contendo 40 mL de mídia de cultura completa aquecida para o número de ratos a serem injetados. A maioria dos estudos exigirá vários frascos T-150 para garantir células suficientes para injeção.</li>
	<li>Quando os ratos estão prontos para serem injetados (8 semanas de idade ou pesando mais de 20 g, dependendo do IACUC ou protocolos institucionais), as células de colheita descartando mídia, lavando cada frasco com 10 mL de 1x DPBS e adicionando 2 mL de trypsin-EDTA. Incubar por 5-10 minutos a 37 °C até que as células se desprendem.</li>
	<li>Lave o frasco com 10 mL de mídia completa e transfira todos os conteúdos (10 mL de mídia + 2 mL de mistura celular trypsin-EDTA) para o próximo frasco. Continue a lavar e coletar células de cada frasco usando os mesmos 10 mL de mídia para evitar o uso de uma quantidade excessiva de mídia.<ol>
<li>Uma vez coletados todos os frascos, transfira o conteúdo para um tubo de centrífuga de 50 mL. Colete uma amostra de 10 μL para contar em um tubo de microcentrifuuagem e centrifugar o tubo cônico de 50 mL a 125 x g por 5 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enquanto as células estão sendo centrifugadas, adicione 10 μL de azul Trypan a 10 μL de amostra celular. Conte células usando um hemócito. Uma vez determinado o número total de células, calcule a concentração de células necessárias para injetar camundongos para 1,2 x 106 células por rato (por 100 μL).</li>
	<li>Após centrifugação, mídia decantada e pelota de célula resuspend em quantidade correta de 1x DPBS estéreis para 1,2 x 106 células por 100 μL. Divida a mistura celular/DPBS em tubos de microcentrifuuge para fácil acesso com a seringa ao aspirar células para injeção. Mantenha as células no gelo e injete logo depois, pois as células começarão a morrer depois de ficarem no gelo por longos períodos de tempo.</li>
</ol>2. Injeções
<ol><li>Prepare as células para injeção tocando ou misturando suavemente o tubo de microcentrifuuge para resuspensar as células e, em seguida, aspirar 600 μL em uma seringa de 1 mL. Vire a seringa para cima e puxe o êmbolo para baixo para afastar as células da abertura da seringa. Toque na seringa para livrá-la de bolhas de ar.</li>
	<li>Conecte o bisel da agulha e distribua as células de volta ao tubo de microcentrifuuge até que apenas 500 μL permaneçam na seringa. Coloque a seringa no gelo. NOTA: As células 4T1 caem rapidamente da suspensão. Portanto, é importante misturar as células de volta à suspensão tocando com frequência.</li>
	<li>Anestesize 8 semanas de idade/>20 g fêmea BALB/c mouse usando isoflurane ou outro agente anestésico aprovado. Monitore a respiração do rato para avaliar a profundidade da anestesia.</li>
	<li>Uma vez que o mouse esteja devidamente anestesiado como indicado pela falta de reflexo da córnea, coloque o mouse em suas costas. Usando o polegar, o ponteiro e o dedo médio, segure suavemente o mouse. Use o ponteiro e os dedos médios para segurar a parte superior do corpo e o polegar do mouse para a perna esquerda traseira. Seja gentil, mas firme.</li>
	<li>Com o bisel da agulha para cima, injete 100 μL de células subcutâneas na almofada de gordura mamária abdominal esquerda do rato. Monitore para uma boa sangria e qualquer vazamento, e certifique-se de que o mouse acorde e se mova facilmente após a injeção.<ol>
<li>Troque agulhas entre cada rato. NOTA: Não permita que a agulha entre na cavidade peritoneal. Isso faria com que o câncer se espalhasse rapidamente e não representasse o modelo. Para garantir uma injeção subcutânea, puxe suavemente para cima na agulha quando inserida na almofada de gordura mamária abdominal esquerda. Se a agulha for facilmente levantada para cima, ela está corretamente posicionada subcutânea.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Monitoramento
<ol><li>Monitore camundongos pelo menos 3 vezes por semana para peso, escore de condição corporal, tamanho do tumor, condição do tumor, respiração, nível de atividade, aparência e movimento. Uma vez que o tumor atinja 0,7-0,8 cm de diâmetro, comece a monitorar diariamente.<ol>
<li>Considere a eutanásia quando o tamanho do tumor atinge 1,5 cm, ou a perda de peso atinge 20%, ou declínio clínico severo no escore da condição corporal, condição do tumor, respiração, nível de atividade, aparência ou movimento são observados com base em diretrizes institucionais. NOTA: O escore da condição corporal é crucial para monitorar, pois o peso corporal pode aumentar à medida que o tumor aumenta de tamanho, negando a perda de condições corporais devido à carga da doença. Os protocolos exatos de monitoramento dependerão do IACUC aprovado ou dos protocolos institucionais.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Necropsia
<ol><li>Eutanize o mouse usando CO2 seguindo as diretrizes institucionais.</li>
	<li>Spray mouse com 70% de etanol para desinfetar. Faça uma incisão na linha média ventral do rato para expor a cavidade corporal.</li>
	<li>Remova o rim. Continue cortando a linha média até que o diafragma esteja visível. Use uma tesoura para perfurar o diafragma para esvaziar os pulmões. Corte o diafragma para ter melhor acesso à cavidade.</li>
	<li>Use uma tesoura sem corte para cortar o centro da caixa torácica. Torção de pino de volta para expor o pulmão e o coração.</li>
	<li>Perfunda o coração com 2 mL de 1x DPBS não estéril inserindo uma agulha no ápice do coração até que ele se acumule na cavidade abdominal onde o rim foi removido.</li>
	<li>Para remover o coração e os pulmões, use uma tesoura sem cortes para cortar o esôfago e a traqueia diretamente acima do coração. Usando fórceps, comece a puxar o coração para longe do corpo e corte em qualquer tecido conjuntivo mantendo-o preso. Os pulmões sairão com o coração.</li>
	<li>Identifique os pulmões multi-lobed (direita) e single-lobed (esquerda). Mantenha o coração preso para referência, mas uma vez identificados os pulmões, corte o coração.</li>
	<li>Rotule uma placa de 12 poços contendo 1x Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) em cada poço. Cada rato precisa de 2 poços. Coloque o pulmão multi-lobed (à direita) na placa de 12 poços para avaliação de metástase e mantenha no gelo. Mantenha o vizinho bem vazio por enquanto. NOTA: É importante usar o mesmo pulmão (multi-lobed) de cada rato para garantir que cada amostra esteja próxima em tamanho. O pulmão mono lobed pode então ser usado para outras análises, como histopatologia. NOTA: As amostras estão estáveis no gelo ou a 4 °C por algumas horas.</li>
</ol>5. Tecidos de processamento
NOTA: Todas as etapas desta seção devem ser feitas utilizando técnica estéril.
<ol><li>Rotule 1 tubo cônico de 15 mL por rato e adicione 2,5 mL de mistura de colagenase tipo IV e 30 unidades de elastase a cada tubo. Para fazer a mistura de colagem tipo IV, dissolva 2 mg de colagenase tipo IV por mL 1x HBSS e filtro estéril. Isso pode ser armazenado até 12 meses a -20 °C e descongelado quando necessário.</li>
	<li>Transfira o pulmão para o segundo, limpe 1x HBSS bem para essa amostra. Redemoinho usando fórceps para remover qualquer sangue restante. Transfira o pulmão limpo para a placa de cultura de tecido de 3,5 cm vazia. Pulmão picado com tesoura. Enxágüe a placa com 2,5 mL de HBSS 1x, transfira 1x HBSS e peças pulmonares em um tubo cônico de 15 mL já contendo coquetel de colagenase/elastase (total de 5 mL).</li>
	<li>Incubar por 75 minutos a 4 °C. Continue misturando amostras durante este tempo, então coloque tubos em uma roda de roqueiro ou rotativa. Durante esta etapa de incubação, rotule tubos de centrífugas de 50 mL e placas de cultura tecidual de 10 cm para cada rato. Se fizer uma diluição, rotule placas suficientes de cultura tecidual de 10 cm para as diluições. NOTA: Rotule a tampa das placas de cultura tecidual. Se rotular a placa em si, a escrita interferirá na análise Fiji-ImageJ.</li>
	<li>Traga volume de cada tubo até 10 mL total com 1x HBSS. Despeje o conteúdo sobre um coador de células de 70 μm em um tubo cônico de 50 mL para cada amostra. Use o êmbolo de uma seringa de 1 mL para moer suavemente a amostra através do coador para permitir que mais células se filtrem.</li>
	<li>Centrifugar por 5 minutos a 350 x g em temperatura ambiente (RT). Descarte o supernatante e lave a pelota com 10 mL de 1x HBSS. Repita este passo duas vezes.</li>
	<li>Resuspend pellet em 10 mL de 60 μM 6TG mídia de cultura completa, seja RPMI ou IMDM. Amostras de placas em placas de cultura celular de 10 cm, utilizando um esquema de diluição, se desejar. Incubar a 37 °C, 5% de CO2 por 5 dias. NOTA: 1:2, 1:10 e 1:100 são diluições comuns que precisarão ser empiricamente determinadas com base nos parâmetros do estudo. ATENÇÃO: O 6TG é tóxico. Tenha cuidado ao manusear e siga todas as diretrizes de Saúde e Segurança Ambiental para o descarte.</li>
</ol>6. Placas de coloração
<ol><li>Despeje a mídia cultural das placas em recipiente de lixo apropriado. Fixar as células adicionando 5 mL de metanol não diluído por placa e incubar por 5 minutos no RT, certificando-se de girar metanol para que cubra toda a placa. ATENÇÃO: O metanol é perigoso se ingerido, inalado ou está na pele. Use um capuz de fumaça para este passo.</li>
	<li>Despeje o metanol das placas em recipiente de lixo apropriado. Enxágüe placas com 5 mL de água destilada por prato e despeje água em recipiente de resíduos apropriado. Adicione 5 mL de 0,03% azul de metileno por placa e incubar por 5 minutos na RT, certificando-se de redemoinho de solução azul de metileno para cobrir toda a placa.</li>
	<li>Despeje o azul de metileno no recipiente de resíduos apropriado. Enxágüe novamente as placas com 5 mL de água destilada por prato. Vire as placas de cabeça para baixo e borre contra uma toalha de papel para remover o excesso de líquido. Coloque a placa em sua tampa e deixe o ar secar durante a noite no RT. NOTA: Colônias metastáticas serão azuis. Uma vez que as placas são secas, elas podem ser armazenadas em RT indefinidamente.</li>
</ol>7. Análise de imagem
<ol><li>Remova as tampas rotuladas das placas, tomando cuidado para garantir a identificação clara das amostras. Alinhe todas as placas de pulmão manchadas em uma superfície limpa e leve para tirar uma foto de todas as placas em uma imagem.</li>
	<li>Tire uma foto da coleção de placas em uma área bem iluminada, certificando-se de minimizar reflexos, pois as placas são muito reflexivas. Reflexões nas placas influenciarão a análise da imagem e, portanto, precisam ser evitadas. NOTA: Fiji-ImageJ tem um limite superior de 2 gigapixels. A maioria dos smartphones modernos terá câmeras suficientes. Não use uma câmera inferior a 8 megapixels. A câmera usada neste experimento foi de 12,2 megapixels em um Google Pixel 2.</li>
	<li>Corte a imagem para incluir as placas, mas exclua as tampas ou qualquer outra coisa no fundo da imagem. Carregue a imagem cortada no Fiji-ImageJ.</li>
	<li>Alterar a imagem para preto e branco usando os seguintes comandos: Imagem, Ajuste, Limiar de Cor, Método de Limiar: Padrão, Cor limiar: B&W, Espaço limiar: Laboratório. Deselecione a caixa de fundo Escuro. A imagem agora deve ser em preto e branco. Preto representa o fundo leve, e branco representa as colônias metastáticas azuis.</li>
	<li>Usando a ferramenta Circle na barra de ferramentas Fiji-ImageJ, selecione a área a ser analisada. Desenhe um círculo para usar em todas as placas para garantir que cada placa seja analisada para a mesma área. Escolha um tamanho que maximize a área analisada nas placas, minimizando o ruído de fundo que aparece na borda das placas. O tamanho aparece na barra de ferramentas à medida que é desenhado, por isso é possível fazer um círculo perfeito monitorando a altura e a largura à medida que o círculo é desenhado.</li>
	<li>Analise o círculo selecionado para determinar qual percentual da área é branca, o que representa a área da placa que possui colônias metastáticas azuis. Use os seguintes comandos: Analisar, Analisar partículas, tamanho (pixel2): 0-Infinito, Circularidade: 0.00-1.00, Mostrar: Nada, e verificar a caixa Resumo. Bata ok.</li>
	<li>Registo da área de %. Este é o percentual da área selecionada que é branca e, portanto, representa a carga metastática. NOTA: Recomenda-se salvar os resultados em Fiji-ImageJ ou copiar/colar toda a página de resultados em um documento separado. Se os resultados da % Área forem inesperados ou suspeitos, é possível ver se alguma das outras medidas também estava suspeita ou se a % Área foi registrada incorretamente.</li>
	<li>Mova o círculo, sem alterar seu tamanho, agarrando-o em seu centro, para a próxima placa da imagem. Repita as etapas 7.6 e 7.7 para todas as placas da imagem.</li>
	<li>Repita as etapas 7.1 – 7.8 em pelo menos mais duas imagens. Uma vez analisadas todas as placas e imagens, a média dos resultados da área % entre diferentes imagens para cada placa para mitigar quaisquer inconsistências entre as imagens.</li>
</ol>

<ol><li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Facts+%26+Figures%5BTitle%5D)+AND+%22American+Cancer+Society%22%5BJournal%5D)">Cancer Facts & Figures.</a> American Cancer Society. , (2019).</li>
<li>Yousefi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+metastasis+of+breast+cancer%3A+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis.</a> Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).</li>
<li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+4T1+breast+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mouse 4T1 breast tumor model.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20.22 (2001).</li>
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<li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).</li>
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<li>Valkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+detection+from+whole+slide+images+using+local+features+and+random+forests%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests.</a> Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).</li>
<li>Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+VNP20009+and+VNP20009+with+restored+chemotaxis+on+4T1+mouse+mammary+carcinoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression.</a> Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>ATCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.T.C.C.+4T1+%28ATCC+CRL2539%29+Product+Sheet%5BTitle%5D)+AND+%22ATCC%22%5BJournal%5D)">A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet.</a> ATCC. , (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Como demonstrado, contar manualmente as colônias metastáticas em cada placa pulmonar pode ser um método impreciso e impreciso para quantificar a metástase pulmonar, demonstrando a necessidade de um melhor meio de quantificação(Figura 2). A análise histopatológica difere ligeiramente da contagem manual e da análise fiji-imageJ(Figura 2B e 4D),provavelmente porque os slides de H&E não são uma amostra representativa de todo o órgão. O protocolo col...

Uma em cada oito mulheres será diagnosticada com câncer de mama em sua vida, e ainda apesar de múltiplas opções de tratamento, o câncer de mama é a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em mulheres americanas1. Essas mulheres não estão morrendo pelo tumor primário na mama. Em vez disso, a carga metastática é responsável pela mortalidade desta doença, pois comumente se espalha para o pulmão, osso, cérebro, fígado e linfonodos2. Por isso, os modelos de câncer de mama precisam avaliar a metástase para contribuir para conter a mortalidade dessa doença. O modelo de câncer de mama murine 4T1 é um excelente protocolo para conseguir isso. O método descrito aqui oferece uma melhoria para o modelo 4T1 usando Fiji-ImageJ para quantificar a metástase pulmonar, produzindo resultados consistentes e rápidos.
O modelo 4T1 é bem estabelecido, com a maioria dos laboratórios usando protocolos como os descritos por Pulaski e Ostrand-Rosenberg em 20013. A linha celular 4T1 é resistente à 6-Thioguanina (6TG) e representativa do estágio IV, câncer de mama triplo negativo3,4,5. É clinicamente relevante por ser um modelo ortotópico e metástase espontaneamente aos mesmos órgãos do câncer de mama humano3,4. As células 4T1 metástases espontaneamente a uma taxa previsível com base na quantidade de células injetadas3,4. É importante ressaltar que as diferenças genéticas entre os camundongos aqui utilizados causaram a variabilidade inter-individual esperada na carga metastática. Para avaliar a metástase, os tecidos são colhidos para coletar e quantificar células cancerígenas em locais distantes usando seleção de 6TG e coloração azul de metileno. O resultado é uma coleção de placas de cultura tecidual com pontos azuis representando colônias metastáticas. No entanto, o protocolo Pulaski e Ostrand-Rosenberg quantifica as colônias metastáticas contando-as manualmente, e, portanto, este tem sido o meio padrão de avaliar a metástase neste modelo. Embora isso seja fácil para tecidos com baixa carga metastática, tecidos como os pulmões são frequentemente carregados de metástases. Como as placas pulmonares podem ser altamente confluentes, quantificar com precisão e precisão colônias metastáticas por contagem manual é difícil e propenso a erros humanos. Para quantificar melhor a carga metastática, descrevemos o uso do Fiji-ImageJ para uma solução baseada em computador para erro de contagem humana. A análise histopatológica com hematoxilina e eosina (H&E) é outro meio de quantificar metástases pulmonares, e curiosamente também foi melhorada com o software Fiji-ImageJ6,7. No entanto, como a análise histopatológica observa uma única fatia do pulmão, pode ser imprecisa e não representativa. Isso porque o modelo 4T1 causa várias lesões metastáticas em todo o órgão que não são distribuídas uniformemente. Embora as tendências globais entre a análise histopatológica e a contagem manual possam sersemelhantes 8,os valores individuais podem diferir e, portanto, a análise histopatológica não deve ser usada como único meio de quantificação. Demonstramos o benefício em comparação com a análise histopatológica e as inconsistências na contagem manual entre diferentes contadores, ao mesmo tempo em que demonstramos a consistência do uso do Fiji-ImageJ. Além disso, mostramos que esse método pode reduzir o tempo de incubação de 10-14 dias para 5 dias, o que significa que os pesquisadores podem analisar dados de seu estudo muito mais cedo do que quando se baseia na contagem manual.
Este método é uma coleção de ajustes simples ao protocolo Pulaski e Ostrand-Rosenberg3. Como o modelo 4T1 é amplamente utilizado, e como a metástase pulmonar é um parâmetro crítico para medir em modelos pré-clínicos, acreditamos que esse método pode ser amplamente utilizado e é altamente valioso para os pesquisadores de câncer de mama. Os únicos suprimentos adicionais necessários são uma câmera e acesso a um computador com Fiji-ImageJ, um software livre usado com frequência na análise deimagens 9. Este método se concentra especificamente na metástase pulmonar, mas pode ser usado para outros tecidos com carga metastática significativa.

<table><tbody><tr><td>Câmara de anestesia</td><td>Ver comentários</td><td>Ver comentários</td><td>Usar materiais aprovados nas políticas da sua instituição</td></tr><tr><td>Agente anestésico</td><td>Ver comentários</td><td>Ver comentários Utilizar</td><td>materiais aprovados nas políticas da sua instituição</td></tr><tr><td>BALB/c Ratos fêmeas</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>000651</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura romba</td><td>Roboz</td><td>RS-6700</td><td></td></tr><tr><td>Calculadora</td><td>Qualquer</td><td>Qualquer Câmera</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qualquer</td><td></td><td>Qualquer Qualquer Mínimo de 8 megapixels</td></tr><tr><td>Centrifugar</td><td>Qualquer</td><td>Qualquer</td><td>Precisa ser capaz de 125 x g e 300 x g Configuração de</td></tr><tr><td>eutanásia de CO2</td><td>Ver comentários</td><td>Ver comentários</td><td>Use materiais aprovados nas políticas da sua instituição</td></tr><tr><td>Câmaras frigoríficas, geladeira, câmaras frigoríficas</td><td>Qualquer</td><td>Qualquer</td><td></td></tr><tr><td>Computador com Fiji-ImageJ</td><td>Qualquer</td><td>Qualquer Precisa</td><td>ser capaz de executar Fiji-ImageJ</td></tr><tr><td>Câmara de Contagem</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura curva</td><td>Roboz</td><td>RS-5859</td><td></td></tr><tr><td>Água destilada</td><td>Qualquer</td><td>Qualquer Elastase</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MP Biomedicals</td><td>100617</td><td></td></tr><tr><td>Balança eletrônica</td><td>Qualquer</td><td>Qualquer</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>R& D Systems</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Ver comentários</td><td>Ver comentários</td><td>Precisa ser capaz de 5% CO2 e 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03978-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>ATCC</td><td>30-2300</td><td></td></tr><tr><td>Pinos ou agulhas</td><td>Qualquer</td><td>Qualquer Para</td><td>fixar ratos durante a necropsia</td></tr><tr><td>Paquímetros de plástico</td><td>VWR</td><td>25729-670</td><td></td></tr><tr><td>RMPI-1640 Médio</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>Balancim ou roda rotativa</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qualquer tesoura afiada</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Filtro descartável estéril com membrana PES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>568-0010</td><td></td></tr><tr><td>T-150 Frascos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-48</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Frascos</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-10</td><td></td></tr><tr><td>Frascos T-75</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>Copo de plástico tri-encurralado</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-111F</td><td>Usado para pesar camundongos</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>Tipo IV colagenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 3,5 cm</td><td>Seringa Nunclon</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>de 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga de 1,7 mL</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-22</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 poços</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30028FS</td><td></td></tr><tr><td>1X Hank' s Solução Salina Balanceada (HBSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3026802</td><td></td></tr><tr><td>27 g 1/2 in agulhas</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>4T1 (ATCC&reg; CRL&tímido; 2539&trade;)</td>Tubo de centrífuga <td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>6-Tioguanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4882</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtro de células M</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Diluir a 70% com água DI</td></tr></tbody></table>

usando análise de imagem baseada em computador para melhorar a quantificação da metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4t1

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

O câncer de mama é uma malignidade devastadora, representando 40.000 mortes de mulheres e 30% de novos diagnósticos de câncer feminino nos Estados Unidos apenas em 2019. A principal causa de mortes relacionadas ao câncer de mama é a carga metastática. Portanto, modelos pré-clínicos para o câncer de mama precisam analisar a carga metastática para serem clinicamente relevantes. O modelo de câncer de mama 4T1 fornece um modelo de camundongos espontaneamente metástase e quantificável para o câncer de mama humano estágio IV. No entanto, a maioria dos protocolos 4T1 quantificam a carga metastática contando manualmente colônias manchadas em placas de cultura tecidual. Embora isso seja suficiente para tecidos com menor carga metastática, o erro humano na contagem manual causa resultados inconsistentes e variáveis quando as placas são confluentes e difíceis de contar. Este método oferece uma solução baseada em computador para erro de contagem humana. Aqui, avaliamos o protocolo usando o pulmão, um tecido altamente metastático no modelo 4T1. Imagens de placas manchadas de azul de metileno são adquiridas e enviadas para análise em Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ então determina a porcentagem da área selecionada da imagem que é azul, representando a porcentagem da placa com carga metastática. Esta abordagem baseada em computador oferece resultados mais consistentes e rápidos do que a contagem manual ou a avaliação histopatológica para tecidos altamente metastáticos. A consistência dos resultados do Fiji-ImageJ depende da qualidade da imagem. Pequenas variações nos resultados entre as imagens podem ocorrer, assim é recomendável que várias imagens sejam tiradas e os resultados sejam mediados. Apesar de suas limitações mínimas, este método é uma melhoria para quantificar a carga metastática no pulmão, oferecendo resultados consistentes e rápidos.

Este método contém ajustes simples do protocolo Pulaski e Ostrand-Rosenberg 4T13 e pode ser visualizado na Figura 1. Quando 3 pesquisadores separados contaram manualmente colônias metastáticas para 12 placas pulmonares (diluição de 1:10), os resultados foram muito inconsistentes entre diferentes contadores(Figura 2A). Todos os pesquisadores foram orientados a "contar as colônias metastáticas que aparecem como pontos azuis", mas as inconsi...

Descrevemos um método mais consistente e rápido para quantificar a metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1 usando Fiji-ImageJ.

Usando análise de imagem baseada em computador para melhorar a quantificação da metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Este protocolo quantifica a metástase pulmonar, que é uma causa agressiva e comum de morte relacionada ao câncer de mama, com maior precisão e eficiência em um modelo pré-clínico de câncer de mama. Comparado com a técnica original, este protocolo dá aos pesquisadores resultados mais rápidos e consistentes. Alivia o erro de contagem humana através da tecnologia de computador fácil de usar.Essa técnica pode ser absolutamente estendida a pesquisas pré-clínicas que estudam os efeitos das terapias de câncer de mama na metástase pulmonar, permitindo que os pesquisadores demonstrem uma carga metastática reduzida após o sucesso do tratamento. Comece rotulando um tubo cônico de 15 mililitros para a amostra de tecido. Em seguida, adicione 2,5 mililitros de mistura de colagem tipo quatro e 30 unidades de elastase ao tubo.Mova o pulmão para um hbss 1X limpo bem e gire-o com fórceps para remover qualquer sangue restante, em seguida, transfira-o para uma placa de cultura de tecido vazia de 3,5 centímetros. Pique o pulmão com uma tesoura, depois enxágue a placa com 2,5 mililitros de HBSS e transfira o HBSS com os pedaços de pulmão em um tubo cônico preparado de 15 mililitros com o coquetel de colagem e elastase. Incubar o tubo por 75 minutos a quatro graus Celsius em uma roda de roqueiro ou rotativa.Enquanto isso, rotule um tubo de centrífugas de 50 mililitros e uma placa de cultura de tecido de 10 centímetros para cada rato. Se fizer uma diluição, rotule placas suficientes de cultura tecidual para as diluições. Leve o volume do tubo até 10 mililitros com HBSS 1X e despeje o conteúdo sobre um coador de células de 70 micrômetros no tubo cônico de 50 mililitros.Use o êmbolo de uma seringa de um mililitro para moer suavemente a amostra através do coador. Centrifugar o tubo por cinco minutos a 350 vezes G e descartar o supernascedor, em seguida, lave a pelota duas vezes com 10 mililitros de 1X HBSS. Resuspenque a pelota em 10 mililitros de 60 micromolar 6-thioguanina completa mídia cultural, e emplaque as amostras nas placas de cultura celular de 10 centímetros usando um esquema de diluição, se desejar.Incubar as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco dias. Despeje a mídia cultural das placas no recipiente de lixo apropriado. Para fixar as células, adicione cinco mililitros de metanol não diluído em cada placa e incubar por cinco minutos em temperatura ambiente, certificando-se de girar o metanol para que cubra toda a placa.Despeje o metanol das placas no recipiente de resíduos apropriado e enxágue cada placa com cinco mililitros de água destilada. Adicione cinco mililitros de azul de metileno de 0,03% por placa e incuba-o por cinco minutos em temperatura ambiente, certificando-se de girar a solução azul de metileno para que cubra toda a placa. Despeje o azul de metileno no recipiente de resíduos apropriado e enxágue cada prato novamente com cinco mililitros de água destilada.Vire a placa de cabeça para baixo e borre-a contra uma toalha de papel para remover o excesso de líquido. Coloque a placa em sua tampa e deixe-a secar durante a noite. Colônias metastáticas serão azuis.Uma vez que as placas tenham secado, elas podem ser armazenadas à temperatura ambiente indefinidamente. Remova as tampas rotuladas das placas, tomando cuidado para garantir a identificação clara das amostras. Alinhe todas as placas de pulmão manchadas em uma superfície limpa e leve.Tire uma foto da coleção de placas em uma área bem iluminada, certificando-se de minimizar reflexões. Reflexões nas placas influenciarão a análise da imagem e devem ser evitadas. Preste muita atenção às fotografias tiradas, e tire várias fotos de vários ângulos.Depois de fotografar as placas, corte a imagem para excluir as tampas ou qualquer coisa ao fundo. Abra a imagem em Fiji ImageJ e altere-a para preto e branco clicando em imagem, ajuste e limiar de cor. Em seguida, selecione o padrão para o método de limiar, preto e branco para a cor limiar e laboratório para espaço de cor.Certifique-se de que a caixa de fundo escuro não está selecionada. A imagem agora deve ser em preto e branco. Preto representa o fundo leve, e branco representa as colônias metastáticas azuis.Use a ferramenta de círculo para selecionar a área a ser analisada. Desenhe um círculo para usar em todas as placas para garantir que cada placa seja analisada para a mesma área de tamanho. Escolha um tamanho que maximize a área analisada nas placas, minimizando o ruído de fundo que aparece na borda das placas.O tamanho aparece na barra de ferramentas à medida que é desenhado. Analise o círculo selecionado para determinar a porcentagem de área que é branca. Clique em analisar e analisar partículas, em seguida, selecione zero a infinito para tamanho, zero a um para circularidade e nada para mostrar.Verifique a caixa resumida e bata bem. Mova o círculo para a próxima placa na imagem, agarrando-o no centro e repetindo a análise. Copie e cole o resultado em uma planilha.A área percentual, que é o percentual da área selecionada que é branca, representa a carga metastática. Uma vez analisadas todas as placas e imagens, a média da área de porcentagem resulta entre diferentes imagens para cada placa para mitigar quaisquer inconsistências entre as imagens. A análise de Fiji ImageJ foi comparada à contagem manual e à análise histopatológica.Quando três pesquisadores separados contaram manualmente colônias metastáticas, os resultados foram inconsistentes entre os contadores. Os resultados do Fiji ImageJ foram consistentes entre os contadores de cada uma das três imagens. Os resultados das três imagens e dos três contadores foram combinados para cada placa pulmonar.Os resultados foram mediados para que cada placa respondesse pelas variações entre as imagens, o que proporcionou resultados consistentes entre os contadores. Ao classificar as placas da maioria para a mínima metastática, a contagem manual concordou com a placa mais confluente, mas todas as fileiras seguintes eram inconsistentes. As fileiras dos resultados médios do Fiji ImageJ foram muito mais consistentes entre os contadores.Para demonstrar a importância de evitar reflexões nas imagens, uma imagem com o reflexo de uma mão e sua análise subsequente de Fiji ImageJ é mostrada juntamente com uma imagem da mesma placa sem um reflexo. Manchas escuras de uma superfície de fundo suja ou resíduo de amostra de sangue nas placas também podem impactar negativamente a análise de Fiji ImageJ. Esta placa sanguínea tem apenas duas colônias metastáticas, mas o resíduo escuro fez com que o Fiji ImageJ a considerasse como 31,6% metastático.Ao tentar este protocolo, lembre-se de examinar cuidadosamente as imagens para reflexão, use o mesmo círculo de tamanho para cada placa na imagem e tenha uma média dos resultados de cada placa entre pelo menos três imagens separadas.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este protocolo descreve como usar quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) para detectar ARNm específicos de células tumorais representam metástases no tecido do pulmão do rato.

Avaliação de metástases pulmonares em Rato mamárias tumorais Models por Quantitative PCR em tempo real

Um modelo de tumor primário do cancro da mama ortotópico e remoção cirúrgica do tumor primário para prolongar a vida do rato para gerar metástase espontânea são descritos. O crescimento do tumor e progressão são monitorados e quantificado por imagens de fluorescência da luciferase.

Um modelo de camundongo ortotópico de câncer de mama espontânea metástase

Aqui descrevemos o modelo e a abordagem para estudar as funções dos macrófagos alveolares pulmonares na metástase do câncer. Para demonstrar o papel dessas células na metástase, foi utilizado o modelo singênico (4T1) de câncer de mama em conjunto com a depleção de macrófagos alveolares com lipossomas de clodronatos.

Estudar o papel dos macrófagos alveolares em câncer de mama metastático

O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição detalhada do protocolo para o ensaio de metástase pulmonar (PuMA). Este modelo permite aos pesquisadores estudar o crescimento de células metastáticas osteossarcoma (OS) no tecido pulmonar, usando um widefield fluorescência ou microscópio confocal de varredura a laser.

Considerações práticas em estudar a colonização de pulmão metastático em osteossarcoma usando o ensaio de metástase pulmonar

Descreveremos um protocolo para pré-clínicos em vivo rastreamento de metástases. É baseado em um repórter de radionuclídeos-fluorescência combinando o symporter de iodeto de sódio, detectado pelo não-invasiva [18F] tetrafluoroborate-animal de estimação e uma proteína fluorescente para confirmação simplificada ex vivo . O método é aplicável para pré-clínicos na vivo celular rastreamento além da biologia do tumor.

Radionuclídeo-fluorescência Gene do repórter de imagem para controlar a progressão do Tumor em modelos de roedores Tumor

Neste protocolo, descrevemos como utilizar [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose tomografia por emissão de pósitrons e tomografia computadorizada (18F-FDG PET-CT), imagem latente para medir a resposta metabólica do tumor para a terapia-alvo MLN0128 em um  Kras/Lkb1 rato mutante modelo de câncer de pulmão e juntamente com autoradiografia ex vivo de alta resolução e histologia quantitativa de imagem.

Utilizando 18F-FDG PET-CT Imaging e histologia quantitativa para medir mudanças dinâmicas no metabolismo glicose em modelos de Mouse de câncer de pulmão

Este trabalho predefine um protocolo avançado para avaliar com precisão o carregamento de tumores por meio da detecção de sinais de proteína fluorescente verde e bioluminescência, bem como a integração da técnica de detecção molecular quantitativa.

Estudando o câncer de mama triplo negativo usando modelo de câncer de mama ortotópico

A abordagem descrita combina ensaios experimentais de metástase da veia da cauda com imagens de animais vivos in vivo in vivo para permitir o monitoramento em tempo real da formação e crescimento da metástase do câncer de mama, além da quantificação do número e tamanho da metástase nos pulmões.

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

A injeção intravenosa de células cancerígenas é frequentemente usada em pesquisas de metástase, mas a carga tumoral metastática pode ser difícil de analisar. Aqui, demonstramos um modelo de injeção de veias traseiras de metástase e incluímos uma nova abordagem para analisar a carga do tumor pulmonar metastático resultante.

Análise patológica da metástase pulmonar após injeção lateral de cauda-veia de células tumorais

Descrevemos um modelo de metástase cerebral de câncer de mama em camundongos xenoenxerto gerada por injeção na veia caudal de uma linhagem de células inflamatórias de câncer de mama amplificadas endogenamente por HER2.

Modelando Metástase Cerebral Via Injeção Venosa Caudal de Células Inflamatórias de Câncer de Mama

O manuscrito descreve uma metodologia para o estabelecimento, bem como o monitoramento longitudinal do crescimento de metástases pulmonares espontâneas de tumores de mama injetados ortotopicamente, passíveis de intervenção em todos os estágios da cascata metastática.

In vivo Imagem para medir metástase pulmonar espontânea de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

Aprenda a quantificar metástase pulmonar em modelo pré-clínico de câncer de mama 4T1 usando análise de imagem computadorizada com Fiji-ImageJ. Este método aumenta a precisão, reduz erros humanos e acelera resultados consistentes para pesquisa oncológica.

Usando análise de imagem baseada em computador para melhorar a quantificação da metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1 (Vídeo) | JoVE Journal

Usando análise de imagem baseada em computador para melhorar a quantificação da metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1

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