Name: Culturação 3D de Organoides do Epitélio Intestinal Villi passando por Dediferente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprenda a cultivar organoides 3D a partir de vilos intestinais dediferenciados de camundongos. Este método utiliza raspagem para preservar o mesênquima subjacente e sinais de nicho essenciais para a iniciação dos organoides.

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Esta publicação foi apoiada pelo Prêmio Número K22 CA218462-03 do NiH National Cancer Institute. As células HEK293-T expressando R-Spondin1 foi um presente generoso do Dr. Michael P. Verzi.

Todos os experimentos com camundongos realizados, incluindo o uso de tamoxifen e eutanásia por deslocamento cervical, tiveram a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Instituto Stevens de ecnologia.
1. Ratos
NOTA: A geração de Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Os camundongos Villin-CreERT2 foram descritos anteriormente3. Camundongos adultos entre oito e doze semanas de idade foram usados.
<ol><li>Induzir a mutação Smad4KO:β-cateninGOF no Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 com injeção intraperitoneal de Tamoxifen em óleo de milho por quatro dias consecutivos.</li>
	<li>Sacrifique a luxação cervical 10 dias após a primeira injeção de tamoxifen.</li>
	<li>Pulverize o abdômen com 70% de etanol para evitar que o pelo do rato entre na cavidade peritoneal.</li>
	<li>Abra a cavidade abdominal com uma tesoura de dissecção para expor o intestino. Isole o intestino com o auxílio da tesoura e fórceps. NOTA: A perda concomitante de Smad4 juntamente com o ganho de mutação de função de β-catenin (Smad4KO;β-cateninGOF) no epitélio intestinal foi atingida pela injeção deSmad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 camundongos todos os dias por quatro dias consecutivos com 0,05 g de peso corporal tamoxifen/kg em óleo de milho. Estes camundongos são colhidos dez dias após a primeira injeção de tamoxifen para garantir a presença de células expressando marcadores associados a células-tronco no villi dediferente.</li>
</ol>2. Isolamento e preparação do duodeno
<ol><li>Disseca a metade proximal do duodeno.</li>
	<li>Lave o duodeno com 5 mL de PBS gelado em uma seringa de 10 mL para limpar o conteúdo luminal.</li>
	<li>Abra o duodeno longitudinalmente com uma tesoura angular e coloque o duodeno plano em uma placa de Petri de 15 cm no gelo com o lúmen do duodeno de frente para o operador.</li>
</ol>3. Isolamento de Villi raspando
<ol><li>Antes de começar a raspagem, coloque um coador de malha de 70 μm em um dos poços de uma placa de cultura tecidual de 6 poços. Encha todos os poços com 4 mL de PBS 1x e coloque a placa de cultura tecidual de 6 poços no gelo(Figura 1).</li>
	<li>Raspe o villi da seguinte forma usando dois slides de vidro microscópicos: um para segurar o duodeno para baixo e o outro para raspar(Figura 1B1).<ol>
<li>Raspe o lado luminal do duodeno superficialmente para lá e para cá duas vezes para remover o muco. Aplique pressão de tal forma que este passo remova a camada de muco, mas não o villi.</li>
		<li>Raspe o duodeno novamente, para lá e para cá duas vezes aplicando a mesma pressão que em 3..1, durante o qual villi pode ser visto coletando nos slides(Figura 1B2). Esta é a pressão ideal (que deve ser determinada empiricamente pelo operador) para produzir o villi sem as criptas amarradas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use um tubo de transferência de 1 mL contendo PBS para transferir o villi (que são coletados no slide da etapa 3.2.2.) para um coador de malha de 70 μm colocado em um prato de 6 poços. Os villi são recolhidos assim, após cada arranhão(Figura 1B2).</li>
	<li>Lave o villi coletado no coador de 70 μm (a partir da etapa 3.3) transferindo o coador (com o villi) através de uma série de poços em um prato de 6 poços contendo PBS frio (~ 4 mL/well). Isto é para remover criptas soltas, se houver.</li>
	<li>Usando um tubo p1000, transfira a suspensão villi em PBS (~ 3 mL) do coador de 70 μm para um novo tubo de 15 mL no gelo.</li>
	<li>Use uma ponta de tubulação p200 revestida com 0,1% BSA para aspirar 50 μL de volume da suspensão villi em um slide de vidro. Conte o número de villi na gotícula de 50 μL sob ampliação de 4x para determinar a concentração de villi na suspensão pbs. Por exemplo, se houver 10 villi na suspensão de 50 μL examinada, então a concentração de villi é de 0,2 villi/μL. Este também é o momento para confirmar a ausência de criptas amarradas.</li>
	<li>Calcule o volume de suspensão de villi necessário para a placa em uma concentração de 0,5 villi/μL da matriz BME-R1. Adicione 100 μL extras para explicar o erro de pipetação e o volume necessário para o exame microscópico necessário para garantir a pureza do villi. ATENÇÃO: A pressão utilizada nos dois primeiros arranhões, que remove o muco, mas não o villi, deve ser usada nos arranhões subsequentes durante os quais villi será liberado. Limitar o número de raspagens para lá e para cá para dois após a liberação de villi é observado pela primeira vez. Esta medida evita a liberação de villi com as criptas amarradas. É essencial avaliar microscopicamente o villi para garantir a ausência das criptas amarradas.</li>
</ol>4. Chapeamento de villi na matriz BME-R1
<ol><li>Utilizando uma ponta de tubulação revestida de 0,1% BSA p200, transfira para um tubo de microcentrifusagem o volume de villi (a partir da etapa 3.6) necessário para a placa a uma densidade de ~ 6 villi por poço em 12,5 μL de matriz BME-R1. O uso de ponta sem corte revestida com BSA neste ponto garante que os villi, que são muito grandes para uma ponta pontiaguda, sejam aspirados sem serem bloqueados ou perdidos por ficarem presos às laterais da ponta.</li>
	<li>Gire o villi por 2 min a 200 x g em uma centrífuga refrigerada (4 °C) e remova o supernatante.</li>
	<li>Repita o passo 4.2 para remover qualquer PBS residual e proceda para o próximo passo sob um capô de fluxo laminar.</li>
	<li>Resuspenque a pelota de villi suavemente na quantidade necessária de BME-R1 frio descongelado no gelo.</li>
	<li>Utilizando um tubo p20, placa 12,5 μL/bem do villi na matriz BME-R1 em 3D em uma placa de fundo U pré-armada de 96 poços.</li>
	<li>Incubar a placa em uma incubadora de cultura tecidual a 37 °C por 15 minutos para permitir a solidificação da matriz BME-R1.</li>
	<li>Adicionar 125 μL/bem de ENR pré-aquecido (fator de crescimento epidérmico/Noggin/R-spondin1) mídia: mídia DMEM F-12 avançada, suplementada com 1x Penicilina: Estreptomicina, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 5% de mídia condicionada de células HEK293-T expressando R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine e 0,05 mg/mL Primocin.</li>
	<li>Incubar o villi banhado em uma incubadora de cultura de tecidos mantida a 37 °C com 5% de CO2, e mudar a mídia a cada dois dias.</li>
	<li>Descarte qualquer poço em que organoides apareçam antes de dois dias de chapeamento, já que o ponto de tempo mais antigo em que os organoides derivados de Villi são esperados é depois de dois dias. NOTA: Qualquer villi que tenha metade ou mais da metade do comprimento de villi são contados como um villus. Ao contrário dos organoides derivados da cripta, os organoides derivados de villi não são esperados dentro de 24 horas após o revestimento. As villis que iniciam organoides parecem estar escurecendo e encolhendo antes da formação de organoides. Assim, quaisquer poços com organoides em desenvolvimento dentro de um dia de revestimento devem ser descartados para evitar a plausibilidade de ter derivado da contaminação plausmática cripta. A metodologia utilizada para produzir os meios condicionados está disponível mediante solicitação.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Schwitalla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+tumorigenesis+initiated+by+dedifferentiation+and+acquisition+of+stem-cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties.</a> Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).</li>
<li>Perekatt, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMAD4+Suppresses+WNT-Driven+Dedifferentiation+and+Oncogenesis+in+the+Differentiated+Gut+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium.</a> Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).</li>
<li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).</li>
<li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxl1-expressing+mesenchymal+cells+constitute+the+intestinal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).</li>
<li>Seiler, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+underlying+the+intestinal+epithelium+elicits+proliferation+of+intestinal+stem+cells+following+cytotoxic+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage.</a> Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).</li>
<li>Stzepourginski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34%2B+mesenchymal+cells+are+a+major+component+of+the+intestinal+stem+cells+niche+at+homeostasis+and+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).</li>
<li>Roulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+orchestration+of+intestinal+tumorigenesis+by+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche.</a> Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).</li>
<li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li>
<li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+hedgehog+signals+pattern+the+intestinal+crypt-villus+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis.</a> Development. 132 (2), 279-289 (2005).</li>
<li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dll1%2B+secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li>
<li>Baulies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transcription+Co-Repressors+MTG8+and+MTG16+Regulate+Exit+of+Intestinal+Stem+Cells+From+Their+Niche+and+Differentiation+Into+Enterocyte+vs+Secretory+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).</li>
<li>Zeilstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+CD44v+isoforms+promote+intestinal+cancer+formation+in+Apc%28min%29+mice+downstream+of+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling.</a> Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).</li>
<li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li>
<li>Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+intestinal+identity+and+epithelial-mesenchymal+signaling+by+Cdx2%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2.</a> Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).</li>
<li>Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+and+redundant+functions+of+caudal+family+proteins+in+activating+adult+intestinal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).</li>
<li>Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+master+transcription+factor+CDX2+controls+chromatin+access+for+partner+transcription+factor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).</li>
<li>Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx1+and+Cdx2+exhibit+transcriptional+specificity+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine.</a> PLoS One. 8 (1), 54757(2013).</li>
<li>Stringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx2+determines+the+fate+of+postnatal+intestinal+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm.</a> Development. 139 (3), 465-474 (2012).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Este método pode confirmar a capacidade de auto-renovação de dediferente villi epitélio que adquire marcadores de células-tronco in vivo. O epitélio intestinal normal pode dar origem a organoides da cripta, mas não do compartimento villi, quando cultivado em 3D por causa da presença de células-tronco nas criptas1. Assim, a formação organoide a partir do epitélio villi dediferenciado cultivado em culturas 3D confirma a formação de células-tronco a partir da reversão do destino celular. Os ...

As criptas intestinais, mas não villi, formam organoides quando cultivadas na matriz Matrigel ou BME-R1. Esses organoides são estruturas auto-organizadas, muitas vezes referidas como o "mini-intestino" devido à presença das várias linhagens diferenciadas, progenitora e células-tronco presentes no epitélio intestinal in vivo. O potencial de formar organoides a partir de criptas é atribuído à presença de células-tronco1. Os villi intestinais, por outro lado, consistem apenas em células diferenciadas e, portanto, não podem formar organoides. No entanto, mutações2 ou condições que permitam a desdiferenteação do epitélio villus podem levar a células-tronco no villi2,3. Esta mudança de destino que resulta em caule no epitélio de villi pode ser confirmada pelo chapeamento do epitélio villus dediferente na matriz 3D para determinar seu potencial de formação organoide como um indicador de de-novo caule no epitélio villus. Portanto, o aspecto crítico deste procedimento é garantir a ausência de contaminação por cripta.
A mutação condicional Smad4KO:β-cateninGOF causa dediferente no epitélio intestinal marcado pela expressão de proliferação e marcadores de células-tronco no villi, e eventualmente a formação de estruturas anptóricas nos villi referidas como criptas ectópicas A presença de células-tronco essas villidiferentes foi determinada pela expressão de marcadores de células-tronco nas criptas ectópicas(in vivo)e pela capacidade da villi mutante de formar organoides wh en matrigelbanhado 3. O procedimento abaixo mencionado elabora a metodologia utilizada para confirmar a haste do epitélio intestinal dediferente no Smad4KO:β-cateninGOF mutantes. Uma característica fundamental dessa metodologia para isolar villi foi o uso de raspagem do lúmen intestinal, em oposição ao método de quelação EDTA4. Ao contrário do método de quelação EDTA, o isolamento de Villi, raspando, retém a maioria do mesenquima subjacente e permite ajustar a pressão de raspagem para produzir villi sem criptas amarradas. A pressão da raspagem é subjetiva ao operador, portanto, a pressão ideal para produzir villi sem criptas amarradas deve ser determinada empiricamente pelo operador. O aspecto crítico deste procedimento é garantir a ausência de contaminação por cripta por exame microscópico do villi antes e depois do revestimento na matriz BME-R1.
Villi intestinal são raspados do lúmen intestinal com lâminas de vidro e colocados em um filtro de 70 μm e lavados com PBS para se livrar de células soltas ou criptas, se houver, antes de chapeamento na matriz BME-R1. O método enfatiza os seguintes critérios para evitar a contaminação da cripta: a) confinar a colheita de villi a metade proximal do duodeno onde os villi são os mais longos, b) minimizando o número de arranhões que produzem villi, c) lavar o filtro contendo o villi através de uma série de PBS em um prato de seis poços, e d) confirmando a ausência de contaminação cripta por exame microscópico antes e depois do revestimento na matriz BME-R1. O isolamento de Villi raspando, e não pela quelação edta, evita a perda completa do mesenquima subjacente que pode fornecer os sinais de nicho5,6,7,8, se necessário, para iniciação organoide a partir do epitélio villus.

<table><tbody><tr><td>Mídia avançada DMEM F-12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>3,3-diaminobenzidina</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Placa de fundo em U de 96 poços</td><td>Kit Fisher Scientific</td><td>FB012932</td><td></td></tr><tr><td>ABC</td><td>Vector Labs</td><td>&nbsp; PK4001</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura angular</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-999</td><td></td></tr><tr><td>Animal-Free Recombinante Humano EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50X), menos vitamina A</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA) Pó sem protease</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo CD44</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>1030001</tr><tr><td>Cdx2 anticorpo</td><td>Sinalização celular</td><td>12306</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de milho</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Corning Filtro de células de 70 mícrons</td> Ciências <td>da Vida</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de Membrana Basal do Fator de Crescimento Reduzido Cultrex, Tipo R1</td><td>R& D</td><td>3433-005-R1</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-747</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-456-209</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100X)</td> <td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Células HEK 293-T expressando RSPO-1</td><td>Presente do Dr. Michael Verzi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td> <td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermoscientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de malha</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-201-431</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de vidro Micrscope</td><td>VWR</td><td>89218-844</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplemento (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pontas rombas</td><td>VWR</td><td>46620-642</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Primocin (50mg/mL)</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Quality Biological Inc PBS (10X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-146-770</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Sinal diluente</td><td>Sinalização Celular</td><td>8112L</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 6 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-146-770</td><td></td></tr></tbody></table>

culturação 3d de organoides do epitélio intestinal villi passando por dediferente

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

A clonogenicidade dos organoides do epitélio intestinal é atribuída à presença de células-tronco. O pequeno epitélio intestinal do camundongo é compartimentalizado em criptas e villi: o caule e as células proliferadoras estão confinados às criptas, enquanto o epitélio villi contém apenas células diferenciadas. Assim, as criptas intestinais normais, mas não as villi, podem dar origem a organoides em culturas 3D. O procedimento aqui descrito é aplicável apenas ao epitélio villus submetido à desdiferenteidade que leva à haste. O método descrito usa o smad4-loss-of-function:β-catenin gain-of-function (Smad4KO:β-cateninGOF) rato mutante condicional. A mutação faz com que o villi intestinal desdifera e gere células-tronco no villi. Villi intestinal submetido à desdiferenteização são raspados do intestino usando lâminas de vidro, colocados em um coador de 70 μm e lavados várias vezes para filtrar quaisquer células soltas ou criptas antes do revestimento na matriz BME-R1 para determinar seu potencial de formação organoide. Dois critérios principais foram utilizados para garantir que os organoides resultantes fossem desenvolvidos a partir do compartimento villus dediferente e não das criptas: 1) avaliando microscopicamente o villi isolado para garantir a ausência de quaisquer criptas amarradas, antes e depois do revestimento na matriz 3D, e 2) monitorando o curso temporal do desenvolvimento organoide do villi. A iniciação organoide do villi ocorre apenas dois a cinco dias após o revestimento e parece irregularmente moldada, enquanto os organoides derivados da cripta do mesmo epitélio intestinal são aparentes dentro de dezesseis horas de revestimento e parecem esféricos. A limitação do método, no entanto, é que o número de organoides se formou, e o tempo necessário para a iniciação organoide a partir do villi variam dependendo do grau de desdiferenciação. Portanto, dependendo da especificidade da mutação ou do insulto que causa a desdiferente, o estágio ideal em que villi pode ser colhido para avaliar seu potencial organoide formando, deve ser determinado empiricamente.

O fator determinante para o sucesso do procedimento é prevenir a contaminação por cripta. O desenvolvimento organoide a partir do villi (e não de qualquer criptas contaminantes) é assegurado confirmando quatro critérios principais: 1) assegurando a pureza do villi colhido por exame microscópico antes e depois de emplacar o villi em BME-R1, 2) emplacando o número limitado de villi por poço para permitir a visualização de todos os villi banhados individualmente, 3) onitoring o desenvolvimento de organoide diariamente; imag...

O procedimento descreve o isolamento do villi do epitélio intestinal do camundongo submetido à desdiferente para determinar seu potencial de formação organoide.

Culturação 3D de Organoides do Epitélio Intestinal Villi passando por Dediferente

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Este método pode confirmar a capacidade de formação organoide do epitélio villi deseferentes que adquirem marcadores de células-tronco in vivo. A coleta de villi é realizada através de raspagem em vez do método de quelação EDTA impedindo a perda completa do mesenquime subjacente que pode fornecer os sinais de nicho, se necessário para a iniciação organoide. Este método é aplicável em tecidos epiteliais onde compartimentos proliferativos e diferenciados são fisicamente delineados e as células deseferimento expressam marcadores de células-tronco in vivo.Alguns fatores neste protocolo precisam ser determinados empiricamente, incluindo o estágio ideal para a colheita do villi e a pressão ideal para raspar o villi, o que levará tempo e prática. Induzir o nocaute de Smad4 e o ganho beta-catenin da mutação da função em camundongos mutantes com injeção intraperitoneal de tamoxifen e óleo de milho por quatro dias consecutivos. Depois de eutanásia do camundongo, pulverize o abdômen com 70% de etanol para evitar que o pelo do rato entre na cavidade peritoneal.Abra a cavidade abdominal com a tesoura de dissecção para expor o intestino e isolar o intestino usando tesouras e fórceps. Disseque a metade proximal do duodeno, em seguida, lave o duodeno com cinco mililitros de PBS gelado em uma seringa de 10 mililitros para limpar o conteúdo luminal. Abra o duodeno longitudinalmente com uma tesoura angular e coloque o duodeno plano em uma placa de Petri de 15 centímetros no gelo com o lúmen do duodeno de frente para o operador.Antes de começar a raspagem, coloque um coador de malha de 70 micrômetros em um dos poços de uma placa de cultura de tecido de seis poços. Encha todos os poços com quatro mililitros de 1X PBS e coloque a placa no gelo. Raspe o villi usando dois slides de vidro microscópicos, um para segurar o duodeno para baixo e o outro para raspar.Raspe o lado luminal do duodeno superficialmente duas vezes para remover o muco sem remover o villi, em seguida, raspe o duodeno mais duas vezes para coletar o villi nos slides sem amarrar as criptas. Use uma pipeta de transferência de um mililitro contendo PBS para transferir o villi para um coador de malha de 70 micrômetros no prato de seis poços. Pegue o villi depois de cada arranhão.Para remover criptas soltas, lave o villi coletado com o coador de 70 micrômetros transferindo o coador através de uma série de poços no prato de seis poços contendo quatro mililitros de PBS gelado por poço. Usando uma pipeta P1000, transfira a suspensão villi em cerca de três mililitros de PBS do coador de 70 micrômetros para um novo tubo de 15 mililitros no gelo. Use uma ponta de pipeta P200 revestida com 0,1% BSA para transferir um volume de 50 microliter da suspensão villi em uma lâmina de vidro.Conte o número de villi na gotícula de 50 microliter sob ampliação 4X para determinar a concentração de villi na suspensão pbs e para confirmar a ausência de criptas amarradas. Para emplacar o villi, use uma ponta de pipeta P200 revestida com BSA de 0,1% para transferir o villi para um tubo de microcentrifuuge para uma densidade de revestimento de seis villi por poço em 12,5 microliters de matriz BME-R1. Gire o villi por dois minutos a 200 vezes G a quatro graus Celsius.Remova o sobrenatante e repita a centrifugação para remover qualquer PBS residual. Em um capô de fluxo laminar, resuspenque a pelota de villi suavemente na quantidade necessária de BME-R1 frio descongelado no gelo. Usando uma pipeta P20, placa 12,5 microliters do villi na matriz BME-R1 por poço de uma placa de 96 poços com fundo U pré-aquecida a 37 graus Celsius.Incubar a placa em uma incubadora de cultura tecidual a 37 graus Celsius por 15 minutos para permitir a solidificação da matriz BME-R1. A cada poço, adicione 125 microliters de mídia ENR pré-aquecida suplementada conforme descrito no manuscrito do texto. Incubar o villi banhado em uma incubadora de cultura de tecido a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e mudar a mídia a cada dois dias.Descarte qualquer poço em que organoides apareçam antes de dois dias. Há uma diferença na aparência dos organoides emergindo das criptas versus o epitélio villi dese diferenciado do mesmo intestino do rato. Os organoides derivados da cripta aparecem da noite para o dia como estruturas esféricas com bordas bem definidas.A cinética e a aparência morfológica dos organoides iniciados a partir de villi foram examinadas, que aparecem irregularmente moldadas no início e levam de dois a cinco dias antes de serem vistas sob um microscópio. A iniciação organoide de dois villi diferentes é mostrada. O villi com potencial de formação organoide parece denso, possivelmente devido à retenção do mesenquime subjacente.A iniciação organoide das vilas é aparente no segundo dia de um dos villi. Enquanto nas outras vilas, o organoide aparece no quarto dia. É crucial tomar as medidas adequadas para evitar a contaminação por cripta ao colher os villi e cultivar os organoides resultantes.Diferenças fenotípicas entre os organoides emergindo das criptas e villi do mesmo mutante foram observadas após este procedimento, de modo que mais experimentações poderiam ser realizadas para procurar diferenças moleculares entre os dois. Este protocolo poderia ser usado para estudar as diferenças entre organoides decorrentes de criptas endógenas versus criptas ectópicas decorrentes da deseferibrência, assim, implicações de deseferibrência poderiam ser abordadas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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