Um protocolo aprimorado de tempo e trabalho-eficiente para o isolamento primário do hepatocito do rato
25 de outubro de 2021
Hepatócitos primários são uma ferramenta valiosa para estudar a resposta hepática e o metabolismo in vitro. Utilizando reagentes disponíveis comercialmente, foi desenvolvido um protocolo aprimorado de tempo e trabalho eficiente para o isolamento primário do hepatócito do rato.
Hepatócitos primários do rato são importantes em estudos hepáticos. Especialmente para o metabolismo da glicose, e testes de drogas hepáticas. Tempo sábio o processo de isolamento pode ser demorado e a energia cara.
Este protocolo pode fornecer uma maneira eficiente de isolar hepatócitos primários do mouse. É tempo e trabalho amigável. Exigindo pouquíssimas etapas com todas as regiões disponíveis comercialmente.
Comece usando a bomba peristáltica para começar a bombear água destilada dupla a uma velocidade de 4 mL por minuto, durante cinco minutos. Em seguida, troque o tubo de bombeamento da água para o meio de perfusão aquecido. Monitorando a bolha de ar entre a água e o meio de perfusão.
Ajudará a rastrear o fluxo do meio de perfusão através do sistema. Em seguida, desinfete o abdômen de um rato fêmea C57 preto 6J de oito semanas com 70% de etanol. E usando uma tesoura, abra o abdômen para expor o fígado, a veia portal e a veia inferior.
Então pare a bomba peristáltica. Depois de garantir que o tubo de bombeamento contenha meio de perfusão e não água. Insira um cateter de calibre 24 na cava vena inferior.
Ligue a bomba e corte a veia do portal aberta. Enquanto o meio de perfusão está sendo bombeado, pressione a veia portal a cada minuto para deixar o líquido alcançar cada canto do fígado. Continue bombeando por aproximadamente três a cinco minutos ou até que o líquido liberado esteja limpo.
Em seguida, altere o tubo de bombeamento do meio de perfusão para o meio de despase colagenase. E pressione a veia do portal a cada minuto para deixar o líquido alcançar cada canto do fígado. Continue bombeando até que todos os 25 mL do meio de despastê colagenase estejam esgotados.
Em seguida, isole todo o fígado sem a vesícula biliar. E colocou-o em 30 mL de meio de lavagem em uma placa de Petri no gelo. Usando fórceps rasgam o fígado em pedaços para liberar hepatócitos primários na solução.
Nesta fase, o meio de lavagem se transforma em uma solução nublada contendo hepatócitos primários liberados e pequenos pedaços de fígado. Filtre esta solução nublada através de um filtro de células de 70 mn, em 20 mL de 1X por chamada HBSS em um tubo de 50 mL no gelo. E misture a solução invertendo o tubo 20 vezes.
Em seguida, centrifugar a solução. Então, na capa da cultura do tecido, aspire o supernante. E lave a pelota com 30 mL de meio de lavagem a frio.
Pelota as células mais uma vez com centrifugação. Remova o supernasce e suspenda a pelota em 25 mL de meio de cultura. Conte as células e emplaque-as em placas de cultura desejadas.
De acordo com o projeto experimental. Após o revestimento, hepatócitos primários isolados foram firmemente ligados por uma hora e totalmente expandidos após 12 horas. Nos hepatócitos isolados, os níveis de mRNA de marcadores hepatócitos, como transtíretina, CD95, ASGR1 e ASGR2 foram significativamente aumentados em comparação com todo o fígado.
Em contraste, a presença de células imunes, células estelares e células endoteliais foi menor. Como evidenciado por uma redução acentuada nos níveis de CD45, colágeno tipo 1 alfa 1, e célula endotelial 2 níveis de quinase 2 mRNA. Sugerindo que este protocolo pode reduzir muito a interferência de outras células hepáticas.
Após o revestimento dos níveis ASGR1 e ASGR2 diminuiu com o tempo, mas permanece comparável a todo o fígado até o ponto de tempo de 12 horas. Especialmente para ASGR1. O nível de expressão da membrana ligada ao CD81 foi consistente por até 48 horas.
Em comparação, a expressão do receptor 4 em número de pedágio aumentou e tornou-se mais alta do que os níveis in vivo após 48 horas. Ensaios de sensibilidade à insulina demonstraram que a insulina promoveu significativamente a fosforilação de ambos os AKT em serina 473. E caixa de garfo 01 no Serine 256, nos hepatócitos.
Indicando a sensibilidade dos hepatócitos primários à insulina. Os níveis de proteína de phosphoenolpyruvate carboxykinase aumentaram significativamente após o tratamento de glucagon. Sugerindo que a via de produção de glicose foi ativada.
Essa ativação foi confirmada ainda pelo aumento da produção de glicose. E com outros estimuladores de produção de glicose como Forskolin+IBMX. Este protocolo pode economizar tempo e energia para estudos usando hepatócitos primários do rato.
Seguindo este protocolo, podem ser realizados experimentos relacionados, como o hipotético metabolismo de glicose e ensaios biomarcadores farmacêuticos.
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Visão geral
Este estudo apresenta um protocolo eficiente em termos de tempo e trabalho para isolar hepatócitos primários de camundongo, que são cruciais para pesquisas sobre função e metabolismo hepático. O método utiliza reagentes comercialmente disponíveis para aumentar o rendimento e minimizar a interferência de células não parenquimatosas.
Componentes principais do estudo
Área de pesquisa
- Metabolismo hepático
- Metabolismo da glicose
- Teste de drogas
Fundo
- Hepatócitos primários de camundongo são essenciais para estudar a biologia do fígado.
- Métodos tradicionais de isolamento são frequentemente demorados e trabalhosos.
- Reduzir o tempo de isolamento pode facilitar experimentos biológicos mais eficientes.
Métodos utilizados
- Protocolo de isolamento usando bomba peristáltica e meio de dispase de colagenase.
- Modelo de camundongo: camundongos fêmeas C57BL/6J.
- Técnicas para cultura celular e medição da expressão gênica.
Principais resultados
- Níveis aumentados de mRNA de marcadores de hepatócitos em comparação com o fígado inteiro.
- Presença diminuída de células imunes e endotélicas após o isolamento.
- Sensibilidade à insulina demonstrada e vias de produção de glicose ativadas.
Conclusões
- Este protocolo melhora significativamente a eficiência do isolamento de hepatócitos primários.
- Entendimento aprimorado do metabolismo da glicose e resposta a medicamentos em estudos hepáticos.
Perguntas frequentes
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of primary hepatocytes is critical for liver metabolism and drug testing studies, where time and labor constraints impact throughput in discovery workflows. This protocol reduces isolation time to ~35 minutes while maintaining hepatocyte yield and purity, supporting rapid hypothesis testing in preclinical models. The method enables scalable preparation of disease-relevant systems for mechanistic de-risking in target validation and lead identification pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Provides purified hepatocytes for interrogating therapeutic hypotheses in glucose metabolism and hepatic drug response pathways.
- Operational Value: Reduces time and labor burden, enabling higher throughput in target validation assays.
- Predictive Value: Yields hepatocytes with demonstrated insulin sensitivity and gluconeogenesis activation, supporting mechanistic de-risking of liver targets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers hepatocytes with low non-parenchymal cell interference, improving assay specificity for compound screening.
- Operational Value: Uses commercially available reagents and standardized steps, enhancing reproducibility across screening campaigns.
- Scalability: Enables preparation of validated biological systems suitable for high-content or phenotypic screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems for preclinical validation of liver-targeted compounds.
- Risk-Adjusted Advancement: Generates hepatocytes with validated glucose production and insulin response, informing go/no-go decisions.
- Biomarker Alignment: Maintains hepatocyte marker expression (ASGR1, ASGR2, CD81) for up to 12 hours, enabling biomarker-assay compatibility.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical studies, providing a reliable source of primary hepatocytes for liver metabolism assays.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of hepatic pathways by delivering hepatocytes with confirmed marker expression and functional responses.
- Screening: Produces hepatocytes suitable for compound evaluation due to reduced stromal cell contamination and consistent insulin sensitivity.
- Analytics: Supports quantitative readouts such as glucose production, phosphorylation assays, and mRNA expression of hepatocyte markers.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work by providing hepatocytes that maintain key metabolic functions for up to 48 hours.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation capability that standardizes hepatocyte preparation across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in liver metabolism studies through reduced cellular interference and functional validation.
- Operational Value: Streamlines workflow with minimal steps and commercially available reagents, improving lab efficiency.
- Strategic Value: Accelerates discovery timelines by reducing isolation time from hours to ~35 minutes, increasing assay frequency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of liver targets by providing reliable preclinical models for mechanism validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse surgery and perfusion techniques.
- Depends on access to a peristaltic pump and sterile tissue culture environment.
- Necessitates standardized reagent preparation (perfusion medium, collagenase dispase, wash and culture media).
- Involves adaptation considerations for different mouse strains or ages beyond the C57BL/6J female model used.
- Limited by the need for immediate use of isolated hepatocytes to maintain functional integrity, as marker expression declines after 12 hours.
