Espectroscopia de correlação de fluorescência de variação spot para análise de difusão molecular na membrana plasmática de células vivas
12 de novembro de 2020
Este artigo tem como objetivo apresentar um protocolo sobre como construir um microscópio de espectroscopia de correlação de fluorescência (svFCS) para medir a difusão molecular na membrana plasmática das células vivas.
A visão atual da organização lateral da membrana plasmática permanece incompleta. Por esse motivo, é importante implementar algumas novas técnicas inovadoras, como a Espectroscopia de Correlação de Fluorescência de variação pontual. Esta é uma técnica muito poderosa caracterizada por excelente resolução de tempo e espaço.
Além disso, não é invasivo e permite estudar as membranas celulares em condições fisiológicas. Todos os dias, antes de executar um experimento, abra todos os diafragmas da íris e use um medidor de potência para medir a potência do laser com a primeira íris totalmente aberta. Gire a placa intermediária para localizar a potência máxima.
Se a potência do laser for menor do que o normal, use as íris para verificar o alinhamento e mova alternadamente L1 e M1 conforme necessário. Em seguida, anote o valor de potência em um caderno de laboratório. Para verificar o caminho de detecção, coloque água, uma lamínula e uma gota de solução de rodamina 6G nanomolar na objetiva.
Em seguida, inicie o software do correlador e registre os dados. A função de autocorrelação deve exibir uma baixa quantidade de ruído, um pequeno tamanho de desperdício e uma alta taxa de contagem por molécula por segundo. Para calibrar o tamanho do ponto, coloque uma lamínula codificada para cultura de células na objetiva de imersão em água e adicione 200 microlitros de solução de rodamina 6G nanomolar à lamínula.
Ajuste a potência do feixe de laser de 488 nanômetros para 300 microwatts e, no software, selecione a porta do microscópio de detecção de iluminação svFCS. Ligue o APD e abra a íris até que um sinal caia para obter o tamanho mínimo de desperdício ou feche-o para um tamanho de desperdício maior. Registre cerca de 10 funções de correlação automática de 20 segundos para melhorar a reprodutibilidade estatística e desligar o APD.
Em um programa de análise de dados apropriado, verifique e descarte os ensaios com fortes flutuações devido a agregados moleculares, depois ajuste a média da função de autocorrelação retida com um modelo de difusão 3D, extraia o tempo médio de difusão dos parâmetros de ajuste e salve os dados como um arquivo TXT. Para análise svFCS, ajuste o feixe de 488 nanômetros alimentado entre dois a quatro microwatts e equilibre as amostras por 10 minutos a 37 graus Celsius. Selecione a porta do microscópio de detecção de iluminação svFCS e no APD.
Em seguida, execute uma varredura XY e uma varredura Z da célula selecionada. Selecione a membrana plasmática na parte superior da célula para localizar o ponto confocal na intensidade máxima de fluorescência e iniciar a aquisição de dados. No software correlador, registre uma série de 20 execuções de cinco segundos.
Após a última execução, desligue o APD e descarte todas as execuções inesperadas, conforme demonstrado. Ajuste a função de correlação automática média com um modelo de difusão 2D de duas espécies e salve os parâmetros de ajuste no arquivo TXT salvo anteriormente. Quando todas as células de interesse tiverem sido registradas, analise pelo menos quatro tamanhos de resíduos variando entre 200 a 400 nanômetros para estabelecer uma única lei de difusão.
Em seguida, no MATLAB, selecione uma pasta contendo todos os arquivos TXT correspondentes a pelo menos quatro experimentos de tamanho de resíduos e plote o tempo de difusão versus o desperdício quadrado. Nesta figura, pode-se observar uma lei de difusão para Thy1-GFP expressa em células Cos7. A lei de difusão tem um valor positivo de tempo zero, indicando que o Thy1-GFP está confinado dentro de estruturas de nanodomínio da membrana plasmática.
Nesta análise, o tratamento com colesterol oxidase das células que expressam Thy1-GFP resultou na mudança do valor zero do tempo da lei de difusão para 7,36 mais ou menos 1,34 milissegundos. Confirmando que a natureza do confinamento Thy1-GFP depende do teor de colesterol e está associada a nanodomínios de jangada lipídica. Uma diminuição pequena, mas significativa, no conteúdo de colesterol total também foi observada após o tratamento com colesterol oxidase.
Como essa enzima atua apenas no pool de colesterol acessível no folheto externo da membrana plasmática, esses dados sugerem que a diminuição observada no colesterol está associada apenas à membrana plasmática e causa desestabilização dos nanodomínios da jangada lipídica. A coisa mais importante ao tentar este procedimento é a calibração adequada do sistema svFCS e a preparação das células para a análise. O svFCS é uma excelente ferramenta para estudar a organização da membrana celular.
No entanto, também pode ser usado para analisar a difusão de moléculas intracelulares. Esta técnica pode ser implementada com sucesso na biomedicina para determinar a influência dos potenciais fármacos nas células vivas, como as células cancerígenas.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para a construção de um microscópio de Espectroscopia de Correlação de Fluorescência com variação de ponto (svFCS) para medir a difusão molecular na membrana plasmática de células vivas. A técnica oferece excelente resolução temporal e espacial, sendo ao mesmo tempo não invasiva.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Microscopia de Fluorescência
Contexto
- A organização lateral da membrana plasmática não é totalmente compreendida.
- São necessárias técnicas inovadoras, como a svFCS, para obter melhores insights.
- A svFCS permite o estudo das membranas celulares em condições fisiológicas.
- A calibração adequada e o preparo das células são cruciais para resultados precisos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para microscopia svFCS.
- Medir a difusão molecular na membrana plasmática.
- Analisar a influência do colesterol na organização da membrana.
Métodos Utilizados
- Calibração do sistema svFCS utilizando solução de rodamina 6G.
- Aquisição de dados por meio de varreduras XY e Z de células selecionadas.
- Análise das leis de difusão utilizando MATLAB.
- Comparação dos parâmetros de difusão antes e após o tratamento com colesterol oxidase.
Resultados Principais
- A difusão de Thy1-GFP é confinada dentro de estruturas de nanodomínios.
- O tratamento com colesterol oxidase altera o valor do tempo zero da lei de difusão.
- Foi observada uma diminuição no conteúdo total de colesterol.
- O estudo sugere que o colesterol influencia a estabilidade das balsas lipídicas.
Conclusões
- A svFCS é eficaz para estudar a organização da membrana celular.
- A técnica também pode analisar a difusão de moléculas intracelulares.
- Os achados têm implicações para a compreensão dos efeitos de fármacos em células vivas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A Espectroscopia de Correlação de Fluorescência com Variação de Ponto (svFCS) permite uma análise de alta resolução da difusão molecular na membrana plasmática em condições fisiológicas, fornecendo informações essenciais sobre a organização da membrana e a dinâmica de rafts lipídicos. Essa capacidade apoia a validação de alvos ao elucidar o contexto biofísico de proteínas associadas à membrana, contribuindo para a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. A natureza não invasiva do método e sua compatibilidade com células vivas aumentam sua utilidade em triagens pré-clínicas e estudos translacionais de biomarcadores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas mediante a quantificação do comportamento de difusão de proteínas de membrana, como a Thy1-GFP, dentro de estruturas de nanodomínios.
- Valor Operacional: Revela o confinamento dependente de colesterol, permitindo a validação funcional de associações com microdomínios lipídicos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar alvos cuja localização na membrana é sensível a perturbações no ambiente lipídico.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos, estabelecendo leis de difusão de referência sob condições fisiológicas.
- Saída Quantitativa: Gera medidas reprodutíveis de tempo de difusão em diferentes tamanhos de cintura do feixe, apoiando a padronização do ensaio.
- Relevância para Triagem: Detecta alterações induzidas por compostos nos parâmetros de difusão, indicando modificações na organização da membrana ou no engajamento do alvo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela a desorganização de nanodomínios em microduplicatas da membrana plasmática, relevante para patologias envolvendo disregulação lipídica.
- Continuidade Translacional: Conecta observações iniciais de descoberta à validação pré-clínica, demonstrando como perturbações ambientais (por exemplo, modulação do colesterol) alteram o comportamento do alvo.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Fornece leituras mecanicistas que orientam critérios de avançar/não avançar com base na resiliência do alvo frente a perturbações na membrana.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
svFCS insere-se no continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos promissores e a validação pré-clínica, oferecendo uma camada biofísica de caracterização que complementa ensaios bioquímicos e fenotípicos.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a medição de coeficientes de difusão e a identificação de populações moleculares confinadas versus móveis.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio de calibração padronizada utilizando rodamina 6G e validação da integridade do caminho de detecção.
- Análises: Fornece leis quantitativas de difusão por meio da análise em MATLAB de funções de autocorrelação, permitindo a comparação do comportamento molecular entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona alterações na organização da membrana com resultados funcionais, apoiando o alinhamento de biomarcadores quando mudanças na difusão se correlacionam com respostas fenotípicas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para o estudo da dinâmica de proteínas de membrana em múltiplos alvos e linhagens celulares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao resolver a confinação em escala nanométrica e a heterogeneidade da difusão na membrana plasmática.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio da calibração padronizada da potência do laser, verificações do caminho de detecção e média de funções de autocorrelação replicadas.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção ao quantificar a estabilidade do alvo em ambientes de membrana semelhantes aos naturais, reduzindo a eliminação tardia devido a limitações biofísicas imprevistas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em sua dependência da integridade das balsas lipídicas para localização e função adequadas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência, segurança com laser e análise de dados de espectroscopia de correlação.
- Exige um microscópio de fluorescência personalizado com fotodiodo de avalanche (APD), software correlacionador e controle preciso da potência do laser (2–4 µW para medições de svFCS).
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de calibração (por exemplo, validação do tamanho do ponto da rodamina 6G) e dos fluxos de análise de dados (por exemplo, ajuste em MATLAB de modelos de difusão 2D).
- Envolve considerações de adaptação para diferentes proteínas de membrana, tipos celulares e agentes de perturbação além da colesterol oxidase.
- Limitado pela necessidade de preparação cuidadosa da amostra para evitar agregados moleculares e garantir relevância fisiológica durante a equilibração a 37°C.
