Name: Espectroscopia de correlação de fluorescência de variação spot para análise de difusão molecular na membrana plasmática de células vivas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Aprenda a usar a espectroscopia de correlação de fluorescência de variação spot (svFCS) para analisar a difusão molecular na membrana plasmática de células vivas. Esta técnica não invasiva oferece excelente resolução temporal e espacial para estudar a organização da membrana celular.

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SB, SM e DM foram apoiados pelo financiamento institucional do CNRS, Inserm e Aix-Marseille University e bolsas de programa da Agência Nacional de Pesquisa Francesa (ANR-17-CE15-0032-01 e ANR-18-CE15-0021-02) e o francês "Investissement d'Avenir" (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). A KW reconhece o "BioTechNan", um programa de estudos interdisciplinares de doutorado ambiental KNOW na área de Biotecnologia e Nanotecnologia. A EB reconhece o apoio financeiro do Centro Nacional de Ciência da Polônia (NCN) sob o projeto nº 2016/21/D/NZ1/00285, bem como do Governo francês e da Embaixada da França na Polônia. MŁ reconhece o apoio financeiro do Ministério do Desenvolvimento polonês (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) e do Centro Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17). A TT reconhece o apoio financeiro do Centro Nacional de Ciência da Polônia (NCN) sob o projeto nº 2016/21/B/NZ3/00343 e do Centro de Biotecnologia Wroclaw (KNOW).

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Os autores não têm nada a revelar.

Aqui, descrevemos a implementação do módulo svFCS em um microscópio fluorescente padrão, uma abordagem experimental poderosa para decifrar a dinâmica da organização da membrana plasmática em células vivas graças à análise da lei de difusão fcs. Conceitualmente, o svFCS baseia-se em um princípio simples: medidas de correlação de fluorescência no domínio do tempo, variando o tamanho da área de iluminação23. Essa estratégia tem sido fundamental para deduzir informações nanoscópicas de medições microscópicas, o que ajuda a decifrar os principais elementos físico-químicos que contribuem para a organização da membrana plasmática em estado estável25 e processos fisiológicos 30,31,32,33. Ao todo, essas análises svFCS demonstram inequivocamente a existência de nanodomínios dependentes de lipídios em vários tipos de células e sua implicação direta na sintonia de diferentes eventos de sinalização.
Dentro deste quadro, existem alguns aspectos ópticos que precisam ser considerados durante a construção da configuração svFCS para otimizar o orçamento do fóton e minimizar aberrações ópticas. Assim, recomendamos o uso de um microscópio do qual a lente do tubo pode ser removida quando a medição svFCS é realizada. Além disso, uma única íris desempenha um papel fundamental na configuração svFCS: altera o tamanho do feixe na abertura traseira do objetivo, variando diretamente o tamanho efetivo da cintura (ou seja, o volume de excitação eficaz). O diâmetro do feixe deve caber na pupila traseira objetiva para obter o menor tamanho da cintura34. Essa opção, que ajuda a ajustar o tamanho da cintura, garante a otimização do orçamento do fóton e é fácil de implementar. Finalmente, um número mínimo de peças ópticas são usadas ao longo do caminho da luz; quanto menos complexo o sistema, menos os fótons que são perdidos. Todas essas opções melhoram significativamente a robustez dos experimentos svFCS.
Em relação ao protocolo em si, alguns passos críticos devem ser considerados. O mais importante é um alinhamento adequado dos caminhos ópticos que é crucial para medições svFCS bem sucedidas (protocolo, seção 2). Isso é fácil de verificar analisando o sinal de fluorescência de uma solução 2 nM Rh6G, que deve ser ~200 kHz sob iluminação laser de 300 μW. Todas as íris devem ser abertas, e os ACFs devem ter uma amplitude importante (tipicamente G0~1,5-2.0). Outro ponto crítico diz respeito às células e à sua preparação para a análise do SVFCS (protocolo, seções 4-8). Sua densidade deve ser adaptada para que as células isoladas sejam observadas para análise. As células não aderentes devem ser imobilizadas em um vidro de cobertura com câmara usando a solução de poli-L-lysine. O sinal de fluorescência da rotulagem celular não deve ser muito forte, ou resultará em ACFs muito planos que são difíceis de encaixar, e os parâmetros de ajuste são sobrecarregados com um erro importante. Além disso, a rotulagem nonhomogógena e os agregados de fluorescência nas células tornam as medidas svFCS extremamente difíceis de interpretar. Finalmente, o tratamento oxidase do colesterol afeta a viabilidade celular, e a análise do svFCS não deve exceder uma hora após o tratamento. Também é melhor registrar as flutuações de fluorescência da membrana plasmática superior, pois não está ligada ao suporte, e não há risco de difusão dificultada de moléculas devido às interações físicas com o suporte.
Houve avanços suficientes na técnica svFCS para seu uso em diferentes abordagens devido à diversidade de modalidades para ajuste do volume de detecção, possibilitando o estudo de diversos processos biológicos em células vivas. Uma alternativa para ajustar o tamanho do volume de excitação é usar um expansão de feixe variável35. Também é possível simplesmente modular o tamanho da área de iluminação registrando o sinal fluorescente a partir da interceptação da membrana plasmática ao longo da direção z36. Isso pode ser feito em um microscópio confocal padrão para o qual foi desenvolvido um arcabouço teórico para derivar a lei de difusão 37,38.
Embora o método svFCS ofereça resolução espátula-temporal, necessária para a caracterização da organização lateral inhomogênea da membrana plasmática, os modos geométricos de confinamento não são mutuamente exclusivos. Um desvio de t0 em uma direção ou outra revela exclusivamente um modo dominante de confinamento25. Além disso, outra limitação importante do presente método svFCS resulta do limite clássico de difração óptica (~200 nm). Isso é inquestionavelmente maior do que os domínios que confinam as moléculas dentro da membrana plasmática celular. Portanto, a análise do confinamento é inferida a partir do valor t0 , extrapolado da lei de difusão.
Essa desvantagem foi superada pela implementação de métodos alternativos. Inicialmente, o uso de películas metálicas perfuradas com nanoaperaturas oferecia a possibilidade de iluminar uma área de membrana muito pequena (ou seja, abaixo do limite de difração óptica de aberturas nanométricas únicas de raios variando entre 75 e 250 nm)39. Assim, foi relatado o regime de transição previsto a partir da lei de difusão teórica para organização de domínios isolados, permitindo um refinamento do tamanho característico das heterogeneidades da membrana nanométrica e uma estimativa quantitativa da área superficial ocupada por nanodomínios dependentes de lipídios39. Alternativamente, a iluminação nanométrica também foi desenvolvida usando microscopia óptica de varredura de campo próximo40 ou nanoantennas ópticasplanar 41. Mais recentemente, a combinação de esgotamento estimulado de emissões (STED) e FCS forneceu uma ferramenta poderosa e sensível para documentar a lei de difusão com resolução espacial muito alta. Este STED-FCS dá acesso a características de difusão molecular em uma nanoescala que ocorre dentro de um curto período de tempo, permitindo o estudo da organização dinâmica de sondas lipídicas na membrana plasmática42,43. No entanto, a supressão incompleta da fluorescência no processo STED desafia a análise das curvas de auto correlação em FCS.
Um novo modelo de montagem foi desenvolvido para superar essa dificuldade, melhorando a precisão dos tempos de difusão e medições médias dos números de moléculas44. Finalmente, para difusão molecular lenta na membrana plasmática, o princípio svFCS pode ser aplicado a dados registrados pela espectroscopia de correlação de imagem45. Recentemente, foi demonstrado que a combinação da microscopia de força atômica (AFM) com a imagem total de reflexão interna-FCS (ITIR-FCS) contribui para o refinamento da natureza do mecanismo que dificulta a difusão molecular na membrana plasmática, especialmente perto da configuração da membrana do limiar de percolação devido a uma alta densidade de nanodomínios46.
Em conclusão, a criação da lei de difusão pela SVFCS forneceu evidências experimentais para inferir a heterogeneidade local criada por lipídios coletivos dinâmicos e associações de proteínas de membrana. Como afirmado por Wohland e seus colegasde trabalho 46, "a análise da lei de difusão da FCS continua sendo uma ferramenta valiosa para inferir características estruturais e organizacionais abaixo do limite de resolução de informações dinâmicas". Ainda assim, precisamos desenvolver novos modelos para refinar a interpretação da lei de difusão que deve permitir uma melhor compreensão da dinâmica dos eventos moleculares que ocorrem na membrana plasmática.

A complexidade da organização da membrana plasmática A compreensão atual da organização da membrana celular tem que levar em conta vários aspectos1. Primeiro, uma composição lipídica complexa varia não apenas entre os tipos celulares, mas também dentro de uma única célula (organelas de membrana/membrana plasmática). Além disso, as proteínas de membrana associada ou intrínseca são principalmente organizadas em complexos multimédicos dinâmicos, com grandes domínios se estendendo fora da membrana, representando uma área significativamente maior do que a dos domínios transmembranos sozinhos. Além disso, as proteínas associadas à membrana apresentam capacidades específicas de ligação lipídica ou interação lipídica que desempenham papéis na regulação da função proteica. Estes dependem diretamente da composição local e acessibilidade dos lipídios2.
Finalmente, observa-se um nível significativo de assimetria entre dois folhetos de membrana devido à estrutura assimétrica intrínseca das proteínas da membrana e à distribuição de lipídios. De fato, um equilíbrio metabólico lipídico entre síntese e hidrólise, combinado com flip-flop lipídico entre os folhetos, gera tal distribuição assimétrica. Como qualquer transporte através do bicamado é limitado pela energia livre necessária para mover o grupo polar através do interior hidrofóbico das membranas, geralmente é assistido por transportadores seletivos. Para cada tipo de célula, a assimetria tende a ser mantida firmemente. Ao todo, esses fatores contribuem para a inhomogeneidade lateral ou compartimentação da membranaplasmática 3,4.
Enriquecemos essa representação da membrana plasmática levando em conta a difusão molecular intrínseca dentro e em toda a bicamada, o que contribui para a heterogeneidade lateral dinâmica em uma escala de décimos a centenas de nanômetros e microssegundos a segundos. Por exemplo, nanodomínios de membrana dependentes de lipídios — as chamadas balsas lipídicas, definidas como colesterol e plataformas de sinalização ricas em sphingolipid — contribuem para a compartimentação da membrana plasmática 5,6. No entanto, a visão atual da organização da membrana não se restringe apenas a jangadas lipídicas. Nanodomínios de membrana são mais complexos e heterogêneos na composição, origem e função. Ainda assim, sua presença na membrana plasmática deve ser fortemente coordenada, e interações dinâmicas entre proteínas e lipídios parecem ser importantes na distribuição espacial e modificação química dos nanodomínios de membrana 1,3,7,8.
O princípio svFCS e sua aplicação para sondar a organização da membrana plasmática Embora muito progresso tenha sido feito na análise dos domínios da membrana, principalmente através de técnicas biofísicas, os determinantes que ditam a organização local da membrana plasmática precisam ser refinados com resolução espacial e temporal adequada. Determinantes baseados no rastreamento de moléculas individuais fornecem excelente precisão espacial e permitem a caracterização de diferentes modos de movimento 9,10,11,12, mas têm uma resolução temporal limitada com taxas clássicas de quadros de câmera baixa e requerem mais esforço experimental para registrar um número significativo de trajetórias. Alternativamente, o coeficiente de difusão dos componentes da membrana pode ser avaliado pela recuperação da fluorescência após o fotobleaching (FRAP)13 ou espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS)14. Este último tem recebido mais atenção, principalmente por sua alta sensibilidade e seletividade, volume de detecção microscópica, baixa invasividade e ampla gama dinâmica15.
A base conceitual da FCS foi introduzida por Magde e colegas há cerca de 50 anos, 16,17. Baseia-se no registro da flutuação da emissão de fluorescência com alta resolução temporal (de μs a s)18. Em sua versão moderna, as medições em células vivas são realizadas por um pequeno volume de excitação confocal (~0,3 femtoliters) posicionado dentro de uma região de interesse (por exemplo, na membrana plasmática); o sinal de fluorescência gerado pela difusão de moléculas fluorescentes que entra e sai do volume de observação é coletado com resolução temporal muito alta (ou seja, o tempo de chegada de cada fóton no detector). Em seguida, o sinal é computado para gerar a função de autocorrelação (ACF), a partir da qual o tempo médio td (tempo de difusão) para o qual uma molécula permanece dentro do volume focal é extraído, juntamente com o número médio de partículas, (N), presente no volume de observação, que é inversamente proporcional à amplitude do ACF. Este último parâmetro pode ser uma informação útil sobre a concentração da molécula dentro do volume de observação.
Desde então, um número crescente de modalidades de FCS foram implementadas graças ao rápido desenvolvimento da instrumentação em biofotônica, permitindo a descrição de fenômenos dinâmicos que ocorrem em sistemas vivos. Ainda assim, uma espécie molecular experimentaria uma distribuição mais sobreposta dos valores do coeficiente de difusão, o que geralmente é refletido por uma característica de difusão anômica, na qual as moléculas se difundem com uma relação não linear no tempo19, e dificuldade em identificar o significado biológico dessa subdiffusão anômica. No passado, essa dificuldade foi um pouco superada ao registrar a difusão molecular por FRAP de áreas de vários tamanhos, em vez de apenas uma área, fornecendo assim informações espaciais adicionais. Isso possibilitou, por exemplo, a conceituação das microdomínios de membrana 20,21,22.
Uma tradução dessa estratégia para as medições de FCS (ou seja, a chamada espectroscopia de correlação de fluorescência de variação spot (svFCS)) foi estabelecida variando o tamanho do volume focal de observação, permitindo que a flutuação na fluorescência seja registrada em diferentes escalas espaciais23. Assim, a abordagem svFCS fornece informações espaciais indiretas que permitem a identificação e determinação de modos de difusão molecular e tipo de particionamento de membrana (domínios isolados versus contíguos24) de moléculas estudadas. Ao traçar o tempo de difusão td em função das várias escalas espaciais definidas pelo valor da cintura (ω), que corresponde ao tamanho do raio do feixe de detecção neste caso23,25, pode-se caracterizar a lei de difusão de uma determinada molécula em uma determinada condição fisiológica. O svFCS é, portanto, um analógico perfeito para rastreamento de partículas únicas no domínio de tempo26. Sob a restrição de difusão browniana, deve-se esperar uma relação estritamente linear entre o tempo de difusão td e a cintura ω (Figura 1)23,25. A origem do desvio da lei de difusão desse esquema pode ser atribuída a razões não exclusivas, como malha citoesqueleto, aglomeração molecular, particionamento dinâmico em nanodomínios, ou qualquer combinação desses e outros efeitos (Figura 1), e precisa ser testado experimentalmente25.
Aqui fornecemos todos os pontos de verificação necessários para o uso diário de um sistema óptico svFCS personalizado construído do zero, o que complementa nossas revisões de protocolo anteriores27,28 sobre essa abordagem experimental. Além disso, como prova de conceito, damos orientações sobre a calibração da configuração, a preparação de células, aquisição de dados e análise para o estabelecimento da lei de difusão svFCS (DL) para o Thy1-GFP, uma proteína ancorada em membrana plasmática glycosylphosphatidylinositol, que é conhecida por ser localizada em nanodomínios lipídicos-jantas29. Finalmente, demonstramos como a desestabilização parcial dos nanodomínios lipídes-jangadas pelo tratamento oxidase de colesterol impacta as propriedades de difusão do Thy1-GFP. Além disso, uma descrição detalhada da construção de uma configuração svFCS do zero é fornecida em material suplementar.

<table><tbody><tr>Chave inglesa de <td>ferramenta de alinhamento</td><td>para anéis de retenção com rosca SM1</td><td>Fotodiodo de avalanche Thorlabs</td><td>SPW602</td></tr><tr><td>e módulo de contagem de fóton único (SPCM)</td> <td>Módulo de contagem de fóton único, fotodiodo de avalanche</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-AQRH-15</td></tr><tr><td></td><td>BNC 50 e ômega; plugue para 50 e ômega; cabo de plugue 2 m</td><td>RS Componentes</td><td>742-4315</td></tr><tr><td></td><td>Cabo coaxial 415 Cinch Conectores, RG-316, 50 e Omega; Com conector, 1,22 m, RoHS2</td><td>RS Components</td><td>885-8172</td></tr><tr><td></td><td>Tee 50&Omega; Adaptador RF BNC Plug para BNC Socket 0 &rarr; Componentes RS de 1 GHz</td><td></td><td>546-4948</td></tr><tr><td></td><td>Brennenstuhl 2,5 m, 8 Soquete Tipo E - Cabo de Extensão Francês, Componentes RS 230 V</td><td></td><td>768-5500</td></tr><tr><td></td><td>Mascot, Fonte de Alimentação Plug In 6W 5V dc, 1.2A, 1 Fonte de Alimentação de Modo Comutado de Saída, Tipo C</td><td>Componentes RS</td><td>452-8394</td></tr><tr><td></td><td>Cabo de Alimentação do Oscilador de Referência Crystek CCSMACL-MC-24 Adaptador RF</td><td>Componentes RS</td><td>792-4079</td></tr><tr><td>Filtragem de fluorescência</td><td>535/70 ET Bandpass, AOI 0&deg; </td><td>Filtro AHF</td> de 25 mm de diâmetro croma <td>F47-539</td></tr><tr><td></td><td>Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45&deg; Filtro AHF Chroma 25.5 x 36 x 1 mm</td><td></td><td>F43-088</td></tr><tr><td></td><td>496/LP BrightLine HC Longpass, AOI 0&deg; Diâmetro do croma 25</td><td>Filtro AHF</td><td>F37-496</td></tr><tr><td>Correlacionador</td><td>de hardware 80 MHz Correlacionador digital</td><td>Correlator.com</td><td>Flex02-12D</td></tr><tr><td>Laser</td><td>LASER LASOS LDM-XT acoplado à fibra, 488 nm, 65 mW</td><td>Lasos</td><td>BLD-XT 488100</td></tr><tr><td>Fita adesiva preta de alto desempenho de segurança a laser, rolo de 1" x 180' (25 mm x 55 m) Thorlabs</td><td></td><td>T743-2.0</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Lenços de Lentes, 25 Folhas por Livreto, 5 Livretos</td><td>Óculos de Segurança a Laser Thorlabs</td><td>MC-5</td></tr><tr><td></td><td>, Lentes Laranja Claro, Transmissão de Luz Visível 48%</td><td>Microscópio Thorlabs</td><td>LG3B</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>de Fluorescência Invertida Motorizado Zeiss Axiovert 200M Foco fino e grosseiro, rotação da torre refletora, rotação do revólver objetiva, troca de portas de câmera e obturadores de luz interna</td><td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td></td><td>C-Apocromático 40x/1,2 W Korr.selecionado para FCS (D=0,14-0,19 mm) (WD=0,28 mm em D=0,17 mm), UV-VIS-IR</td><td>Carl Zeiss</td><td>421767-9971-711</td></tr><tr><td></td><td>Adaptador W0.8 / M27x0.75 H "5"</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-345</td></tr><tr><td></td><td>Anel médio W0.8 - W0.8 H "5"</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-347</td></tr><tr><td>Caminho óptico</td><td>D25.4mm Espelho, Prata protegida</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td></tr><tr><td></td><td>D25.4mm, F=60.0.mm, Acromático Visível</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-A</td></tr><tr><td></td><td>D25.4mm, F=35.0.mm, Acromático Visível</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-035-A</td></tr><tr><td></td><td>25 &micro; m montado pinhole</td><td>Thorlabs</td><td>P25S I</td></tr><tr><td></td><td>25.4mm Montado Zero, Pedido 1/2 Waveplate 488 nm</td><td>Thorlabs</td><td>WPH10M-488 (HWP)</td></tr><tr><td></td><td>20mm Cubo Divisor de Feixe Polarizador 420-680 nm</td><td>Thorlabs</td><td>PBS201</td></tr><tr><td></td><td>Estágio de Rotação 56 mm x 26 mm ID Roscado</td><td>Thorlabs</td><td>RSP1/M</td></tr><tr><td></td><td>52 mm x 52 mm Montagem de Plataforma Cinemática</td><td>Thorlabs</td><td>KM100B/M</td></tr><tr><td></td><td>Grampo de prisma ajustável</td><td>Thorlabs</td><td>PM3/M</td></tr><tr><td></td><td>Bloco de feixe - área ativa 19 mm x 38 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1/M</td></tr><tr><td></td><td>Diafragma de íris 1 mm a 25 mm Abertura</td><td>Thorlabs</td><td>ID25/M</td></tr><tr><td></td><td>Montagem de lente cilíndrica cinemática para canhotos</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td></tr><tr><td></td><td>Suporte óptico de 1", M4 Tap</td><td>Thorlabs</td><td>MFF101/M</td></tr><tr><td></td><td>Tubo de Lente Empilhável de 1"</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L03</td></tr><tr><td></td><td>Montagem de Lente Empilhável para 1" de profundidade utilizável óptica &frac12;</td>Montagem de lente empilhável <td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td></tr><tr><td></td><td>para profundidade de uso óptico de 1 "2"</td> <td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td></tr><tr><td></td><td>Trilhos ópticos pequenos 600 mm, trilhos</td><td>ópticos pequenos Thorlabs</td><td>RLA600 / M</td></tr><tr><td></td><td>métricos 75 mm, trilhos</td><td>ópticos pequenos Thorlabs</td><td>RLA075 / M</td></tr><tr><td></td><td>métricos 150 mm, suporte</td> ferroviário <td>Thorlabs</td><td>RLA150 / M</td></tr><tr><td></td> métrico<td>, Furo Rebaixado 1"x 1"</td><td>Thorlabs</td><td>RC1</td></tr><tr><td></td><td>Rail Carrier, Perpendicular Dovetail</td><td>Thorlabs</td><td>RC3</td></tr><tr><td></td><td>Montagem de Lente de Tradução de Alta Precisão para 1 polegada</td><td>Thorlabs</td><td>LM1XY/M</td></tr><tr><td></td><td>&frac12; " (12mm) Estágio de Tradução Dovetail</td><td>Thorlabs</td><td>DT12/M</td></tr><tr><td></td><td>Grampos de Trilho</td><td>Thorlabs</td><td>CL6</td></tr><tr><td></td><td>Estágio de Tradução Métrico XYZ (Inclui PT102)</td><td>Thorlabs</td><td>PT3/M</td></tr><tr><td></td><td>Tecido Borracha Preto</td><td>Thorlabs</td><td>BK5</td></tr><tr><td></td><td>Ball Driver kit/ 6 ferramentas</td><td>Thorlabs</td><td>BD-KIT/M</td></tr><tr><td></td><td>Adaptador com Roscas Externas M6 x 1.0 e Roscas Externas M4 x 0.7</td><td>Thorlabs</td><td>AP6M4M</td></tr><tr><td></td><td>Base de Montagem, 25 mm x 58 mm x 10 mm, Pacote com 5</td><td>Thorlabs</td><td>BA1S/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>Montagem de Lente para Óptica de 25.4mm</td><td>Adaptador Thorlabs</td><td>LMR1/M</td></tr><tr><td></td><td>SM1 FC/APC</td><td>Thorlabs</td><td>SM1FCA</td></tr><tr><td></td><td>Montagem de Espelho Cinemático Para Óptica de 1 polegada</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td></tr><tr><td></td><td>Cabeça de Potência de Silício, 400-1100nm, 50mW</td><td>Thorlabs</td><td>S120C</td></tr><tr><td></td><td>Suportes de Poste de 12,7 mm, Parafuso de Aperto Hexagonal com Mola, L=50 mm, Pacote com 5</td><td>Thorlabs</td> Suporte de poste <td>PH50/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>com parafuso de aperto manual com mola de travamento hexagonal, L=20 mm</td><td>Thorlabs</td><td>PH20/M</td></tr><tr><td></td><td>12,7 mm x 50 mm Poste óptico de aço inoxidável, pino M4, furo roscado M6, pacote de 5</td><td>Thorlabs</td><td>TR50/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>Poste óptico de aço inoxidável de 12,7 mm x 75 mm, pino M4, furo roscado M6 , pacote de 5</td><td>Thorlabs</td><td>TR75/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>Interface do medidor de energia e potência USB</td><td>Thorlabs</td><td>PM100USB</td></tr><tr><td></td><td>Poste óptico de aço inoxidável de 12,7 mm x 30 mm, pino M4, Thorlabs de furo roscado M6</td><td></td><td>TR30/M</td></tr><tr><td></td><td>Poste óptico de aço inoxidável de 12,7 mm x 20 mm, pino M4, Thorlabs de furo roscado</td><td></td><td>M6 TR20/M</td></tr><tr><td></td><td>trilho estrutural de 750 mm de comprimento (caixa de detecção)</td><td>Thorlabs</td><td>XE25L750/M</td></tr><tr><td></td><td>Trilho estrutural de 350 mm de comprimento (caixa de detecção)</td><td>Thorlabs</td><td>XE25L350/M</td></tr><tr><td></td><td>Quick Corner Cube para trilhos de 25 mm</td><td>Thorlabs</td><td>XE25W3</td></tr><tr><td></td><td>Suporte de ângulo reto para trilhos de 25 mm</td><td>Thorlabs</td><td>XE25A90</td></tr><tr><td></td><td>Cartolina preta 20" x 30" (508 mm x 762 mm), 1/16" (1,6 mm) de espessura, 5 folhas</td><td>Dobradiça Thorlabs</td><td>TB5</td></tr><tr><td></td><td>para gabinetes de</td> <td>trilho de 25 mmThorlabs</td><td>XE25H</td></tr><tr><td></td><td>Batente de Tampa para Caixas de Trilho de 25 mm</td><td>Thorlabs</td><td>XE25LS</td></tr><tr><td></td><td>M4 Kit de Parafusos de Cabeça</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT1/M</td></tr><tr><td></td><td>M6 e Kit de Hardware</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT2/M</td></tr><tr><td></td><td>Grampo de Mesa, Forma de L, Pacote com 5</td><td>Thorlabs</td><td>CL5-P5</td></tr><tr><td></td><td>SM1 Diafragma de Íris Acionado por Anel (&Oslash; 0,8 - &Oslash; 12 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td></tr><tr><td></td><td>&Oslash; Disco de Alinhamento de Vidro Fosco Montado em SM1 de 1" com Oslash; </td> Tampo de mesa óptico <td>de favo de mel Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1-MD de furo</td>de 1 mm</tr><tr><td>, Standa</td><td>Standa</td><td>1HB10-15-12</td>Suporte de mesa óptica, Standa Standa 1TS05-12-06-AR Amostra nano-posicionando Precisão XYZ Nanopositioning Physik Instrumente PI P527-3.CD<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Piezo Co Multicanal Digital, 3 Canais, -30 a 130 V Conector(es) Sub-D, Sensores Capacitivos,</td> <td>Physik Instrumente</td><td>PI E727-3.CD</td></tr><tr><td>Câmara de Temperatura</td><td>Zeiss 200M Sistema de Incubadora de Microscópio Invertido MATT BLK</td><td>Digital Pixel</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dual Channel Microprocessador Controlador de Temperatura</td><td>Digital Pixel</td><td>DP_MTC_2000_DUO</td></tr><tr><td></td><td>Dois Módulos de Aquecedor Livre de Vibração</td><td>Sensor de Temperatura Digital Pixel</td><td>DP_150_VF</td></tr><tr><td></td><td>PT100</td><td>Digital Pixel</td><td>DP_P100_TS</td></tr><tr><td>Reagentes e Materiais Biológicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células de cultura e transfecção de células</td><td>Cos7</td><td>ATCC&reg;</td><td>CRL-1651&trade;</td></tr><tr><td></td><td>Câmaras Lab-Tek de 8 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411PK</td></tr><tr><td></td><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td></tr><tr><td></td><td>Soro bovino fetal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td></tr><tr><td></td><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td></tr><tr><td></td><td>Tampão PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td></tr><tr><td></td><td>PenStrep</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td></tr><tr><td></td><td>Reagente de Transfecção PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td></tr><tr><td>Medição do teor de colesterol</td><td>Kit de ensaio de colesterol Amplex Red</td><td>Coquetel Thermo Fisher Scientific</td><td>A12216</td></tr><tr><td></td><td>Inibidor de protease</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87786</td></tr><tr><td></td><td>Inibidor de fosfatase Coquetel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78420</td></tr><tr><td></td><td>ROTI Nanoquant Solução de Trabalho</td><td>Roth</td><td>K880</td></tr><tr><td></td><td>GloMax Discover Microplate Reader</td><td>Promega</td><td>GM3000</td></tr><tr><td>svFCS medições</td><td>HBSS buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td></tr><tr><td></td><td>Hepes buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td></tr><tr><td></td><td>Colesterol oxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8868</td></tr><tr><td></td><td>Rodamina 6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83697-1G</td></tr></tbody></table>

espectroscopia de correlação de fluorescência de variação spot para análise de difusão molecular na membrana plasmática de células vivas

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Processos biológicos dinâmicos em células vivas, incluindo aqueles associados à organização da membrana plasmática, ocorrem em várias escalas espaciais e temporais, variando de nanômetros a micrômetros e microssegundos a minutos, respectivamente. Uma gama tão ampla de processos biológicos desafia abordagens convencionais de microscopia. Aqui, detalhamos o procedimento para implementar as medidas de espectroscopia de correlação de fluorescência de variação spot (svFCS) usando um microscópio clássico de fluorescência que foi personalizado. O protocolo inclui uma verificação de desempenho específica da configuração svFCS e as diretrizes para medições de difusão molecular por svFCS na membrana plasmática das células vivas em condições fisiológicas. Além disso, fornecemos um procedimento para interromper nanodomínios de balsa de membrana plasmática por tratamento oxidase de colesterol e demonstramos como essas mudanças na organização lateral da membrana plasmática podem ser reveladas pela análise svFCS. Em conclusão, este método baseado em fluorescência pode fornecer detalhes sem precedentes sobre a organização lateral da membrana plasmática com a resolução espacial e temporal apropriada.

Geramos um DL para Thy1-GFP expresso em células Cos-7 (Figura 4, quadrados pretos). A lei de difusão tem um valor t0 positivo (19,47 ms ± 2 ms), indicando que o Thy1-GFP está confinado em estruturas de nanodomína da membrana plasmática. O tratamento oxidase de colesterol das células expressando Thy1-GFP resultou na mudança do valor DL t0 para 7,36 ± 1,34 ms (Figura 4, quadrados cinza). Esta observação confirma que a natureza do confinamento Thy1-GFP depende do teor de colesterol e está associada a nanodomínios de jangada lipídica. Essas duas leis de difusão mostram-se diferentes de acordo com o teste estatístico descrito acima (ver etapa 9.1.3) em termos de valores t0 e Deff . Além disso, avaliamos a concentração de colesterol celular total em células Cos-7 não tratadas versus as células tratadas com COase. Uma pequena, mas significativa, diminuição do teor total de colesterol é observada no tratamento de COase (Figura 5). Como esta enzima age apenas na piscina de colesterol acessível no folheto externo da membrana plasmática, assumimos que a diminuição observada no colesterol está associada apenas à membrana plasmática e resulta na desestabilização dos nanodomínios lipídes de jangada.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig01.jpg"> Figura 1: Leis simuladas de espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) estabelecidas por FCS de variação spot para diferentes formas de organização da membrana. (Painéis superiores) Representação esquemática da organização da membrana — (A) livre difusão, (B) barreiras de malha e (C) confinamentos de trap/domínio — com a trajetória desenhada para uma única molécula (vermelho). Círculos azuis denotam a intersecção da membrana e do raio laser da cintura ω. (Painéis inferiores) As leis de difusão fcs representadas pelo plotagem do tempo de difusão td em função do raio quadrado ω2. A projeção da lei de difusão (linha de traço verde) intercepta o eixo temporal em (A) a origem (t0 = 0) no caso de difusão livre; (B) em eixo negativo (t0 &lt; 0) quando houver barreiras de malha, ou (C) em eixo positivo (t0 &gt; 0) quando há armadilhas e domínios (jangadas lipídicas). D é o coeficiente de difusão lateral para o movimento browniano; Deff, o coeficiente de difusão eficaz; Dmicro, o coeficiente de difusão microscópica dentro das armadilhas de malha; Din, o coeficiente de difusão dentro dos domínios; Dfora, o coeficiente de difusão fora dos domínios; L, o tamanho do lado de um domínio quadrado; e rD, o raio de um domínio circular. Este valor foi modificado de Ele e Marguet6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2.jpg"> Figura 2: Visão esquemática do controle de hardware svFCS. O computador controla todos os dispositivos através de diferentes protocolos de comunicação: serial (microscópio, obturador externo), USB (estágio piezoelétrico XYZ, correlator) e PCI (placa de aquisição). DAQ: data acquisition board, APD: avalanche photodiode, SPCM: módulo de contagem de fótons únicos, DO: saída digital. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig03.jpg"> Figura 3: Visão esquemática dos caminhos ópticos de excitação e emissão da configuração svFCS. A configuração svFCS contém quatro módulos: (1) a saída de um laser de fibra de 488 nm é colidida, (2) uma combinação de uma placa de meia onda e divisor de feixe polarizador define a potência óptica, (3) o raio laser focado na amostra depois de viajar através de um microscópio motorizado livre de lentes de tubo, e (4) a fluorescência é detectada através de um caminho de detecção semelhante ao semelhante a um fódio de avalanche acoplado a um único módulo de contagem de fótons, que fornece um sinal para um correlator de hardware. A simplicidade dá ao sistema sua sensibilidade, robustez e facilidade de uso (amplamente comentada em material suplementar). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig04.jpg"> Figura 4: As leis de difusão svFCS geradas a partir da análise de difusão do Thy1-GFP expressas no Cos-7. svFCS leis de difusão de células Cos-7 sem tratamento (NT, quadrados pretos) e após tratamento oxidase de colesterol (COase, círculos cinzentos). A inserção no gráfico representa testes estatísticos de diferença significativa entre as duas leis de difusão svFCS apresentadas (segundo Mailfert et al.28). O valor do teste (T) deve estar acima do limite fixado em 3,8 quando ambas as leis de difusão forem diferentes. Quanto maior for, maior é a diferença entre as leis de difusão. O valor de T é codificado por cores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig05.jpg"> Figura 5: Comparação do teor total de colesterol nas células Cos-7. As células Cos-7 foram não tratadas (NT) ou tratadas com 1 U/mL de colesterol oxidase (COase) por 1 h. Os dados representam um exemplo de um experimento em triplicado. Utilizou-se um teste t de duas caudas e não remunerados para avaliar a diferença estatística (α=0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela de materiais: A lista de elementos ópticos necessários para a configuração svFCS.
Material suplementar: Este documento descreve a construção de uma configuração svFCS do zero. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823_R1_Supp%20Mat_final.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Este artigo tem como objetivo apresentar um protocolo sobre como construir um microscópio de espectroscopia de correlação de fluorescência (svFCS) para medir a difusão molecular na membrana plasmática das células vivas.

Espectroscopia de correlação de fluorescência de variação spot para análise de difusão molecular na membrana plasmática de células vivas

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

A visão atual da organização lateral da membrana plasmática permanece incompleta. Por esse motivo, é importante implementar algumas novas técnicas inovadoras, como a Espectroscopia de Correlação de Fluorescência de variação pontual. Esta é uma técnica muito poderosa caracterizada por excelente resolução de tempo e espaço.Além disso, não é invasivo e permite estudar as membranas celulares em condições fisiológicas. Todos os dias, antes de executar um experimento, abra todos os diafragmas da íris e use um medidor de potência para medir a potência do laser com a primeira íris totalmente aberta. Gire a placa intermediária para localizar a potência máxima.Se a potência do laser for menor do que o normal, use as íris para verificar o alinhamento e mova alternadamente L1 e M1 conforme necessário. Em seguida, anote o valor de potência em um caderno de laboratório. Para verificar o caminho de detecção, coloque água, uma lamínula e uma gota de solução de rodamina 6G nanomolar na objetiva.Em seguida, inicie o software do correlador e registre os dados. A função de autocorrelação deve exibir uma baixa quantidade de ruído, um pequeno tamanho de desperdício e uma alta taxa de contagem por molécula por segundo. Para calibrar o tamanho do ponto, coloque uma lamínula codificada para cultura de células na objetiva de imersão em água e adicione 200 microlitros de solução de rodamina 6G nanomolar à lamínula.Ajuste a potência do feixe de laser de 488 nanômetros para 300 microwatts e, no software, selecione a porta do microscópio de detecção de iluminação svFCS. Ligue o APD e abra a íris até que um sinal caia para obter o tamanho mínimo de desperdício ou feche-o para um tamanho de desperdício maior. Registre cerca de 10 funções de correlação automática de 20 segundos para melhorar a reprodutibilidade estatística e desligar o APD.Em um programa de análise de dados apropriado, verifique e descarte os ensaios com fortes flutuações devido a agregados moleculares, depois ajuste a média da função de autocorrelação retida com um modelo de difusão 3D, extraia o tempo médio de difusão dos parâmetros de ajuste e salve os dados como um arquivo TXT. Para análise svFCS, ajuste o feixe de 488 nanômetros alimentado entre dois a quatro microwatts e equilibre as amostras por 10 minutos a 37 graus Celsius. Selecione a porta do microscópio de detecção de iluminação svFCS e no APD.Em seguida, execute uma varredura XY e uma varredura Z da célula selecionada. Selecione a membrana plasmática na parte superior da célula para localizar o ponto confocal na intensidade máxima de fluorescência e iniciar a aquisição de dados. No software correlador, registre uma série de 20 execuções de cinco segundos.Após a última execução, desligue o APD e descarte todas as execuções inesperadas, conforme demonstrado. Ajuste a função de correlação automática média com um modelo de difusão 2D de duas espécies e salve os parâmetros de ajuste no arquivo TXT salvo anteriormente. Quando todas as células de interesse tiverem sido registradas, analise pelo menos quatro tamanhos de resíduos variando entre 200 a 400 nanômetros para estabelecer uma única lei de difusão.Em seguida, no MATLAB, selecione uma pasta contendo todos os arquivos TXT correspondentes a pelo menos quatro experimentos de tamanho de resíduos e plote o tempo de difusão versus o desperdício quadrado. Nesta figura, pode-se observar uma lei de difusão para Thy1-GFP expressa em células Cos7. A lei de difusão tem um valor positivo de tempo zero, indicando que o Thy1-GFP está confinado dentro de estruturas de nanodomínio da membrana plasmática.Nesta análise, o tratamento com colesterol oxidase das células que expressam Thy1-GFP resultou na mudança do valor zero do tempo da lei de difusão para 7,36 mais ou menos 1,34 milissegundos. Confirmando que a natureza do confinamento Thy1-GFP depende do teor de colesterol e está associada a nanodomínios de jangada lipídica. Uma diminuição pequena, mas significativa, no conteúdo de colesterol total também foi observada após o tratamento com colesterol oxidase.Como essa enzima atua apenas no pool de colesterol acessível no folheto externo da membrana plasmática, esses dados sugerem que a diminuição observada no colesterol está associada apenas à membrana plasmática e causa desestabilização dos nanodomínios da jangada lipídica. A coisa mais importante ao tentar este procedimento é a calibração adequada do sistema svFCS e a preparação das células para a análise. O svFCS é uma excelente ferramenta para estudar a organização da membrana celular.No entanto, também pode ser usado para analisar a difusão de moléculas intracelulares. Esta técnica pode ser implementada com sucesso na biomedicina para determinar a influência dos potenciais fármacos nas células vivas, como as células cancerígenas.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Aprenda a usar a espectroscopia de correlação de fluorescência de variação spot (svFCS) para analisar a difusão molecular na membrana plasmática de células vivas. Esta técnica não invasiva oferece excelente resolução temporal e espacial para estudar a organização da membrana celular.

Espectroscopia de correlação de fluorescência de variação spot para análise de difusão molecular na membrana plasmática de células vivas (Vídeo) | JoVE Journal

Espectroscopia de correlação de fluorescência de variação spot para análise de difusão molecular na membrana plasmática de células vivas

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