Espectroscopia de correlação de fluorescência de variação spot para análise de difusão molecular na membrana plasmática de células vivas

A visão atual da organização lateral da membrana plasmática permanece incompleta. Por esse motivo, é importante implementar algumas novas técnicas inovadoras, como a Espectroscopia de Correlação de Fluorescência de variação pontual. Esta é uma técnica muito poderosa caracterizada por excelente resolução de tempo e espaço.

Além disso, não é invasivo e permite estudar as membranas celulares em condições fisiológicas. Todos os dias, antes de executar um experimento, abra todos os diafragmas da íris e use um medidor de potência para medir a potência do laser com a primeira íris totalmente aberta. Gire a placa intermediária para localizar a potência máxima.

Se a potência do laser for menor do que o normal, use as íris para verificar o alinhamento e mova alternadamente L1 e M1 conforme necessário. Em seguida, anote o valor de potência em um caderno de laboratório. Para verificar o caminho de detecção, coloque água, uma lamínula e uma gota de solução de rodamina 6G nanomolar na objetiva.

Em seguida, inicie o software do correlador e registre os dados. A função de autocorrelação deve exibir uma baixa quantidade de ruído, um pequeno tamanho de desperdício e uma alta taxa de contagem por molécula por segundo. Para calibrar o tamanho do ponto, coloque uma lamínula codificada para cultura de células na objetiva de imersão em água e adicione 200 microlitros de solução de rodamina 6G nanomolar à lamínula.

Ajuste a potência do feixe de laser de 488 nanômetros para 300 microwatts e, no software, selecione a porta do microscópio de detecção de iluminação svFCS. Ligue o APD e abra a íris até que um sinal caia para obter o tamanho mínimo de desperdício ou feche-o para um tamanho de desperdício maior. Registre cerca de 10 funções de correlação automática de 20 segundos para melhorar a reprodutibilidade estatística e desligar o APD.

Em um programa de análise de dados apropriado, verifique e descarte os ensaios com fortes flutuações devido a agregados moleculares, depois ajuste a média da função de autocorrelação retida com um modelo de difusão 3D, extraia o tempo médio de difusão dos parâmetros de ajuste e salve os dados como um arquivo TXT. Para análise svFCS, ajuste o feixe de 488 nanômetros alimentado entre dois a quatro microwatts e equilibre as amostras por 10 minutos a 37 graus Celsius. Selecione a porta do microscópio de detecção de iluminação svFCS e no APD.

Em seguida, execute uma varredura XY e uma varredura Z da célula selecionada. Selecione a membrana plasmática na parte superior da célula para localizar o ponto confocal na intensidade máxima de fluorescência e iniciar a aquisição de dados. No software correlador, registre uma série de 20 execuções de cinco segundos.

Após a última execução, desligue o APD e descarte todas as execuções inesperadas, conforme demonstrado. Ajuste a função de correlação automática média com um modelo de difusão 2D de duas espécies e salve os parâmetros de ajuste no arquivo TXT salvo anteriormente. Quando todas as células de interesse tiverem sido registradas, analise pelo menos quatro tamanhos de resíduos variando entre 200 a 400 nanômetros para estabelecer uma única lei de difusão.

Em seguida, no MATLAB, selecione uma pasta contendo todos os arquivos TXT correspondentes a pelo menos quatro experimentos de tamanho de resíduos e plote o tempo de difusão versus o desperdício quadrado. Nesta figura, pode-se observar uma lei de difusão para Thy1-GFP expressa em células Cos7. A lei de difusão tem um valor positivo de tempo zero, indicando que o Thy1-GFP está confinado dentro de estruturas de nanodomínio da membrana plasmática.

Nesta análise, o tratamento com colesterol oxidase das células que expressam Thy1-GFP resultou na mudança do valor zero do tempo da lei de difusão para 7,36 mais ou menos 1,34 milissegundos. Confirmando que a natureza do confinamento Thy1-GFP depende do teor de colesterol e está associada a nanodomínios de jangada lipídica. Uma diminuição pequena, mas significativa, no conteúdo de colesterol total também foi observada após o tratamento com colesterol oxidase.

Como essa enzima atua apenas no pool de colesterol acessível no folheto externo da membrana plasmática, esses dados sugerem que a diminuição observada no colesterol está associada apenas à membrana plasmática e causa desestabilização dos nanodomínios da jangada lipídica. A coisa mais importante ao tentar este procedimento é a calibração adequada do sistema svFCS e a preparação das células para a análise. O svFCS é uma excelente ferramenta para estudar a organização da membrana celular.

No entanto, também pode ser usado para analisar a difusão de moléculas intracelulares. Esta técnica pode ser implementada com sucesso na biomedicina para determinar a influência dos potenciais fármacos nas células vivas, como as células cancerígenas.