Um Bioreator multi-cue para avaliar a capacidade inflamatória e regenerativa de biomateriais sob fluxo e estiramento

Até agora, tem sido muito difícil identificar as relações de causa e efeito entre hemodinâmica e regeneração do tecido vascular. E isso porque é um desafio controlar as cargas mecânicas individuais. Este biorreator nos permite investigar mecanicamente os efeitos individuais e combinados do estresse puro e do estiramento cíclico no potencial regenerativo de uma ampla variedade de enxertos vasculares de engenharia de tecidos.

Demonstrando este procedimento estará Suzanne Koch, doutoranda em nosso grupo. E a Dra. Tamar Wissing, que é pesquisadora de pós-doutorado do nosso laboratório. Para montar o andaime eletrofiado no tubo de silicone, rosqueie uma sutura de prolene 4-0 em uma extremidade de um pedaço de tubo de silicone e na outra.

Faça um pequeno nó em ambos os lados do tubo, deixando aproximadamente 10 centímetros de fio em ambos os nós, e faça um terceiro nó em cima dos dois. Depois de remover uma agulha de sutura, apare as bordas do tubo de silicone em uma forma triangular e faça um nó final na extremidade dos dois fios de 10 centímetros. Mergulhe o andaime eletrofiado em 30% de etanol e coloque o andaime sobre uma extremidade do fio de sutura livre.

Em seguida, estique suavemente os dois lados do tubo de silicone e o nó de sutura de 10 centímetros, enquanto o segundo pesquisador usa uma pinça com uma ponta interna lisa para deslizar suavemente o andaime eletrofiado sobre o tubo. Solte lentamente o estiramento no tubo de silicone enquanto alisa simultaneamente o andaime eletrofiado com a pinça. E mergulhe o andaime e o tubo de silicone em água ultrapura duas vezes.

Construa o compartimento inferior e certifique-se de que o O-ring esteja colocado corretamente. Coloque uma bucha adaptadora na parte superior do compartimento inferior e coloque o conduíte de pressão com orifícios no compartimento inferior. Amarre o anel de vedação de silicone ao redor da extremidade inferior do conduíte de pressão para evitar vazamentos.

E aparafuse a parte inferior do compartimento inferior na parte superior do compartimento inferior para prender o conduíte de pressão. Certifique-se de que a ranhura inferior gravada do conduíte de pressão esteja aproximadamente três a cinco milímetros acima da borda da bucha do adaptador do compartimento inferior. Puxe o tubo de silicone com o andaime eletrofiado sobre o conduíte de pressão e faça um aceno de cabeça e o fio de sutura na extremidade inferior do andaime eletrofiado, no local da ranhura gravada no conduíte de pressão.

Faça um segundo aceno de cabeça no lado oposto para prender firmemente o tubo de silicone com o enxerto eletrofiado. E colocando uma braçadeira de tesoura equipada com uma régua na extremidade superior do tubo de silicone, puxe a braçadeira de tesoura para cima de maneira consistente e puxe suavemente o andaime de desova elétrica para remover quaisquer rugas. Use um fio de sutura para fazer dois nós em ambas as extremidades do andaime na ranhura superior gravada do conduíte de pressão.

Quando os dois nós tiverem sido feitos, solte a pinça da tesoura e use uma faca para remover qualquer excesso de tubo de silicone. Aparafuse os cones do nariz na rosca dos conduítes de pressão para as amostras que serão carregadas dinamicamente. Mergulhe o conduíte de pressão, a tubulação e o andaime uma vez em etanol a 30% e duas vezes em água ultrapura para pré-umedecer a configuração.

Coloque o tubo de vidro sobre o conduíte de pressão e empurre suavemente o compartimento inferior para prender o tubo de vidro no lugar. Em seguida, coloque o alisador de fluxo, um O-ring de silicone e a bucha do adaptador no compartimento superior. E prenda o compartimento sobre a extremidade aberta do tubo de vidro.

Remova o plugue de isca macho da saída de fluxo, trabalhe em um gabinete de fluxo laminar estéril. Abra a tampa branca da isca e coloque um lenço de imersão em etanol na frente da saída de fluxo. Desconstrua a câmara de cultura de fluxo retirando o tubo de vidro com o compartimento superior.

Coloque um tubo de pastagem a vácuo no andaime eletrofiado para remover o máximo de meio possível. E adicione a solução de fibrinogênio na proporção de um para um com a suspensão de células suplementadas com trombina. Pipete a solução para cima e para baixo uma vez e pingue imediatamente a solução em todo o comprimento do andaime.

Quando todas as células tiverem sido entregues, mova lentamente o andaime da esquerda para a direita e para cima e para baixo para obter uma distribuição uniforme das células. Quando ambos os lados do andaime tiverem sido semeados, reconstrua cuidadosamente a câmara de cultura de fluxo colocando o tubo de vidro e o compartimento superior de volta. E coloque a câmara de cultura de fluxo na incubadora para permitir que a fibra se solidifique.

Para acoplar o biorreator ao sistema de bomba, coloque a câmara de cultura de fluxo em uma das oito roscas de parafuso na base do biorreator. E coloque um clipe hospedeiro no tubo médio. Remova a tampa de isca branca, cobrindo a entrada de fluxo do compartimento superior da câmara de cultura de fluxo e remova o acoplador de isca fêmea do tubo médio.

Conecte o tubo médio com um lado da entrada de fluxo no compartimento superior. E o outro lado com a saída de fluxo no compartimento inferior. Transfira a configuração completa do gabinete de fluxo laminar para a incubadora.

E conecte uma unidade fluídica e a base do biorreator à tubulação de pressão de ar e ao cabo elétrico. Inicie o software e inicialize as bombas. Inicie o fluxo médio para as amostras uma a uma.

Em seguida, altere os parâmetros da bomba de tensão para as configurações desejadas e inicie a tensão. Monitore o alongamento aplicado ao andaime em dias alternados. O monitoramento da tensão de estiramento e cisalhamento da parede durante os períodos de cultura de longo prazo mostra que esses valores podem ser mantidos em níveis relativamente constantes durante um período de até 20 dias.

Após três dias de carga hemodinâmica, a coloração imunofluorescente revela uma distribuição homogênea de macrófagos derivados de monócitos e miofibroblastos em todo o scaffold. Após 20 dias de co-cultivo, o estiramento cíclico resulta na deposição de fibras de colágeno tipo 1 mais numerosas e espessas. Enquanto no grupo de carga hemodinâmica combinada, o efeito de estiramento cíclico é anulado pelo estresse absoluto, resultando em uma deposição menos pronunciada de colágeno tipo 1.

Após oito dias de monocultura de macrófagos, a erosão e a clivagem das fibras são observadas em todos os regimes de carga hemodinâmica, com a reabsorção mais pronunciada observada no grupo estático e a reabsorção menos pronunciada observada no grupo de estresse absoluto. Tanto o alongamento cíclico quanto o estresse absoluto afetam o perfil de secreção de citocinas da configuração de co-cultura. Curiosamente, os efeitos combinados de ambas as cargas mostram a dominância de uma das duas cargas ou efeitos sinérgicos de ambas as cargas.

Experimentos de co-cultura também mostram que o ambiente mecânico e os ambientes inflamatórios dependentes da carga resultante modulam o fenótipo dos miofibroblastos. Além disso, os padrões de expressão gênica do marcador contrátil alfa actina do músculo liso se correlacionam com a síntese de proteínas. O mais importante ao realizar este protocolo é que é isso que a aplicação do alongamento, é essencial que sua configuração esteja livre de vazamentos.