Purificação de Tubulin com Modificações Pós-Translacionais Controladas e Isótipos de Fontes Limitadas por Ciclos de Polimerização-Despolimerização

Este método permite gerar tubulina pura competente para montagem com modificações pós-traducionais definidas em quantidades suficientes para realizar conjuntos inteiros de experimentos in vitro. Este protocolo baseado em ciclos de polimerização e despolimerização de tubulina é fácil de realizar em qualquer laboratório de biologia celular. Permite gerar boas quantidades de tubulina com muito pouco tempo de prática.

Para purificar a tubulina de culturas em suspensão, nove dias antes da preparação da tubulina, reviva e amplifique o tipo de célula desejado para obter seis placas confluentes de 15 centímetros. Oito dias antes da preparação da tubulina, adicione um litro de meio pré-aquecido a cada frasco giratório por prato sob um armário de cultura de células e coloque os spinners em uma mesa de agitação dentro da incubadora de cultura de células. Deixe as tampas giratórias laterais ligeiramente abertas para permitir que o meio se equilibre com a atmosfera da incubadora.

No dia seguinte, use as células dos pratos confluentes para inocular os frascos giratórios. Retorne os frascos giratórios para a incubadora por uma semana com as válvulas laterais ligeiramente abertas. Para colher as células, transfira as culturas dos frascos giratórios para frascos de centrífuga de um litro e colete as células por centrifugação.

Ressuspenda cada pellet em 10 mililitros de PBS gelado e agrupe as células ressuspensas em um tubo de 50 mililitros para centrifugação a quatro graus Celsius. Para um pellet de célula de 10 mililitros, adicione 10 mililitros de tampão de lise ao pellet e inverta o tubo várias vezes para ressuspender as células. Para purificar a tubulina de culturas de células aderentes, reviva e amplifique o tipo de célula desejado para obter 10 placas confluentes de 15 centímetros no dia da preparação da tubulina.

Para colher as células aderentes, tratando três placas de cada vez, incline as placas de cultura para remover o meio enquanto uma segunda pessoa lava suavemente as células com sete mililitros de PBS-EDTA. Após a lavagem, a segunda pessoa deve tratar as células com cinco mililitros de PBS-EDTA por prato antes de fazer com que uma terceira pessoa use um elevador de células para empurrar suavemente as células para uma borda do prato. Quando as células tiverem sido separadas, agrupe as células de todos os três pratos em um tubo de 50 mililitros no gelo e enxágue cada prato com mais dois mililitros de PBS-EDTA para coletar as células restantes.

Depois de recolher as células por centrifugação, rejeitar o sobrenadante para determinar o volume do sedimento celular. Adicione o tampão de lise, ressuspenda as células e transfira-as para um tubo inferior redondo de 14 mililitros. Sonicar as células por aproximadamente 45 pulsos.

Para lise cerebral de camundongo, adicione 500 microlitros de tampão licenciado a um único cérebro colhido de um camundongo adulto e use um liquidificador de tecido para lisar o tecido. Depois de obter o lisado a 1/100 de seu volume para um volume igual de 2X Tampão Laemmli e ferva a solução por cinco minutos. Armazene-o a menos 20 graus Celsius até a quantificação.

Colete uma amostra desta forma em cada etapa da preparação da tubulina. Para clarificar o lisado, centrifugar a amostra e transferir cuidadosamente o sobrenadante límpido para um novo tubo, com o cuidado de evitar a camada superior flutuante. Após a clarificação do lisado, é essencial remover o material flutuante no sobrenadante, caso contrário, pode afetar negativamente a eficiência da purificação da tubulina.

Para polimerizar a tubulina a partir do lisado clarificado, misture todo o volume do sobrenadante com um volume de 1/200 de GTP 0,2 molar e meio volume de glicerol quente em um tubo de tamanho apropriado. Pipete suavemente a mistura, tome cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar. Sele os tubos com parafilme e coloque-os em banho-maria a 30 graus Celsius por 20 minutos.

Após centrifugação, transferir o sobrenadante para um novo tubo. Para despolimerizar os microtúbulos presentes no pellet dois, ressuspenda o pellet em BRB 80 gelado por cinco minutos no gelo. Pipetar a amostra primeiro com uma pipeta P1000 e, em seguida, com uma pipeta P200, de cinco em cinco minutos durante 20 minutos no gelo.

Quando a amostra estiver homogénea, centrifugá-la e transferir o sobrenadante obtido para um novo tubo. Para remover as proteínas associadas aos microtúbulos da tubulina, misture todo o volume do sobrenadante três com um volume igual de tubo molar pré-aquecido S, o mesmo volume de glicerol pré-aquecido e um volume de 1/100 de 0,2 molar GTP. Incube a mistura por 20 minutos a 30 graus Celsius antes de centrifugar.

Transfira o sobrenadante quatro contendo proteína associada aos microtúbulos para um novo tubo, o pellet contém microtúbulos polimerizados. Depois de realizar uma terceira polimerização e despolimerização, a quantidade de tubulina colhida pode ser quantificada pela análise de página SDS. O sucesso do processo de purificação pode ser confirmado em uma página de SDS manchada de Coomassie.

Um rendimento menor do que o esperado da tubulina purificada pode ser devido a uma polimerização ineficiente da tubulina, conforme evidenciado pela menor quantidade de tubulina na segunda, quarta e sexta frações do pellet e maior quantidade na segunda, quarta e sexta frações sobrenadantes. Para quantificar a tubulina purificada, as amostras podem ser executadas ao lado de quantidades conhecidas de albumina de soro bovino. A densitometria quantitativa das bandas de proteínas permite calcular a quantidade de tubulina purificada.

O status de modificação da tubulina pode ser confirmado pela análise de immunoblot das amostras. Nosso protocolo permite o isolamento da tubulina com modificações pós-traducionais controladas. Com esta tubulina, podemos estabelecer experimentos de reconstituição in vitro que nos permitem determinar o impacto das modificações da tubulina nas propriedades microtubárias, bem como em suas interações com proteínas associadas aos microtúbulos.