Alimentação e quantificação de sangue derivados de animais e refeições artificiais em mosquitos Aedes aegypti

Essa técnica permite que os pesquisadores alimentem e realizem sozinhos medições de alto rendimento para comparar os volumes de refeição consumidos por centenas de mosquitos individuais. Pode ser adaptativo para alterar o conteúdo da refeição ou comparar o volume consumido por diferentes grupos experimentais. Este protocolo visa ser fácil de usar e de baixo custo.

Para manipulações farmacológicas e genéticas, para estudar a alimentação sanguínea do mosquito e o comportamento alimentar pós-inundação. A organização é fundamental para este protocolo. Prepare a configuração e os reagentes com antecedência, para que você possa entregar rapidamente as refeições aos mosquitos.

Para começar, transfira de 1,98 a dois mililitros de sangue de ovelha desfibrinado para um tubo cônico de 15 mililitros. Se realizar a quantificação baseada em fluorescência do tamanho da refeição, adicione a solução de fluoresceína a uma concentração final de 0,002%, reduzindo o volume de sangue na mesma quantidade que a fluoresceína adicionada. Reter um mililitro da formulação final da refeição para gerar a curva padrão de referência.

Todas as refeições e soluções contendo fluoresceína devem ser embrulhadas em papel alumínio ou mantidas no escuro. Para preparar refeições salinas sem proteínas, combine 600 microlitros de bicarbonato de sódio 400 milimolares com 1,39 mililitros de água bidestilada em um tubo cônico de 15 mililitros. Se a quantificação baseada em fluorescência do tamanho da refeição for realizada posteriormente, adicione a solução de fluoresceína a uma concentração final de 0,002% Reduzindo o volume de água na mesma quantidade que a fluoresceína adicionada.

Reter pelo menos um mililitro da formulação final da refeição contendo 0,002% de fluoresceína para gerar a curva padrão de referência. Separe as refeições preparadas até que esteja pronto para entregá-las. Todas as refeições e soluções contendo fluoresceína devem ser embrulhadas em papel alumínio ou mantidas no escuro.

Coloque o grupo experimental de mosquitos fêmeas em um recipiente e cubra-os com tela. Permita que essas fêmeas se aclimatem na câmara de alimentação. Separe um grupo de controle de mosquitos não alimentados que não receberão uma refeição.

Para construir um tubo GLI, encha um tubo cônico de 50 mililitros com 40 mililitros de glicerol a 100%. Sele o tubo cônico aberto com dois pedaços de parafilme para minimizar a chance de vazamento. Opcionalmente, segure o parafilme no lugar usando elásticos.

Inverta o tubo para garantir que não haja furos ou lacunas. Para criar o dispositivo de entrega de refeições, faça um orifício centralizado de 2,5 centímetros na tampa de rosca do tubo cônico usando uma lâmina de barbear afiada ou uma lava. Estique, um pedaço de parafilme uniformemente para que ele dobre de tamanho.

O parafilme deve ser fino o suficiente para que os mosquitos possam perfurá-lo facilmente, mas não deve haver vazamentos. Sele a superfície externa da tampa de rosca com o parafilme para cobrir totalmente o orifício e coloque a tampa de lado. Aqueça o tubo selado de glicerol e as refeições de sangue e solução salina e um banho-maria de 42 a 45 graus Celsius por pelo menos 15 minutos.

Adicione ATP à refeição aquecida e vortex completamente. Pipete dois mililitros da refeição aquecida na câmara interna da tampa de rosca e coloque suavemente o tubo cônico cheio de glicerol aquecido invertido sobre ela. Parcialmente, enrosque a tampa com a refeição no tubo cheio de glicerol, apenas o suficiente para evitar o vazamento da refeição ou do glicerol.

Coloque o tubo grelhado montado em cima do recipiente para mosquitos, aplique dióxido de carbono e permita que os mosquitos acessem a alimentação por pelo menos 15 minutos para atingir as taxas máximas de alimentação. Após a alimentação, a tampa do tubo GLI pode ser descartada como resíduo de risco biológico ou reutilizada após imersão em uma solução de alvejante de baixa porcentagem e enxágue abundante em água. Para gerar uma curva padrão de referência, preparar uma diluição seriada da mesma refeição contendo 0,002% de fluoresceína que foi oferecida ao grupo experimental de mosquitos.

Para fazer a primeira solução da curva padrão, adicione 50 microlitros de farinha contendo 0,002% de fluoresceína a 950 microlitros de PBS e vortex completamente. Efectuar diluições duplas para o resto das soluções da curva-padrão, fazendo um vórtice bem antes de cada diluição. Pipete 100 microlitros de cada uma das soluções de curva padrão em cada um dos oito poços na primeira coluna de uma placa de PCR de 96 poços.

Adicione um mosquito de controle não alimentado anestesiado ou congelado a cada um dos mesmos oito poços. Repita na segunda coluna da placa para uma medição replicada. Adicione 100 microlitros de PBS a cada poço restante para os grupos controle e experimental não alimentados.

Como controle negativo, adicione um mosquito não alimentado a cada poço nas próximas duas colunas do prato. Adicione um mosquito por poço aos poços restantes dos grupos experimentais que receberam uma refeição. Adicione esferas de vidro sólido de borossilicato de três milímetros a cada poço se estiver interrompendo o tecido com o homogeneizador do moinho de contas.

Feche a placa com cuidado e rompa o tecido, depois centrifugue a placa a 2000 RPM por um a dois minutos para coletar o lisado. Prepare uma placa preta de 96 poços com 180 microlitros de PBS em cada poço. Em seguida, adicione 20 microlitros de lisado a cada poço e misture.

Meça a intensidade da fluoresceína usando um leitor de placas com os 485 canais de excitação e 520 canais de emissão. Gere a curva padrão de referência traçando o volume conhecido de farinha em relação à medição de intensidade de fluorescência correspondente. Usando a curva padrão de referência gerada, extrapolar o volume de refeição ingerido por cada um dos mosquitos do grupo experimental.

Subtraia a leitura média da intensidade de fluorescência do grupo de controle negativo não alimentado da leitura da intensidade de fluorescência de cada indivíduo do grupo experimental para corrigir a autofluorescência do tecido basal. Para medir o tamanho da refeição de fluoresceína a partir de um experimento de alimentação sanguínea, uma curva padrão foi gerada plotando leituras de fluorescência dos poços de referência designados contendo um mosquito não alimentado e um volume conhecido da refeição com 0,002% de fluoresceína. As leituras de fluorescência dos poços restantes que contêm mosquitos do grupo de controle negativo não alimentado de mosquitos ou do grupo experimental de mosquitos que receberam uma refeição são comparadas a esta curva padrão para quantificar o volume de refeição consumido.

Embora todas as fêmeas do grupo experimental tenham recebido a refeição de sangue, alguns mosquitos se alimentaram e outros não. Este protocolo pode ser usado para entregar e quantificar refeições com várias composições proteicas. Os dados coletados usando refeições com adição de flúor são mostrados aqui.

Um experimento independente em que os mosquitos foram classificados como alimentados ou não a olho nu, depois de receberem refeições sem flúor, também foi realizado. Esse protocolo foi utilizado para determinar o volume consumido de refeições com medicamentos que regulam o comportamento de busca de mosquitos hospedeiros. Nesses experimentos, as fêmeas receberam refeições salinas e ATP com um agonista humano de dois receptores NPY.

Essa técnica também foi usada para medir o comportamento alimentar do néctar, trocando o tubo gly por uma bola de algodão saturada com sacarose a 10% contendo 0,002% de fluoresceína, demonstrando que pode ser usada para medir tamanhos de refeição menores ou mais variáveis que não podem ser discernidos com precisão a partir das medições de peso do grupo. O mais importante para a realização deste protocolo, é organizar as amostras em eventos e separar os mosquitos não alimentados e um ML de cada refeição para gerar a curva padrão. Após este procedimento, o comportamento dos animais após a alimentação sanguínea pode ser observado e a digestão pode ser rastreada.

Este método permite que os pesquisadores avaliem as mudanças no consumo de refeições em mosquitos geneticamente modificados. Ele também fornece uma maneira direta, rápida e não invasiva de fornecer medicamentos aos mosquitos e testar seus efeitos no comportamento.