PCR Mutagenesis, Clonagem, Expressão, Protocolos rápidos de purificação de proteínas e Cristalização do Tipo Selvagem e Formas Mutantes de Synthase Triptofano

Este protocolo para purificar a enzima triptofano sintase de Salmonella typhimurium é rápido, simples e curto. O fracionamento de sulfato de amônia e a cromatografia de exclusão de tamanho tornam possível purificar o tipo selvagem e o complexo triptofano sintase mutante em um único dia. Esta técnica pode ser aplicada para purificar outras proteínas relacionadas, uma vez que o fracionamento de sulfato de amônia e a cromatografia de exclusão de tamanho são comumente usados para purificar proteínas não marcadas.

Para começar, interrompa o pellet celular por sonicação em banho-maria gelado a 80% de amplitude por 20 ciclos usando pulsos de 10 segundos e descansos de 20 segundos. Centrifugar o lisado celular a 30 000 vezes g durante 30 minutos a 25 graus Celsius e aspirar o sobrenadante sem desalojar o sedimento. Filtrar a fracção sobrenadante clarificada com um filtro de 0,45 micrómetros à temperatura ambiente.

Adicione lentamente pequenas quantidades de sulfato de amônio ao filtrado até atingir 20% de saturação. Realize o fracionamento de sulfato de amônio a 25 graus Celsius e mexa suavemente a solução por 10 minutos, tomando cuidado para evitar bolhas. Centrifugar novamente a solução durante 10 minutos e transferir o sobrenadante para um balão limpo para posterior utilização.

Ressuspenda suavemente o pellet em 20 mililitros de tampão de amostra e prepare uma amostra para executar o SDS-PAGE. Adicione sulfato de amônio ao sobrenadante até atingir 30% de saturação e agite a solução, evitando bolhas. Centrifugar novamente a solução durante 10 minutos e transferir o sobrenadante para um balão limpo para posterior utilização.

Ressuspenda suavemente a fração de 40% do pellet obtida em 10 mililitros de tampão de amostra dois e prepare uma amostra para executar o SDS-PAGE. Em seguida, microcentrifugue a amostra de 40% de proteína a 10.000 vezes g por 20 minutos a quatro graus Celsius e carregue o sobrenadante obtido em uma coluna HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR previamente balanceada conectada a um instrumento de cromatografia líquida de proteína rápida a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por minuto. Avalie as frações de pico coletadas e as frações de sulfato de amônio em um gel 12%SDS-PAGE corado com azul brilhante de Coomassie.

Concentrar o complexo alfa-dois beta-dois mutantes da triptofano sintase de Salmonella typhimurium com um filtro centrífugo de 100 kilodaltons, centrifugando a 3.000 vezes g, a quatro graus Celsius. Transferir a proteína concentrada para um novo tubo de dois mililitros e centrifugar novamente a 10 000 vezes g durante 10 minutos a quatro graus para remover os agregados. Depois de determinar a concentração de proteínas da amostra, preparar alíquotas de 0,5 mililitros a 20 a 25 miligramas por mililitro.

Congele-os rapidamente em nitrogênio líquido e armazene-os a 80 graus negativos. Prepare uma solução estoque de cinco mililitros de espermina 200 milimolar em água e armazene-a em alíquotas de 500 microlitros a menos 20 graus. Em seguida, prepare uma solução estoque de 50 mililitros de polietilenoglicol 8.000 a 30% em água e mantenha 25 mililitros em um frasco cônico de centrífuga descartável de 50 mililitros a 25 graus Celsius.

Prepare soluções de estoque de 25 mililitros de cloreto de césio de um molar e cloreto de sódio, cada um em água, e mantenha-os a 25 graus Celsius. Prepare três conjuntos de soluções estoque de 50 mililitros de bicina de um molar e titule-o com hidróxido de césio ou hidróxido de sódio para obter soluções tamponadas em pH 7,6, 7,8 e oito. Mantenha alíquotas de 25 mililitros das soluções a quatro graus Celsius.

Descongele uma amostra de complexo de triptofano sintase alfa-dois beta-dois Salmonella typhimurium em um banho de gelo. Em seguida, microcentrifugue-o a 10.000 vezes g por 10 minutos a 25 graus Celsius. Transferir a fracção sobrenadante transparente para um tubo de centrifugação limpo.

Estimar a concentração proteica do sobrenadante e diluir as alíquotas a 15 miligramas por mililitro com hidróxido de césio bicina 50 milimolares ou hidróxido de sódio bicina de pH 7,8, contendo 50 milimolares de césio ou cloreto de sódio. Prepare 500 microlitros de soluções de reservatório para três placas de queda de 24 poços em tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mililitro. Varie a concentração de PEG 8.000 e espermina e altere o pH do tampão conforme descrito no manuscrito do texto para cada conjunto.

Tampe os tubos e vortex vigorosamente por 10 segundos, antes de centrifugá-los a 10.000 vezes g por 10 minutos a 25 graus Celsius para remover bolhas de ar. Dispense 500 microlitros desta solução em cada reservatório. Dispense cinco microlitros de solução de proteína a 15 microgramas por litro em cada poço de gota sentado usando uma micropipeta P-10.

Em seguida, adicione cinco microlitros de cada solução reservatório correspondente à gota de proteína. Evite bolhas de ar durante a mistura e não pipete para cima e para baixo. Por fim, cubra a placa com fita adesiva transparente e guarde-a a 25 graus.

Os cristais aparecem em dois a cinco dias e crescem até suas dimensões completas em duas semanas. Este protocolo foi usado para subclonar a subunidade alfa e a subunidade beta da triptofano sintase de Salmonella typhimurium no vetor SUMO pET modificado. Os resultados representativos de SDS-PAGE de duas bandas fortes correspondentes à proteína de fusão da triptofano sintase His6-SUMO-alfa e His6-SUMO-beta são mostrados aqui.

Cada proteína foi purificada por cromatografia de afinidade do ácido nitrilotriacético e precipitação de sulfato de amônio, seguida de clivagem de His-SUMO-tag, remoção de traços de His-SUMO-tag e medição da concentração de proteínas. O perfil de eluição da subunidade alfa, subunidade beta e complexo alfa-dois beta-dois Salmonella typhimurium triptofano sintase em SEC e a pureza de suas frações de pico são mostrados aqui. Após a geração de formas mutantes do complexo triptofano sintase, o fracionamento do sulfato de amônio foi utilizado para remover as proteínas contaminantes do sistema de expressão heteróloga.

Um perfil de eluição representativo com uma posição relativa de eluição do complexo alfa-dois beta-dois Salmonella typhimurium triptofano sintase em uma coluna de cromatografia de exclusão é mostrado aqui. A pureza das frações de pico excluídas foi analisada usando SDS-PAGE antes do pooling. Grandes monocristais foram obtidos através de uma otimização de cristalização fina variando as concentrações de PEG 8.000 e espermina e o pH do tampão bicina.

Cristais com morfologias diferentes apareceram em dois a cinco dias e cresceram até o tamanho máximo em duas semanas. A validação de mapas de densidade eletrônica para a estrutura cristalina do complexo alfa-dois beta-dois selvagens Salmonella typhimurium triptofano sintase foi elucidada após o refinamento da estrutura cristalina. Ao realizar este protocolo, conclua as etapas iniciais de purificação à temperatura ambiente o mais rápido possível para evitar a perda de atividade da triptofano sintase.

Espera-se que as estruturas cristalinas dos mutantes forneçam novos insights sobre o mecanismo e os papéis desempenhados pelos principais resíduos na síntese de L-triptofano.