Name: PCR Mutagenesis, Clonagem, Expressão, Protocolos rápidos de purificação de proteínas e Cristalização do Tipo Selvagem e Formas Mutantes de Synthase Triptofano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprenda a purificar a triptofano sintase de Salmonella typhimurium usando fracionamento com sulfato de amônio e cromatografia de exclusão molecular. Este método rápido permite isolar formas selvagens e mutantes em um único dia.

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA (GM097569).

<ol><li>Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+synthase%3A+a+multienzyme+complex+with+an+intramolecular+tunnel%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Record%22%5BJournal%5D)">Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel.</a> Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).</li>
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<li>Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+catalytic+properties+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase%2C+a+two-component+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).</li>
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<li>Wilson, D. A., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+the+B+component+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase.</a> Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).</li>
<li>Adachi, O., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+preparing+crystalline+beta+2+subunit+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli+in+high+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).</li>
<li>Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystalline+alpha2+beta2+complexes+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+A+comparison+between+the+native+complex+and+the+reconstituted+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).</li>
<li>Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+proteolytic+derivative+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase.+Identification+of+the+site+of+cleavage+and+characterization+of+the+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments.</a> Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).</li>
<li>Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+crystallographic+data+of+the+tryptophan+synthase+alpha+2+beta+2+complex+from+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).</li>
<li>Miles, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+subunit+of+tryptophan+synthase.+Clarification+of+the+roles+of+histidine+86%2C+lysine+87%2C+arginine+148%2C+cysteine+170%2C+and+cysteine+230%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).</li>
<li>Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+of+K%2B+or+Cs%2B+for+Na%2B+induces+local+and+long-range+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+the+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex.</a> Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).</li>
<li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+a+mutant+%28betaK87T%29+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+with+ligands+bound+to+the+active+sites+of+the+alpha-+and+beta-subunits+reveal+ligand-induced+conformational+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes.</a> Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).</li>
<li>Schneider, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop+closure+and+intersubunit+communication+in+tryptophan+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).</li>
<li>Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-crystallography+of+a+true+substrate%2C+indole-3-glycerol+phosphate%2C+bound+to+a+mutant+%28alphaD60N%29+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+reveals+the+correct+orientation+of+active+site+alphaGlu49%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).</li>
<li>Weyand, M., Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+wild-type+tryptophan+synthase+complexed+with+the+natural+substrate+indole-3-glycerol+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate.</a> Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).</li>
<li>Sachpatzidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallographic+studies+of+phosphonate-based+alpha-reaction+transition-state+analogues+complexed+to+tryptophan+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).</li>
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<li>Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iMOSFLM%3A+a+new+graphical+interface+for+diffraction-image+processing+with+MOSFLM%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, Pt 4 271-281 (2011).</li>
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<li>Vagin, A., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+replacement+with+MOLREP%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular replacement with MOLREP.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 1 22-25 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 2 213-221 (2010).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 4 486-501 (2010).</li>
<li>Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+macromolecular+structures+by+the+maximum-likelihood+method%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, Pt 3 240-255 (1997).</li>
<li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, Pt 4 352-367 (2012).</li>
<li>Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+content+of+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Solvent content of protein crystals.</a> Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</li>
<li>Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coefficient+probabilities%3A+Improved+estimates+for+unit+cell+contents+of+proteins%2C+DNA%2C+and+protein-nucleic+acid+complex+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals.</a> Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar e não declaram interesses financeiros concorrentes.

Nós projetamos com sucesso a forma mutante α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T, e α2β2 complexos βS377A StTS para estudos de correlação estrutura-função. Inicialmente, tentamos purificar os mutantes usando um protocolo de purificação anterior22, que requer α2β cristalização do complexoStTS2com PEG 8000 e espermatozoide durante a purificação. Embora a taxa de cristalização dependa da forma mutante e da co...

O complexo de xodó-sintéria triptofano (TS) (α2β2) é uma enzima alusicana, catalisando os dois últimos passos na biossíntese do aminoácido L-Triptofano em bactérias, plantas e fungos1,2,3. A bactéria Salmonella enterica serovar typhimurium (St)causa uma grave infecção gastrointestinal em humanos e outros animais. Uma vez que os seres humanos e animais superiores não possuem TS (EC 4.2.1.20), a inibição de S. typhimurium αcomplexo 2β2 TS (α2β2StTS) tem sido explorado como um potencial alvo de drogas para o tratamento de criptosporidiose e tuberculose4, infecções genitais e oculares5, e para potencial utilização de herbicidas na agricultura6. O α-subunidade catalisa o decote aldolítico de indole-3-glicerol-fosfato (IGP) ao glicealdeído-3-fosfato (GAP) e indol, através da formação de um teima de ligação indolenina tautomer e, posteriormente, de ligação carbono-carbono para produzir GAP e indole3,6. O sítio β-catallítico contém uma molécula de cofato piridoxal de 5′-fosfato (PLP) ligada a β-Lys87 através de uma base de Schiff, que funciona como um dissipador de elétrons no curso das reações na enzima β-subunidade3,7. O β-local catalisa a substituição do hidroxyl de cadeia lateral L-Serine por indol para dar L-Triptofano e uma molécula de água em uma reação dependente de PLP. St. A TS serve como um modelo de longa data para a investigação de canalização de substratos e comunicação alotérica dentro de complexos multienzimáticos2,3. A comunicação alotérica bidirecional entre as subunidades α e β de TS é necessária para sincronizar as etapas catalíticas e evitar a liberação de indol durante a síntese L-Triptophan3. Para estender esse esforço, preparamos vários mutantes (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr e β-Ser377Ala) por mutação de ponto único para ser usado em novas explorações da relação entre estrutura enzimática, mecanismo e função no local catalítico da subunidade stTS β.
Uma pesquisa detalhada sobre o mecanismo catalítico de α2β2StTS foi iniciada pelo grupo de pesquisa de Edith W. Miles. Estudos iniciais com o complexo escherichia coli nativo α2β2 TS têm focado na purificação e caracterização da subunidade isolada α8,9, isolada β-subunidade10,11 e a reconstituição do complexo α2β2 TS das subunidades isoladas12. A purificação foi realizada por precipitação de sulfato de amônio, diálise amostral, cromatografia DEAE-Sephadex, diálise e uma segunda rodada cromatográfica na coluna DEAE-Sephadex12. Em outro protocolo, a purificação do mesmo complexo foi melhorada carregando o lysato celular esclarecido em uma coluna DEAE-Sephadex seguida de um passo cromatográfico em uma coluna Sepharose 4B, precipitação de sulfato de amônio e diálise13. Ambos os protocolos de purificação duram de 4 a 5 dias. Escherichia coli α2β complexo2 TS cristalizado, mas os cristais não eram adequados para difração de raios-X na época.
Em um novo estudo, formas recombinantes e selvagens de S. typhimurium αcomplexo de 2β2 TS foram purificadas e cristalizadas14,15. O complexo de α2β2StTS foi superexpresso na cepa E. coli CB149 carregando o vetor de expressão pEBA-10. Foram relatados14a coleta e análise inicial de dados de cristalização e difração de raios-X do complexo de α2β2StTS . No entanto, agulhas longas e finas como α2β2Cristaisde St.TS prejudicaram estudos estruturais. Na tentativa de coletar melhores dados de difração de raios-X, outro protocolo de purificação foi descrito para purificar o tipo selvagem e as formas mutantes do α2β2Complexo StTS15. A purificação foi realizada com uma precipitação inicial usando esperteza e PEG 8.000 no lysato celular esclarecido e um grande precipitado volumoso foi removido por centrifugação. A fração supernante contendo altas quantidades de α2β complexoStTSfoiarmazenada por 16-48 h a 4 °C até que os cristais amarelos precipitados. Cristais foram lavados e extensivamente dialisados contra diferentes tampões. O complexo proteico foi recriminado em tampão contendo sulfato de amônio e dialisado15. Embora, a cristalização proteica dependa de concentrações de proteínas e precipitantes em solução, é difícil monitorar, prever e reproduzir a purificação para outras formas mutantes de α2β complexode StTS2em solução. Este protocolo tem a vantagem de não utilizar nenhum método cromatográfico; no entanto, as desvantagens são o longo tempo de purificação necessário para cristalizar, dialisar e recristallizar, normalmente exigindo de 5 a 7 dias. Para obter cristais adequados para coleta de dados de raios-X, mais de 600 condições de cristalização foram avaliadas utilizando-se uma combinação e variação de concentração proteica, temperatura, precipitantes (PEG 4.000, 6.000 e 8.000), e aditivos (CaCl2, MnCl2, ZnCl2, cadáver, putrescina, espermióides ou espermióides)15. Os cristais tinham uma melhor forma cristalina e cresceram mais rápido em condições que continham 12% de PEG 8.000 e 2 mM de espermatozoides. A cristalização foi mais favorável a 25 °C em vez de 4, 30 ou 42 °C e cresceu para dimensões máximas em 3 dias15. Vários α2β2estruturas de cristalstSforam relatadas na época (1996-1999)16,17,18,19,20,21 e muitas outras estruturas foram publicadas até o momento.
Aqui, o objetivo principal é apresentar protocolos alternativos para purificar a sinthase triptofano e otimizar a cristalização proteica. O presente trabalho apresenta melhorias significativas para purificar o tipo selvagem isolado α-subunidade (αStTS), unidade isolada β-subunidade (βStTS), reconstituída αcomplexo de 2β2St.TS das subunidades isoladas, e tipo selvagem e formas mutantes do complexo α2β2St.TS. As vantagens em relação aos protocolos passados são consideráveis, uma vez que o tempo de purificação foi reduzido significativamente e a cristalização e a crioproteção foram otimizadas. Formas mutantes de α2β complexostS2projetado neste trabalho cristalizaram perto da mesma condição usada para a forma tipo selvagem. No entanto, a otimização da cristalização fina foi necessária para obter grandes cristais únicos de qualidade suficiente para a determinação da estrutura em resolução quase atômica. Até o momento, existem 134 estruturas de cristal de sinthase triptofano depositadas no Banco de Dados de Proteínas (PDB), contabilizando 101, 31 e 2 estruturas de cristais, respectivamente, para bactérias, arqueias e eucariotes. Bem, 73 estruturas pertencem ao s. enterica serovar typhimurium e 5 estruturas cristalinas do complexo α2β2StTS têm limites de resolução superiores a 1,50 Angstroms. Não surpreende que 4 em 5 foram preparados em nosso grupo de pesquisa (PDB IDs:5CGQ em 1,18 Å, 4HT3 às 1,30 Å, 4HPJ em 1.45 Å, 6DZ4 em resolução 1.45 Å). As estruturas cristalinas refinadas da forma mutante de α2βcomplexode StTS são esperadas para fornecer novas percepções sobre o mecanismo e os papéis desempenhados por resíduos essenciais de aminoácidos envolvidos na síntese L-Triptofano.

<table><tbody><tr><td>Filtro de 15 mL 10 kDa</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC901024</td><td>unidade de filtro centrífugo</td></tr><tr><td>15 mL 100 kDa</td><td>unidade de filtro centrífugo</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC910024</td></tr><tr><td>2 mL frascos criogênicos</td><td>Corning</td><td>CLS430489</td><td>Frascos criogênicos</td></tr> 2 <tr><td>mL tubos de microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-141</td><td>tubos de microcentrífuga</td></tr><tr><td>24 poços Placa Cryschem</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-158</td><td>Placas de queda de 24 poços</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Tubos cônicos de centrífuga de 50 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-270</td><td>tubos cônicos de centrífuga</td></tr><tr><td>AB15 ACCUMET Basic</td> Medidor de <td>pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-636-AB15</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td> Sulfato de amônio <td>gel de agarose</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td> química <td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td>Incubadora bacteriana antibiótica</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>S35836</td><td>.</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>de restrição bicine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2646100</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Branson 450 Digital Sonifier</td><td>Brason</td><td>B450</td><td>Disruptor celular</td></tr><tr><td>Cloreto de césio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP210-100</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Hidróxido de césio</td><td>Acros Organics</td><td>AC213601000</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>Antibiótico</td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido Fisher</td><td>Scientific</td><td>D1391</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td> químico <td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td>DNA</td></tr><tr><td>polimerase</td> química <td>Thermo Scientific</td><td>F530S</td><td>HF polimerase</td></tr><tr><td>dNTP Set</td><td>Invitrogen</td><td>10-297-018</td><td>dNTPs set</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td>Enzima de restrição</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-100</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Excella E25R Orbital Shaker</td><td>Eppendorf New Brunswick</td><td>M1353-0004</td><td>Incubadora orbital</td></tr><tr><td>GE AKTA Prime Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>8149-30-0004</td><td>FPLC</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel</td><td>Invitrogen</td><td>Kit de</td><td>purificação de DNA</td>K210012</tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104S</td><td>Enzimas de restrição</td></tr><tr><td>Colunas His-Trap</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-5255-01</td><td>5 mL Histrap coluna</td></tr><tr><td>imidazol</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196-500</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0392</td><td>Indutor</td></tr><tr><td>de canamicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>Antibiótico</td></tr><tr><td>Kelvinator Series-100</td><td>Kelvinator</td><td>descontinuado</td><td>Caldo LB de freezer ultrabaixo</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td>Caldo líquido</td></tr><tr><td>Luria Bertani ágar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td>Caldo sólido</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Grânulos químicos da</td><td></td>afinidade de Ni-NTA da enzima da limitação de NcoI New England Biolabs R0193S de Scientific <td>S271-500</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R90115</td><td>Grânulos de agarose de Ni-NTA</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-100</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetilsulfonil</td> químico <td>Fisher Scientific</td><td>44-865-0</td><td>Químico</td></tr><tr><td>fosfato de piridoxal</td><td>Acros Organics</td><td>AC228170010</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>S-200 HR</td><td>Cytiva</td><td>45-000-196 Coluna de</td><td>exclusão de tamanho</td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0156S</td><td>Enzima de restrição</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall químico Centrífuga RC-5B</td><td>Sorvall</td><td>8327-30-1004</td><td>Cetrifugo de piso</td></tr><tr><td>Spermine</td><td>Acros Organics</td><td>AC132750010</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Superdex 200 grau de preparação</td><td>Cytiva</td><td>45-002-491</td><td>Coluna de exclusão de tamanho</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>DNA liagse</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Protease química</td></tr><tr><td>Ubl-específica 1</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>12588018 SUMO Protease</td></tr></tbody></table>

pcr mutagenesis, clonagem, expressão, protocolos rápidos de purificação de proteínas e cristalização do tipo selvagem e formas mutantes de synthase triptofano

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Estudos estruturais com complexo de sindtofano (TS) complexo de bienzyme (α2β2 TS) de Salmonella typhimurium foram realizados para entender melhor seu mecanismo catalítico, comportamento alolítico e detalhes da transformação enzimática do substrato ao produto em enzimas dependentes de PLP. Neste trabalho, um novo sistema de expressão para produzir o isolado α e isolado β-subunidade permitiu a purificação de altas quantidades de subunidades puras e αcomplexo de 2β2St.TS das subunidades isoladas dentro de 2 dias. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade seguida de decote da tag de afinidade, precipitação de sulfato de amônio e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Para melhor compreender o papel dos resíduos-chave na enzima β-local, a mutagênese direta do local foi realizada em estudos estruturais anteriores. Outro protocolo foi criado para purificar o tipo selvagem e mutante α2β2complexosde St.TS. Um protocolo simples, rápido e eficiente usando fracionamento de sulfato de amônio e SEC permitiu a purificação de αcomplexo de 2β2StTS em um único dia. Ambos os protocolos de purificação descritos neste trabalho têm vantagens consideráveis quando comparados com protocolos anteriores para purificar o mesmo complexo usando PEG 8000 e espermaina para cristalizar o complexo α2β2StTS ao longo do protocolo de purificação. Cristalização do tipo selvagem e algumas formas mutantes ocorre em condições ligeiramente diferentes, prejudicando a purificação de alguns mutantes usando PEG 8000 e espermaina. Para preparar cristais adequados para estudos cristalográficos de raios-X foram feitos diversos esforços para otimizar a cristalização, a qualidade do cristal e a crioproteção. Os métodos aqui apresentados devem ser geralmente aplicáveis para a purificação de subunidades de synthase triptofano e tipo selvagem e mutante α2β2complexosde St.TS.

Purificação da α-e βsubunidades do sindtofano synthase A α-subunidade(αStTS) e a β-subunidade (βStTS) do triofetase de typhimurium Salmonella foram subcloradas no vetor pET SUMO modificado. A Figura 1A mostra resultados representativos da SDS-PAGE de duas bandas fortes correspondentes à proteína de fusão His6-SUMO-αStTS (pista αON) e His6-SUMO...

Este artigo apresenta uma série de métodos consecutivos para a expressão e purificação de Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp este protocolo um sistema rápido para purificar o complexo proteico em um dia. Os métodos cobertos são mutagênese direcionada ao local, expressão proteica em Escherichia coli,cromatografia de afinidade, cromatografia de filtração de gel e cristalização.

PCR Mutagenesis, Clonagem, Expressão, Protocolos rápidos de purificação de proteínas e Cristalização do Tipo Selvagem e Formas Mutantes de Synthase Triptofano

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Este protocolo para purificar a enzima triptofano sintase de Salmonella typhimurium é rápido, simples e curto. O fracionamento de sulfato de amônia e a cromatografia de exclusão de tamanho tornam possível purificar o tipo selvagem e o complexo triptofano sintase mutante em um único dia. Esta técnica pode ser aplicada para purificar outras proteínas relacionadas, uma vez que o fracionamento de sulfato de amônia e a cromatografia de exclusão de tamanho são comumente usados para purificar proteínas não marcadas.Para começar, interrompa o pellet celular por sonicação em banho-maria gelado a 80% de amplitude por 20 ciclos usando pulsos de 10 segundos e descansos de 20 segundos. Centrifugar o lisado celular a 30 000 vezes g durante 30 minutos a 25 graus Celsius e aspirar o sobrenadante sem desalojar o sedimento. Filtrar a fracção sobrenadante clarificada com um filtro de 0,45 micrómetros à temperatura ambiente.Adicione lentamente pequenas quantidades de sulfato de amônio ao filtrado até atingir 20% de saturação. Realize o fracionamento de sulfato de amônio a 25 graus Celsius e mexa suavemente a solução por 10 minutos, tomando cuidado para evitar bolhas. Centrifugar novamente a solução durante 10 minutos e transferir o sobrenadante para um balão limpo para posterior utilização.Ressuspenda suavemente o pellet em 20 mililitros de tampão de amostra e prepare uma amostra para executar o SDS-PAGE. Adicione sulfato de amônio ao sobrenadante até atingir 30% de saturação e agite a solução, evitando bolhas. Centrifugar novamente a solução durante 10 minutos e transferir o sobrenadante para um balão limpo para posterior utilização.Ressuspenda suavemente a fração de 40% do pellet obtida em 10 mililitros de tampão de amostra dois e prepare uma amostra para executar o SDS-PAGE. Em seguida, microcentrifugue a amostra de 40% de proteína a 10.000 vezes g por 20 minutos a quatro graus Celsius e carregue o sobrenadante obtido em uma coluna HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR previamente balanceada conectada a um instrumento de cromatografia líquida de proteína rápida a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por minuto. Avalie as frações de pico coletadas e as frações de sulfato de amônio em um gel 12%SDS-PAGE corado com azul brilhante de Coomassie.Concentrar o complexo alfa-dois beta-dois mutantes da triptofano sintase de Salmonella typhimurium com um filtro centrífugo de 100 kilodaltons, centrifugando a 3.000 vezes g, a quatro graus Celsius. Transferir a proteína concentrada para um novo tubo de dois mililitros e centrifugar novamente a 10 000 vezes g durante 10 minutos a quatro graus para remover os agregados. Depois de determinar a concentração de proteínas da amostra, preparar alíquotas de 0,5 mililitros a 20 a 25 miligramas por mililitro.Congele-os rapidamente em nitrogênio líquido e armazene-os a 80 graus negativos. Prepare uma solução estoque de cinco mililitros de espermina 200 milimolar em água e armazene-a em alíquotas de 500 microlitros a menos 20 graus. Em seguida, prepare uma solução estoque de 50 mililitros de polietilenoglicol 8.000 a 30% em água e mantenha 25 mililitros em um frasco cônico de centrífuga descartável de 50 mililitros a 25 graus Celsius.Prepare soluções de estoque de 25 mililitros de cloreto de césio de um molar e cloreto de sódio, cada um em água, e mantenha-os a 25 graus Celsius. Prepare três conjuntos de soluções estoque de 50 mililitros de bicina de um molar e titule-o com hidróxido de césio ou hidróxido de sódio para obter soluções tamponadas em pH 7,6, 7,8 e oito. Mantenha alíquotas de 25 mililitros das soluções a quatro graus Celsius.Descongele uma amostra de complexo de triptofano sintase alfa-dois beta-dois Salmonella typhimurium em um banho de gelo. Em seguida, microcentrifugue-o a 10.000 vezes g por 10 minutos a 25 graus Celsius. Transferir a fracção sobrenadante transparente para um tubo de centrifugação limpo.Estimar a concentração proteica do sobrenadante e diluir as alíquotas a 15 miligramas por mililitro com hidróxido de césio bicina 50 milimolares ou hidróxido de sódio bicina de pH 7,8, contendo 50 milimolares de césio ou cloreto de sódio. Prepare 500 microlitros de soluções de reservatório para três placas de queda de 24 poços em tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mililitro. Varie a concentração de PEG 8.000 e espermina e altere o pH do tampão conforme descrito no manuscrito do texto para cada conjunto.Tampe os tubos e vortex vigorosamente por 10 segundos, antes de centrifugá-los a 10.000 vezes g por 10 minutos a 25 graus Celsius para remover bolhas de ar. Dispense 500 microlitros desta solução em cada reservatório. Dispense cinco microlitros de solução de proteína a 15 microgramas por litro em cada poço de gota sentado usando uma micropipeta P-10.Em seguida, adicione cinco microlitros de cada solução reservatório correspondente à gota de proteína. Evite bolhas de ar durante a mistura e não pipete para cima e para baixo. Por fim, cubra a placa com fita adesiva transparente e guarde-a a 25 graus.Os cristais aparecem em dois a cinco dias e crescem até suas dimensões completas em duas semanas. Este protocolo foi usado para subclonar a subunidade alfa e a subunidade beta da triptofano sintase de Salmonella typhimurium no vetor SUMO pET modificado. Os resultados representativos de SDS-PAGE de duas bandas fortes correspondentes à proteína de fusão da triptofano sintase His6-SUMO-alfa e His6-SUMO-beta são mostrados aqui.Cada proteína foi purificada por cromatografia de afinidade do ácido nitrilotriacético e precipitação de sulfato de amônio, seguida de clivagem de His-SUMO-tag, remoção de traços de His-SUMO-tag e medição da concentração de proteínas. O perfil de eluição da subunidade alfa, subunidade beta e complexo alfa-dois beta-dois Salmonella typhimurium triptofano sintase em SEC e a pureza de suas frações de pico são mostrados aqui. Após a geração de formas mutantes do complexo triptofano sintase, o fracionamento do sulfato de amônio foi utilizado para remover as proteínas contaminantes do sistema de expressão heteróloga.Um perfil de eluição representativo com uma posição relativa de eluição do complexo alfa-dois beta-dois Salmonella typhimurium triptofano sintase em uma coluna de cromatografia de exclusão é mostrado aqui. A pureza das frações de pico excluídas foi analisada usando SDS-PAGE antes do pooling. Grandes monocristais foram obtidos através de uma otimização de cristalização fina variando as concentrações de PEG 8.000 e espermina e o pH do tampão bicina.Cristais com morfologias diferentes apareceram em dois a cinco dias e cresceram até o tamanho máximo em duas semanas. A validação de mapas de densidade eletrônica para a estrutura cristalina do complexo alfa-dois beta-dois selvagens Salmonella typhimurium triptofano sintase foi elucidada após o refinamento da estrutura cristalina. Ao realizar este protocolo, conclua as etapas iniciais de purificação à temperatura ambiente o mais rápido possível para evitar a perda de atividade da triptofano sintase.Espera-se que as estruturas cristalinas dos mutantes forneçam novos insights sobre o mecanismo e os papéis desempenhados pelos principais resíduos na síntese de L-triptofano.

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Research

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Biochemistry

Bioquímica

Descreve-se um método para a purificação por afinidade, marcado de proteínas recombinantes, utilizando o líquido de manipulação robótica. Este método é geralmente aplicável para a purificação de pequena escala de solúveis Sua proteínas marcadas em um formato de alto rendimento.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

Este manuscrito descreve como para o rastreio de mutações thermostabilizing, purificar o transportador humano de serotonina, gerar anticorpos de elevada afinidade, e cristalizar o complexo transportador-anticorpo serotonina ligada ao -citalopram S droga antidepressiva. Este protocolo pode ser adaptado para o estudo de outros transportadores difíceis de membrana, receptores e canais.

Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

Descrevemos uma estrutura que incorpora análise bioquímica e computacional direta para orientar a caracterização e cristalização de grandes domínios de bobina enrolada. Essa estrutura pode ser adaptada para proteínas globulares ou estendida para incorporar uma variedade de técnicas de alto rendimento.

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Este artigo descreve métodos específicos para obter quantidades bioquímicas de detergente-solubilizado TRPV1 para análises espectroscópicas. Os protocolos combinados fornecem ferramentas bioquímicas e biofísicas que podem ser adaptadas para facilitar estudos estruturais e funcionais para os canais de íon mamíferos em um ambiente controlado por membrana.

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Descrito aqui é um método simples para a purificação de um produto genético em Streptococcus mutans. Esta técnica pode ser vantajosa na purificação de proteínas, especialmente proteínas de membrana e proteínas de massa molecular elevada, podendo ser utilizada com várias outras espécies bacterianas.

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Purificação e identificação de proteínas específicas do tipo celular de tecidos complexos usando uma linha de camundongo mutante de metionina tRNA sintetase

Aprenda a purificar a triptofano sintase de Salmonella typhimurium usando fracionamento com sulfato de amônio e cromatografia de exclusão molecular. Este método rápido permite isolar formas selvagens e mutantes em um único dia.

PCR Mutagenesis, Clonagem, Expressão, Protocolos rápidos de purificação de proteínas e Cristalização do Tipo Selvagem e Formas Mutantes de Synthase Triptofano (Vídeo) | JoVE Journal

PCR Mutagenesis, Clonagem, Expressão, Protocolos rápidos de purificação de proteínas e Cristalização do Tipo Selvagem e Formas Mutantes de Synthase Triptofano

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