Inserção Co-Translacional de Proteínas de Membrana em Nanodiscos Pré-Formados

O protocolo é altamente eficiente e versátil. Pode ser aplicado a quase qualquer proteína de membrana, e todo o procedimento de produção é concluído em um dia. As proteínas de membrana sintetizadas podem ser estabilizadas já co-traducionalmente por ligantes fornecidos.

Os contatos com detergente são completamente evitados e as proteínas se inserem e se dobram diretamente em ambientes de membrana fornecidos e personalizados. Abordagens estruturais, caracterização funcional e geração de anticorpos são as principais áreas de aplicação. Além disso, a técnica é direta na análise dos efeitos lipídicos no dobramento e na função das proteínas da membrana.

No terceiro dia de cultura, inocule 10 litros de meio YPTG estéril a 37 graus Celsius em um reator de tanque agitado de 15 litros com 100 mililitros de pré-cultura. E cultive as bactérias a 37 graus Celsius com 500 rotações por minuto em alta aeração. Para evitar a formação excessiva de espuma, adicione antiespuma estéril.

Quando as células atingirem a fase mid-log, adicione 300 mililitros de etanol à cultura e incube as células a 42 graus Celsius com 500 rotações por minuto em alta aeração por mais 45 minutos. No final da incubação, colha as células por centrifugação e use uma espátula e uma pipeta para ressuspender as células completamente em 300 mililitros de tampão S30A. Centrifugue as bactérias ressuspensas duas vezes, lavando o pellet com 300 mililitros de S30A fresco por lavagem.

Após a segunda lavagem, ressuspenda as células em um volume de 1,1 de tampão S30B. Carregue a suspensão em uma célula de pressão pré-resfriada e interrompa as células a 1.000 libras por polegada quadrada de uma vez. Para remover quaisquer componentes instáveis e liberar o mRNA dos ribossomos, ajuste o lisado para cloreto de sódio 0,4 molar e incube a amostra por 45 minutos em banho-maria a 42 graus Celsius.

Para montar os nanodiscos de proteína de andaime de membrana, misture a solução MSP1E3D1 com a solução lipídica e adicione DPC a uma concentração final de 0,1% Ajuste a reação ao volume final apropriado de acordo com a tabela e incube as reações por uma hora a 21 graus Celsius sob agitação suave. No final da incubação, umedeça previamente a membrana de um de diálise com tampão de formação de disco e use uma seringa para carregar a mistura de montagem no. Em seguida, dialisar a reação contra três volumes de cinco litros de tampão de formação de disco por 10 a 20 horas à temperatura ambiente com agitação antes de transferir a mistura para unidades de filtro centrífugo balanceado com tampão de formação de disco com um corte de peso molecular de 10 kilodalton.

Em seguida, concentrar a reacção em, pelo menos, 300 micromolares por centrifugação, utilizando um leitor UV-Vis para medir a concentração. Para preparar uma reação livre de células de troca contínua de três mililitros, equilibre a membrana de um de diálise de três mililitros em triacetato de 100 milimolares. E use uma seringa para transferir a mistura de reação para o.

Usando uma seringa, remova o excesso de ar do compartimento da mistura de reação e coloque o na câmara de diálise. Encha a câmara com 60 mililitros de mistura de alimentação e coloque a tampa na câmara. Depois de fixar a tampa no lugar, incube a câmara por 12 a 16 horas a 30 graus Celsius em 200 rotações por minuto.

Para preparar uma configuração de reação livre de células de troca celular de 60 microlitros para triagem de íons de magnésio, adicione 60 microlitros de nosso 3X Master Mix recém-preparado à mistura de reação e 825 microlitros à mistura de alimentação. E encha a mistura de alimentação com água. Após o vórtice, adicione 825 microlitros de mistura de alimentação a cada um dos três poços de uma microplaca de 24 poços.

Corte os tubos de diálise de celulose regenerada com um corte de peso molecular de 10 a 14 kilodalton em pedaços de aproximadamente 25 por 20 milímetros e armazene os pedaços em água suplementada com 0,05% de azida de sódio. Antes da montagem do recipiente sem células de troca de minicélulas, use um lenço de papel para remover o excesso de água das membranas de diálise e coloque um pedaço de membrana em cada recipiente. Fixe as membranas com um anel de politetrafluoretileno e transfira o mini recipiente para um poço de mistura de alimentação.

Adicione os componentes de alto peso molecular à mistura de reação, conforme indicado na tabela, e misture por pipetagem. Adicione 60 microlitros de mistura de reação ao recipiente de reação, tomando cuidado para evitar bolhas de ar. E enrole duas folhas de oito por 10 centímetros de um filme termoplástico de vedação ao redor da placa de 24 poços.

Fixe a tampa da placa do poço com fita adesiva e coloque a placa a 30 graus Celsius em 200 rotações por minuto com agitação por 12 a 16 horas. Na manhã seguinte, use uma ponta de pipeta para perfurar a membrana de diálise no recipiente livre de células de troca de minicélulas e aspire a mistura de reação. Transfira a mistura de reação para novos tubos de centrífuga e centrifugue para remover os precipitados.

Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo. Aqui é mostrado um impacto representativo dos compostos de reação de ajuste fino no rendimento final ou na qualidade das proteínas de membrana sintetizadas. Nesta análise, a síntese geral e a solubilização de nanodiscos do receptor adrenérgico T-beta-ona foram semelhantes em todas as composições de membrana analisadas.

Em contraste, uma variação muito maior foi detectada na qualidade do receptor acoplado à proteína G sintetizada, com a menor atividade obtida com os lipídios DMPC e POPC, e a maior observada quando DOPG e POPG foram aplicados. Em conjunto, esses resultados indicam que a carga do grupo lipídico da cabeça, bem como a flexibilidade da cadeia de ácidos graxos, são importantes moduladores para o dobramento e a atividade dessa proteína da membrana celular. A concentração final do nanodisco também pode ser um fator importante para a qualidade da proteína da membrana.

Por exemplo, se a concentração do nanodisco for rastreada dentro de uma faixa de 3,75 a 60 micromolares, uma solubilização completa do receptor acoplado à proteína G é obtida em aproximadamente 30 nanodiscos micromolares, dando uma proporção de uma a três proteínas de membrana para nanodiscos. Em contraste, uma solubilização completa da proteorodopsina pode ser alcançada com nanodiscos de aproximadamente 10 micromolares, dando uma proporção de proteorodopsina para nanodisco de 10 para um. Pipetagem precisa e componentes de alta qualidade são certamente obrigatórios.

As etapas críticas para a preparação do lisado são a colheita das células na fase intermediária e a aplicação da etapa com alto teor de sal. A técnica reduz drasticamente a complexidade da síntese de proteínas de membrana. Alvos anteriormente desafiadores são sintetizados de forma eficiente, permitindo assim trabalhar em estruturas moleculares de proteínas farmacêuticamente relevantes até agora inexploradas.