Name: Análise automatizada da marcha para avaliar a recuperação funcional em roedores com lesão de contusão do nervo periférico ou da medula espinhal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Aprenda análise automatizada da marcha para avaliar recuperação funcional em roedores com lesões de nervo periférico ou medula espinhal. Este método permite examinar alterações locomotoras pós-lesão.

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Os autores gostariam de agradecer a Karin Brenner por sua cuidado apaixonada com os animais. Os autores também gostariam de agradecer Claudia Keibl, James Ferguson, Gabriele Leinfellner e Susanne Drechsler por sua ajuda durante as cirurgias experimentais.

Os autores declaram que este trabalho foi apoiado pela Noldus Inc. pela cobertura da taxa de publicação de acesso aberto. Nenhum dos autores recebeu nenhum salário pessoal ou qualquer tipo de gratificação financeira. Os autores não têm outros interesses concorrentes para declarar.

A avaliação da recuperação funcional em modelos animais de PNI e SCI continua sendo desafiadora devido à grande variedade de métodos de avaliação, cada um com vantagens e desvantagens individuais. Apenas poucas abordagens foram testadas e validadas em múltiplos modelos de lesões nervosas periféricas e centrais, embora novas técnicas promissoras que combinem rastreamento de movimento e aprendizado de máquina podem potencialmente impulsionar a pesquisa neurobehavioral para o próximo nível de testes funcionais. Estamos convencidos de que métodos de ponta amplamente aplicáveis a uma grande variedade de modelos de animais e lesões surgirão em breve. À luz dessas considerações, uma das vantagens da AGA é a possibilidade de avaliar a recuperação funcional em múltiplos modelos de lesão nervosa usando apenas um dispositivo. Desde o início dos anos 2000, essa abordagem tem sido utilizada em modelos experimentais de PNI, como o ciático37, peroneal38, e o modelo de lesão do nervo femoral22, bem como após a avulsão raiz tanto doplexo lombar 39 quanto do plexo braquial40. Várias lesões nervosas centrais, incluindo lesão por contusão medular, também foram estudadas com o método41,42. Com este artigo, apresentamos um protocolo detalhado sobre como induzir três lesões nervosas comumente estudadas, bem como como avaliar a recuperação funcional posteriormente. Em nossa opinião, uma diretriz prática para pesquisadores interessados na área de lesão nervosa experimental, reparo e regeneração sobre como fazer o uso ideal das características vantajosas do método seria de grande ajuda.
Vários autores abordaram o potencial da AGA para avaliar a recuperação funcional em roedores, destacando a vantagem do método de avaliar simultaneamente parâmetros de marcha relacionados à reinervação motora e sensorial27,28. Além disso, a comparação dos dados de uma pata experimental, por exemplo, reconstruiu a lesão nervosa a uma pata não operada, como foi mostrado em ambos os modelos apresentados, permite a inclusão de um controle positivo intra-animal. Inversamente, uma pata operada sem reconstrução cirúrgica ou tratamento adicional poderia servir como um controle negativo intra-animal. Também foi demonstrado que é possível combinar AGA com abordagens de aprendizado de máquina43. Apesar das vantagens do método, também possui diversas limitações e desvantagens, como os esforços de treinamento demorados, que são obrigatórios para acostumar o animal ao procedimento de aquisição28,44. Outra limitação da AGA é o tamanho máximo dos animais elegíveis para testes devido às dimensões limitadas do aparelho. Portanto, o uso da AGA está atualmente limitado a animais do tamanho de roedores e furões45. Além disso, abordagens de avaliação neuroabameteral recentemente emergentes no campo do rastreamento de movimento capazes de aprender de máquina podem superar a AGA tanto na integralidade quanto nas possíveis aplicações18,19,46. Mais notável, mas de acordo com outros métodos de avaliação, parece que a recuperação funcional avaliada pela AGA é fortemente limitada — se mesmo ocorrendo — em modelos de neurotmese do nervo ciático47,48. Por outro lado, a AGA permite uma avaliação abrangente do curso de recuperação funcional após a neurotmese do nervo femoral, como mostrado por nossos dados. Com este trabalho, demonstramos que a Área de Impressão do Pata é um parâmetro de marcha representativo avaliado via AGA, o que é exemplar para o curso de recuperação funcional nos dois modelos de lesão nervosa periférica supracitados apresentados por nós. Enquanto o anúncio de recuperação funcional integrum era observável após a reparação do autoenxerto do nervo femoral, os parâmetros de AGA ainda foram significativamente alterados da linha de base no final do período de observação após a reparação do autoenxerto do nervo ciático. Vale ressaltar neste contexto que as contraturas de membros são um fenômeno comum em ratos com lesão do nervo ciático e é necessário cautela para não confundir esses sinais de desequilíbrio muscular e paralisia com a recuperação funcional em andamento32. Isso, por um lado, sublinha a incapacidade do método AGA de detectar recuperação funcional significativa após a lesão neurotmese neste modelo. Por outro lado, levanta a questão se é viável avaliar o modelo de lesão do nervo ciático do rato, que ainda é o modelo de reparação nervosa experimental mais utilizado, por meio da análise da marcha em geral, caso a lesão nervosa seja mais grave do que a axonotmesis48. Detalhes de solução de problemas são fornecidos no Arquivo Complementar 1.
Também fornecemos dados exemplares sobre o uso do método para avaliar a função locomotor em ratos com Lesão medular, o que é possível sem quaisquer alterações necessárias do procedimento de configuração ou aquisição de hardware. O mesmo princípio se aplica a outros modelos de roedores de lesão nervosa central (CNI)26,49,50 e lesão por avulsão raiz. Em contraste com as PNIs isoladas, as lesões da medula espinhal são muito mais complexas em suas consequências fisiodicosiológicas, pois uma infinidade de estruturas altamente importantes são danificadas, envolvendo vias efervescentes como os tratos corticospinal e rubrospinal e caminhos diferentes, como as colunas dorsais e os tratos fusotalâmicos35. O desafio de avaliar adequadamente essas mudanças patológicas se reflete no armamento abrangente de testes comportamentais, como a pontuação Basso, Beattie e Bresnahan (BBB)36. A base de apoio do parâmetro de marcha foi relatada para aumentar após lesões nervosas centrais, provavelmente para explicar uma marcha instável resultante. A Base de Suporte foi significativamente alterada da linha de base de WPO10 para WPO14 em nosso modelo, apoiando nossa presunção de que este parâmetro permite a avaliação do curso de recuperação funcional pela AGA após lesão de contusão na medula espinhal torácica.
Estamos convencidos de que a AGA é uma ferramenta viável para avaliar a recuperação funcional em roedores com lesões do sistema nervoso. No entanto, aconselhamos refletir as mudanças observadas da marcha cuidadosamente e minuciosamente em cada configuração experimental respectiva. Alterações nos parâmetros de marcha, por exemplo, um aumento na Área de Impressão após um decréscimo pós-operatório imediato ou uma diminuição no Tempo de Oscilação procedendo uma elevação pós-operatória imediata deste parâmetro, ao longo do período de observação não se relacionam inevitavelmente com a recuperação funcional. Em vez disso, essas mudanças também podem estar relacionadas a uma possível adaptação funcional para manter uma marcha discreta, uma vez que os ratos são uma espécie de presa e tentam evitar mostrar dor ou incapacidade para potenciais predadores51. Recomenda-se, portanto, a utilização da análise de marcha automatizada como ferramenta complementar para relacionar alterações da marcha a outras medidas de desfecho de lesão nervosa periférica e regeneração21. Como mencionado anteriormente, também acreditamos que deve ser cuidadosamente refletido se roedores com neurotmese do nervo ciático devem ser investigados por meio da AGA, pois nosso achado indica fortemente que a recuperação funcional é severamente limitada neste caso.
Como mostrado em nosso trabalho, o principal ativo da AGA é a possibilidade de estudar a reinervação motora e sensorial em uma infinidade de modelos PNI experimentais, bem como a CNI, exigindo apenas uma configuração. Portanto, o método é, em nossa opinião, uma ferramenta altamente valiosa para testes neuroviolíno abrangentes. Um dos ativos da AGA, que é a possibilidade de estudar a reinnervação motora e sensorial em vários modelos animais de PNI e CNI, exigindo apenas uma configuração, é, em nossa opinião, a principal vantagem do método em comparação com outros métodos de avaliação para estudar a recuperação funcional, como a análise de pista de caminhada52, von Frey testando53, ou cinemática marcha16. O potencial de avaliar simultaneamente mudanças de marcha que se correlacionam com resultados de investigações eletrofisiológicas do músculo reinnervado22 ou métodos de avaliação para função sensorial54 é promissor em relação às aplicações futuras do método. Por isso, recomendamos o uso da AGA para investigar a recuperação funcional em modelos de roedores de PNI de membro dianteiro, como o nervo ulnar, radial ou mediano, ou modelos experimentais de transferência de nervo55,que ainda não foram estudados com este método.
Fornecemos um protocolo detalhado sobre como usar a análise automatizada da marcha para estudar a recuperação funcional em três modelos de roedores de lesão nervosa. Embora o método exija uma cuidadosa consideração de vários aspectos-chave, como treinamento adequado e calibração meticulosa de software e força, é uma ferramenta complementar viável e valiosa para avaliar a regeneração nervosa em modelos de roedores de lesão nervosa central e periférica.

Lesões do sistema nervoso periférico e central são frequentemente estudadas em roedores, resultando em uma grande quantidade de dados comparativos sobre o curso de lesão nervosa, reparação ou neuroproteção para neutralizar novas lesões secundárias e regeneração1,2,3. O resultado de estratégias experimentais de tratamento em modelos de roedores pode ser avaliado por uma variedade de técnicas como histologia, imunohistoquímica, eletrofisiologia e técnicas de imagem, como microtomografia de raios-X (μCT), mas o critério mais importante para determinar o sucesso de um tratamento é , como em pacientes humanos , o grau de recuperação funcional4,5. Os primeiros estudos que investigam o desempenho locomotor em roedores datam dos anos 19406,7,8. Ratos e camundongos foram sujeitos a uma grande quantidade de estudos que investigam seu comportamento locomotor nas décadasseguintes 9,10,11. Atualmente, existem uma ampla gama de técnicas de avaliação para modelos de roedores de lesões periféricas e centrais nervosas, que vão desde a análise de pista de caminhada com tinta e papel12,13,14 sobre a tornozeleira e a cinemática de marcha15,16,17 até métodos aprimorados de aprendizado de máquina, que permitem a estimativa de complexo de marcha, membro e trajetória articulatória18,19.
A Análise Automatizada de Marcha (AGA) computadorizada é usada para avaliar a função locomotor após lesões nervosas periféricas e centrais e potencial tratamento experimental de tais lesões. O dispositivo consiste principalmente de uma passarela de vidro e uma fonte de luz que ilumina as impressões da pata do roedor em correlação com a pressão excedida por eles. Esses dados são então informatizados para calcular uma ampla gama de parâmetros estáticos e dinâmicos. Segundo Deumens, esses parâmetros podem ser subdivididos nas categorias de parâmetros gerais, parâmetros relacionados à dor, bem como parâmetros relacionados à coordenação da marcha20 (Tabela 1). A viabilidade da AGA para detectar alterações no comportamento da marcha tem sido comprovada em vários modelos animais de lesão nervosa periférica (PNI)21, como o nervo ciático20,nervo femoral22e nervo mediano23,24. Também é usado rotineiramente para avaliar a função locomotor em ratos com lesões nervosas centrais, por exemplo, lesão de curso25 ou contusão medular26. Os avanços do método residem na grande quantidade de dados comparáveis e na sua possibilidade de registrar uma infinidade de parâmetros relacionados à marcha27. Este artigo tem como objetivo fornecer aos pesquisadores interessados em modelos animais de PNI e lesão medular (SCI) uma diretriz detalhada e prática para avaliar a função locomotor nesses modelos.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Categoria</td>
			<td>Parâmetro</td>
			<td colspan="2">Descrição</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Parâmetros gerais da marcha</td>
			<td>Área de impressão (unidade de distância)</td>
			<td colspan="2">Área da impressão da pata</td>
		</tr>
<tr>
<td>Comprimento de impressão (unidade de distância)</td>
			<td colspan="2">Comprimento da impressão da pata</td>
		</tr>
<tr>
<td>Base de Suporte (BoS) (unidade de distância)</td>
			<td colspan="2">Distância entre as duas patas traseiras ou dianteiras</td>
		</tr>
<tr>
<td>Comprimento do passo (unidade de distância)</td>
			<td colspan="2">Distância entre duas colocações consecutivas de uma pata</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Parâmetros relacionados à dor da marcha</td>
			<td>Tempo de swing (s)</td>
			<td colspan="2">Duração da fase de balanço</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo de espera (s)</td>
			<td colspan="2">Duração da fase de postura</td>
		</tr>
<tr>
<td>Intensidade média da impressão da pata (unidade arbitrária)</td>
			<td colspan="2">Significa iIntensity da impressão da pata durante a fase de postura</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Parâmetros relacionados à coordenação da marcha</td>
			<td>Padrões normais de sequência de passos (NSSP)</td>
			<td colspan="2">Sequências específicas de colocações de patas durante um ciclo de passos</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispersões de fase (%)</td>
			<td colspan="2">Diferenças temporais entre os ciclos de passo de duas patas específicas</td>
		</tr>
<tr>
<td>Índice de Regularidade (RI) (%)</td>
			<td colspan="2">Quantificação da coordenação interlimb dividindo a quantidade de NSSP impecável vezes 4 pelo número total de colocação da pata durante um ciclo de passo</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Parâmetros de marcha avaliados com a análise de marcha automatizada. As categorias em que os parâmetros são classificados são escolhidas de acordo com Deumens et al.20.

<table><tbody><tr><td>Solução salina a 0,9%</td><td>B. Braun Áustria</td><td>3570410</td><td>Veículo para administração de medicamentos</td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>B. Braun Áustria</td><td>9161708V</td><td>Dispositivo de injeção</td></tr><tr><td>Seringa de 10 ml</td><td>B. Braun Áustria</td><td>4606728 V</td><td>Dispositivo de injeção</td></tr><tr><td>1-Propanol, 2-Propanol, Hexetidin</td><td>Gebro Pharma</td><td>N/A</td><td>Desinfecção alcoólica da pele</td></tr><tr><td>23-gauge (G) cânula</td><td>B. Braun Áustria</td><td>4657667</td><td>Cânula para injeção s.c.</td></tr><tr><td>Cânula de calibre 26 (G)</td><td>B. Braun Áustria</td><td>4657683</td><td>Cânula para injeção s.c.</td></tr><tr><td>Seringa de 5 ml</td><td>B. Braun Áustria</td><td>4606710 V</td><td>Dispositivo de injeção</td></tr><tr><td>Cloridrato de buprenorfina</td><td>Sigma</td><td>B9275</td><td>Agente analgético</td></tr><tr><td>Fresas para Micro Broca</td><td>F.S.T</td><td>19007-29</td><td>Perfuração de um furo interno a lâmina</td></tr><tr><td>Caprofeno</td><td>Zoetis Áustria</td><td>N/A</td><td>Agente analgético</td></tr><tr><td>Catwalk Sistema automatizado de análise da marcha</td><td>Noldus</td><td>N/A</td><td>Software de análise automática da marcha animal</td></tr><tr><td>Kit Cauterizador</td><td>F.S.T</td><td>18010-00</td><td>Cauterização de vasos durante a cirurgia</td></tr><tr><td>Enrofloxacina</td><td>Bayer Áustria</td><td>N/A</td><td>Antibiótico</td></tr><tr><td>Ethilon (10-0)</td><td>ETHICON</td><td>2810G</td><td>Material de sutura para neurrorrafia</td></tr><tr><td>Ethilon (11-0)</td><td>ETHICON</td><td>EH7465G</td><td>Material de sutura para neurrorrafia</td></tr><tr><td>Pomada para os olhos</td><td>Fresenius Kabi Áustria</td><td>4302436</td><td>Proteção para os olhos durante a anestesia</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>FST</td><td>16221-14</td><td>Instrumento cirúrgico</td></tr><tr><td>Gabapentina</td><td>Wedgewood Pharmacy</td><td>N/A</td><td>Agente analgésico</td></tr><tr><td>Retractor Goldstein</td><td>F.S.T</td><td>17003-03</td><td>Retracção dos tecidos durante a cirurgia</td></tr><tr><td>Aparador de cabelo</td><td>Aescular</td><td>N/A</td><td>Aparador de cabelo para barbear o local da operação antes da cirurgia</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento para roedores</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>N/A</td><td>Regulação da temperatura corporal</td></tr><tr>Sistemas de <td>precisão e instrumentação</td> do<td>impactor</td><td>N/A</td><td>Indução de contusão da medula espinhal</td></tr><tr><td>Rato de Lewis (<img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/61852/61852equ01.jpg">)</td><td>Janvier</td><td>N/A</td><td>Sistema de</td></tr><tr><td>Retração do Fixador Magnético</td> Animal Experimental <td>F.S.T</td><td>18200-50</td><td>Retração de tecidos durante a cirurgia</td></tr><tr><td>Metzenbaum Baby Scissors</td><td>F.S.T</td><td>14019-13</td><td>Instrumento cirúrgico</td></tr><tr><td>Micro Instrumentos de precisão de palavras de broca</td><td></td><td>503599</td><td>instrumento para perfuração óssea</td></tr><tr><td>Micro porta-agulhas</td><td>FST</td><td>12076-12</td><td>Instrumento cirúrgico</td></tr><tr><td>Micro-tesoura (curva)</td><td>FST</td><td>15023-10</td><td>Instrumento cirúrgico</td></tr><tr><td>Micro-tesoura (reta)</td><td>FST</td><td>15007-08</td><td>Instrumento cirúrgico</td></tr><tr><td>Pinça de acabamento espelhado</td><td>FST</td><td>11251-23</td><td>Instrumento cirúrgico</td></tr><tr><td>Porta-agulhas</td><td>F.S.T</td><td>12002-12</td><td>Instrumento cirúrgico</td></tr><tr><td>Microscópio cirúrgico</td><td>Leica</td><td>M651 MSD</td><td>Ampliação do sítio operatório</td></tr><tr><td>Povidona Iod</td><td>B. Braun Melsungen</td><td>N/A</td><td>Desinfetante de pele não alcoólico</td></tr><tr><td>Oxímetro de pulso</td><td>STARR Life Sciences</td><td>N/A</td><td>Vigilância da frequência cardíaca e saturação de oxigênio</td></tr><tr><td>Termómetro para roedores</td><td>BIOSEB</td><td>BIO-TK8851</td><td>Vigilância da temperatura corporal</td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi</td><td>F.S.T</td><td>10010-00 (#10)</td><td>Instrumento cirúrgico para fazer uma incisão</td></tr><tr><td>Cabo de bisturi</td><td>F.S.T</td><td>10003-12</td> <td>Instrumento cirúrgico para fazer uma incisão</td></tr><tr><td>Sevoflurano Vapor de Inalação, Líquido (100%)</td><td>Anestésico</td><td></td><td></td></tr> <tr>Baxter HDG9117A<td>Espátula &amp; Sonda</td><td>FST</td><td>10090-13</td><td>Instrumento cirúrgico</td></tr><tr><td>Rato Sprague Dawley (<img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/61852/61852equ01.jpg">)</td><td>Janvier</td><td>N/A</td><td>Animal experimental</td></tr><tr><td>Gaze esterila 5x5cm</td><td>EVAC MEDICAL</td><td>E010.03.00215</td><td>Compressa de gaze estéril</td></tr><tr><td>Fórceps de tecido</td><td>FST</td><td>11021-12</td><td>Instrumento cirúrgico</td></tr><tr><td>Vicryl (4-0)</td><td>ETHICON</td><td>V3040H</td><td>Material de sutura para suturas subcutâneas</td></tr><tr><td>Vicryl (5-0)</td><td>ETHICON</td><td>V303H</td><td>Material de sutura para suturas subcutâneas</td></tr><tr><td>Agulha de corte Vicryl (4-0)</td><td>ETHICON</td><td>V392ZH</td><td>Material de sutura para suturas cutâneas Agulha</td></tr><tr><td>de corte Vicryl (5-0)</td><td>ETHICON</td><td>V391H</td><td>Material de sutura para suturas cutâneas</td></tr></tbody></table>

análise automatizada da marcha para avaliar a recuperação funcional em roedores com lesão de contusão do nervo periférico ou da medula espinhal

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Lesões periféricas e centrais do nervo são estudadas principalmente em roedores, especialmente ratos, dado o fato de que esses modelos animais são econômicos e muitos dados comparativos foram publicados na literatura. Isso inclui uma infinidade de métodos de avaliação para estudar a recuperação funcional após lesões nervosas e reparos. Além da avaliação da regeneração nervosa por meio de histologia, eletrofisiologia e outras técnicas de avaliação in vivo e in vitro, a recuperação funcional é o critério mais importante para determinar o grau de regeneração neural. A análise automatizada da marcha permite o registro de uma grande quantidade de parâmetros relacionados à marcha, como a Área de Impressão do Pata e a Velocidade de Balanço da Pata, bem como medidas de coordenação entre membros. Além disso, o método fornece dados digitais das patas dos ratos após danos neuronais e durante a regeneração nervosa, adicionando ao nosso entendimento de como lesões nervosas periféricas e centrais afetam seu comportamento locomotor. Além do modelo de lesão do nervo ciático predominantemente utilizado, outros modelos de lesão nervosa periférica, como o nervo femoral, podem ser estudados por meio deste método. Além das lesões do sistema nervoso periférico, podem ser avaliadas lesões do sistema nervoso central, por exemplo, contusão medular. A avaliação de dados válida e reprodutível depende fortemente do ajuste meticuloso das configurações de software e hard antes da aquisição de dados. Além disso, o treinamento adequado dos animais experimentais é de importância crucial. Este trabalho tem como objetivo ilustrar o uso da análise de marcha automatizada computadorizada para avaliar a recuperação funcional em diferentes modelos animais de lesão nervosa periférica, bem como lesão de contusão medular. Também enfatiza as limitações do método, por exemplo, a avaliação da regeneração nervosa em ratos com neurotmese do nervo ciático devido à recuperação funcional limitada. Portanto, este protocolo é pensado para ajudar pesquisadores interessados em lesões nervosas periféricas e centrais a avaliar a recuperação funcional em modelos de roedores.

12 ratos foram submetidos a cirurgia nervosa periférica experimental. A ressecção do nervo ciático(Figura 2A) foi realizada em 7 ratos, enquanto a neurotmese do nervo femoral(Figura 2B) foi induzida em 5 ratos. Em todos os animais, o defeito nervoso foi reconstruído por meio de um enxerto nervoso autólogo. Lesão por contusão medular(Figura 2C) no nível Th11 foi induzida em 6 ratos, resultando em um total de 18 ratos.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig02.jpg"> Figura 2: Locais operacionais após a reconstrução nervosa. Reconstrução nervosa com autoenxertos no nervo ciático(A) e nervo femoral(B)bem como após lesão de contusão medular(C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Todos os animais se recuperaram bem da cirurgia e não houve casos de automutilação. Um animal do grupo de lesão do nervo ciático desenvolveu fortes contraturas da pata traseira direita durante o período de observação pós-operatória e teve que ser excluído da análise de dados posteriores.
Neurotmese do nervo ciático Uma vez que o nervo ciático fornece inervação muscular e sensorial para a maioria da plataforma traseira, sua ressecção resulta em um grave comprometimento da função locomotor. Após a lesão, os ratos usam o calcanhar da pata apenas para suporte de peso(Figura 3B-E) e o membro é movido em um movimento circundutor varrendo. Portanto, as alterações locomotorizadas via AGA tornam-se aparentes por meio de uma área de impressão significativamente reduzida (Figura 4A) e significativamente aumentadas do Swing Time(Figura 4B). Ambos os parâmetros ainda foram significativamente alterados em comparação com as medições pré-OP como no final do período de observação. Notável, um animal desenvolveu fortes contraturas da pata traseira direita a partir da semana pós-operatória (WPO) 10. Isso resultou em um aumento da Área de Impressão da pata traseira direita para mais de 150% em comparação com a pata esquerda em WPO12(Figura 5). Por se trata de um extremo em comparação com todos os outros animais avaliados neste estudo, excluímos este animal da análise de dados em relação à Área Impressa.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig03.jpg"> Figura 3: Impressões representativas da pata antes e seguindo a ressecção de tamanho crítico do nervo ciático direito e reparo do autoenxerto. Note-se a forte diminuição na Área de Impressão após lesão nervosa(B)em relação ao pré-operatório(A). Apesar de um leve incremento na Área de Impressão durante o período de observação (C-E) as impressões da pata do membro traseiro direito permaneceram notavelmente alteradas das gravações da linha de base. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig04.jpg"> Figura 4: O curso de recuperação funcional após ressecção de tamanho crítico e reparo de autoenxerto do nervo ciático. A razão da área de impressão (A) e a Razão de Tempo de Oscilação(B)foram mudadas estatisticamente significativamente dos valores pré-OP imediatamente após a ressecção do nervo ciático. Embora a Área de Impressão tenha permanecido significativamente reduzida em comparação com a linha de base até wpo10, o Swing Time ainda foi significativamente aumentado para os valores pré-OP no WPO12. *: p &lt; 0,05 em relação ao Pré-OP, **: p &lt; 0,01 em relação ao Pré-OP. As barras de erro indicam ± erro padrão da média (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig05.jpg"> Figura 5: Boxplot do curso de Área de Impressão após lesão do nervo ciático. Note o extremo (elipse vermelha) no WPO12, o que é explicado pelo fato de que um animal desenvolveu fortes contraturas da pata traseira direita a partir de WPO10. O animal foi, portanto, excluído da análise estatística apresentada na Figura 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Neurotmese do nervo femoral A ressecção do nervo femoral resulta na denervação do músculo quadríceps da coxa33,34. Em consequência, a extensão do joelho é prejudicada, resultando em hiperflexão da articulação do tornozelo com elevação consecutiva do calcanhar da pata. Portanto, a respectiva Área de Impressão da pata (Figura 6B), é fortemente reduzida após a cirurgia. A área de impressão da pata traseira esquerda é aumentada devido a uma mudança compensatória de peso para a esquerda. Isso deve ser mantido em mente, pois este fenômeno influencia diretamente a razão calculada entre a pata "experimental" e o "controle". A partir da reinervação do quadríceps WPO4 pelo nervo femoral regenerador leva à reversão dessas alterações, resultando no aumento da Área de Impressão da Pata da pata traseira direita(Figura 7A). Como o músculo quadríceps da coxa também desempenha um papel na fase de oscilação da respectiva pata, Swing Time (Figura 7B) é muito prolongado em ratos com lesão do nervo femoral. Espelhando o retorno da Área de Impressão, swing time diminui à medida que o nervo femoral regenerador atinge o músculo quadríceps da coxa. No WPO10, ambos os parâmetros da marcha voltaram à linha de base, sinalizando recuperação funcional completa.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig06.jpg"> Figura 6: Impressões de pata representativas. Impressões representativas da pata antes de (A) e seguinte(B-E) direita ressecção do nervo femoral e reparo de autoenxerto. A área de impressão de RH diminuiu fortemente no WPO2 (B),enquanto um aumento na Área de Impressão da pata traseira esquerda (LH) devido ao aumento da carga de peso tornou-se visível. A área de impressão rh começou a aumentar a partir de WPO6 (C) acompanhada por uma diminuição na área de impressão do LH. No WPO8(D) e WPO10(E) Área de Impressão de RH recuperou-se perto dos níveis pré-operatórios. (Adaptado com permissão da Heinzel et al.22, licenciado sob CC BY 4.0.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig07.jpg"> Figura 7: O curso de recuperação funcional após ressecção de 7 mm e reparo de autoenxerto do nervo femoral. O curso de Taxa de Área de Impressão (A) e Swing Time Ratio(B) revelou uma forte mudança imediatamente após a ressecção do nervo femoral, mas os valores se recuperaram de volta aos valores pré-operatórios no WPO8. #: p &lt; 0,05. As barras de erro indicam ± SEM. (Adaptado com permissão da Heinzel et al.22, licenciado sob CC BY 4.0.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Contusão medular A análise da marcha revelou impressões de patas marcadamente alteradas após lesão de contusão na medula espinhal torácica(Figura 8),mais notável um decréscito na Área de Impressão e uma rotação interna marcada das patas traseiras no WPO2(Figura 8B). Vale ressaltar que a rotação da pata também é implementada como recurso de avaliação no BBB, ressaltando a aplicabilidade da análise informatizada da marcha para avaliar as alterações da marcha que foram originalmente avaliadas com testes de Campo Aberto. Quanto ao curso dos parâmetros individuais da marcha, a contusão da medula espinhal no nível de11 de dezembro resultou em diminuição da Relação de Área de Impressão (Figura 9A) e incremento da Razão de Tempo de Oscilação(Figura 9B). Ambos os parâmetros tendência para níveis de linha de base durante o curso posterior do período de observação, mas não houve alterações estatisticamente significativas observáveis. O Índice de Regularidade do parâmetro relacionado à coordenação (Figura 9C) também diminuiu no WPO2, mas o grau variou muito entre os animais. Também se voltou para valores pré-operatórios até wpo16. Base de Apoio das patas traseiras(Figura 9D),parâmetro geral de marcha segundo Deumens, mostrou um aumento acentuado, que foi estatisticamente significativo de WPO10 até WPO14. Ele tendênciau para os níveis de linha de base no WPO16 e não foi mais significativamente alterado a partir do valor Pré-OP neste momento.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig08.jpg"> Figura 8: Impressões de pata representativas das duas patas traseiras. A pata imprime no pré-operatório(A)e segue lesão de contusão na medula espinhal torácica(B-F). Observe a redução na área de impressão a partir de WPO2 (B) acompanhada de uma notável rotação interna das patas. Durante o período de observação (C–F) um incremento da Área de Impressão é observável, bem como o desobstrução da rotação interna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61852/61852fig09.jpg"> Figura 9: Contusão medular no nível th 11. A contusão da medula espinhal no dia 11 de dezembro resultou em alterações observáveis da Relação de Área de Impressão (A) e Tempo de Oscilação(B) e do Índice de Regularidade(C),mas essas alterações não foram estatisticamente significativas. Após a lesão, base de apoio das patas traseiras mostrou um aumento acentuado em relação à linha de base, o que foi estatisticamente significativo no WPO10 até WPO14. *: p &lt; 0,05 em relação ao Pré-OP. As barras de erro indicam ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61852/61852fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo complementar 1: Detalhes de solução de problemas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61852/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

A análise automatizada da marcha é uma ferramenta viável para avaliar a recuperação funcional em modelos de roedores de lesão nervosa periférica e lesão de contusão medular. Embora exija apenas uma configuração para avaliar a função locomotor em vários modelos experimentais, o ajuste meticuloso e macio e o treinamento dos animais é altamente importante.

Análise automatizada da marcha para avaliar a recuperação funcional em roedores com lesão de contusão do nervo periférico ou da medula espinhal

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...

A análise automatizada da marcha é um método amplamente utilizado para avaliar modelos de matrícula de recuperação funcional de lesão, reparo e regeneração do nervo periférico. O método pode ser usado para estudar alterações na marcha após lesão nervosa periférica, relacionando-se tanto à função motora quanto sensorial do nervo. Pesquisadores novos no método podem ter dificuldades na aquisição de dados de alta qualidade.Obstáculos típicos são treinamento animal adequado e calibração precisa de hardware e software. Durante as sessões de treinamento e no dia do teste, desligue todas as fontes de luz na sala de teste comportamental e enfrente a tela do computador para aquisição de dados longe da câmera para evitar que sua luz interfira com a câmera. Confirme que o dispositivo está instalado em posição estável de forma a evitar qualquer forma de vibração, e leve os ratos para a sala de teste comportamental em sua própria gaiola doméstica por pelo menos 30 minutos antes do teste, No primeiro dia de treinamento, segure suavemente um animal sob seu tronco e coloque-o cuidadosamente na entrada da passarela.Deixe o rato explorar a abertura do corredor sem qualquer interferência, e esperar até que o animal cruze voluntariamente a passarela para chegar à sua gaiola sem qualquer estímulo externo ou motivação. No segundo dia de treinamento, permitem que os animais se acostumem a entrar na passarela e voltar para sua gaiola sem hesitação. No terceiro dia de treinamento, confirme que os animais aprenderam a atravessar a passarela a uma velocidade uniforme sem hesitação, cheiro ou outros movimentos exploratórios.Na quarta e quinta, repita o treinamento para reforçar o procedimento de teste. No dia do experimento, use limpador de vidro comercial e um rodo para limpar a parte superior e inferior da passarela, tomando o cuidado de remover todo o fluido das extremidades da passarela. Coloque os ratos mais leves e pesados na passarela e selecione uma câmera registrada na aba de configuração para permitir que o ganho da câmera, luz vermelha do teto, luz verde da passarela e limiar de intensidade verde sejam ajustados para garantir uma detecção ideal de impressão da pata para todos os animais na análise.Em seguida, clique em abrir a aquisição e adquirir um instantâneo da passarela limpa vazia para ser usada como referência durante todo o procedimento de aquisição de dados. O status mudará de esperar por instantâneo para pronto para aquisição. Clique em iniciar a aquisição.O status mudará de pronto para aquisição para esperar a corrida começar. Quando a câmera estiver pronta, coloque um rato na passarela e siga o movimento do animal na tela do computador. Note, a mudança de status de esperar a execução para começar a gravar executada.No final da análise, clique em classificar na guia explorador experimental do ensaio a ser classificado e reproduza a execução adquirida em velocidade normal para determinar se os dados estão em conformidade com os requisitos de classificação. Clique em classificar automaticamente para classificação automática das impressões da pata pelo software. Para o cálculo correto dos padrões normais de sequência de passos, certifique-se de que o algoritmo de classificação não seja confundido por impressões de pata não visíveis, levando a NSSP falho, e que apenas impressões de patas que são detectáveis enquanto a pata contralateral também é visível para cálculos NSSP estão incluídas.Para análise estatística dos dados, clique em exibir estatísticas para obter uma visão geral abrangente das estatísticas de execução. Em seguida, selecione arquivo e exportação, para exportar as estatísticas de execução ou teste em um software de planilha. Após lesão no nervo ciático, os ratos usam o calcanhar da pata apenas para suporte de peso e o membro é movido em um movimento circundutor varrendo.Portanto, as alterações locomotorizadas através da análise de marcha automatizada tornam-se aparentes por uma área de impressão significativamente reduzida e um tempo de oscilação significativamente aumentado. A ressecção do nervo femoral resulta na denervação do músculo quadríceps da coxa, prejudicando a extensão do joelho e induzindo a hiperflexão da articulação do tornozelo com elevação consecutiva do calcanhar correspondente. A partir da quarta semana pós-operatória, a reenervação do quadríceps pelo nervo femoral regenerador leva à reversão dessas alterações.Como o músculo quadríceps da coxa também desempenha um papel na fase de oscilação da respectiva pata, o tempo de oscilação é muito prolongado em ratos com lesão no nervo femoral. A análise da marcha revela impressões de patas marcadamente alteradas após contusão na medula espinhal torácica. A contusão medular no nível torácico 11 também resulta em uma diminuição da razão da área de impressão, um incremento da razão de tempo de oscilação.O índice de regularidade relacionado à coordenação também diminui na segunda semana pós-operatória, enquanto a base de apoio das patas traseiras apresenta um aumento acentuado. Ao usar a análise automatizada do portão para avaliar a recuperação funcional em roedores, certifique-se de treinar cuidadosamente os animais e ser meticuloso ao fazer qualquer ajuste de software ou hardware. Utilizando-se análise automatizada da marcha, a lesão e a regeneração do sistema nervoso central e periférico podem ser avaliadas em vários modelos de roedores, incluindo modelos de nervo formal ainda não estudados, como o nervo mediano.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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A avaliação da recuperação motora continua sendo a medida de desfecho de referência em estudos experimentais de nervos periféricos. A medição da força tetanica isométrica do músculo tibialis anterior no rato é uma ferramenta inestimável para avaliar os resultados funcionais após a reconstrução de defeitos do nervo ciático. Os métodos e nuances estão detalhados neste artigo.

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Fornecemos um protocolo para a avaliação do comportamento motor através de uma bateria de teste comportamental em ratos após lesão de esmagamento do nervo ciático.

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Um pipeline experimental para descrever quantitativamente o padrão locomotor de camundongos que caminham livremente usando a caixa de ferramentas MouseWalker (MW) é fornecido, variando de gravações de vídeo iniciais e rastreamento até análise pós-quantificação. Um modelo de lesão por contusão medular em camundongos é empregado para demonstrar a utilidade do sistema MW.

Uso do MouseWalker para Quantificar a Disfunção Locomotora em um Modelo de Lesão Medular em Camundongos

Aprenda análise automatizada da marcha para avaliar recuperação funcional em roedores com lesões de nervo periférico ou medula espinhal. Este método permite examinar alterações locomotoras pós-lesão.

Análise automatizada da marcha para avaliar a recuperação funcional em roedores com lesão de contusão do nervo periférico ou da medula espinhal (Vídeo) | JoVE Journal

Análise automatizada da marcha para avaliar a recuperação funcional em roedores com lesão de contusão do nervo periférico ou da medula espinhal

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