Name: Descelularização do Complexo Cardiopulmonar Murine (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprenda a descelularização do complexo cardiopulmonar murino para criar arcabouços de matriz extracelular. Este método preserva a integridade estrutural para análises bioquímicas e anatômicas detalhadas.

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Agradecemos à Profª Ivana Novak e à Dra. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Europeu de Pesquisa (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR e JTE); bolsa de doutorado da Fundação Lundbeck (R286-2018-621; MR); o Conselho Sueco de Pesquisa (2017-03389; MDL); a Sociedade Sueca de Câncer, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj e 190007; MDL); Ajuda ao câncer alemão (Deutsche Krebshilfe; RR); e a Sociedade Dinamarquesa de Câncer (R204-A12454; RR).

Todos os procedimentos aqui incluídos foram revisados e aprovados pelo comitê de ética que regula a medicina experimental na Universidade de Copenhague e concordam com a legislação dinamarquesa e europeia. Para demonstrar este protocolo, usamos camundongos BALB/cJ fêmeas de 8-12 semanas de idade e um rato fêmea MMTV-PyMT de 11 semanas de idade.
NOTA: Evitar a contaminação bacteriana do andaime ECM descelularizado dá o melhor resultado de imagem e permite o armazenamento de amostras a longo prazo. Por isso, é importante manter todos os passos estéreis. Assim, todos os instrumentos e materiais cirúrgicos, incluindo sutura, microssutura, soluções, tubos, conectores Luer e cateteres, devem ser estéreis. As superfícies, incluindo uma bandeja de poliestireno, devem ser desinfetadas com 70% de etanol, e a perfusão deve ser realizada preferencialmente sob uma coifa de fluxo laminar. Todos os procedimentos ocorrem à temperatura ambiente, a menos que seja indicado de outra forma.
1. Microcirurgia pós-morte
<ol><li>Eutanize o rato usando uma câmara de CO2 .<ol>
<li>Coloque o mouse em uma câmara de 4 L, e comece a encher com 100% de CO2, começando em 0,2 L/min por 2 min, aumentando até atingir um fluxo de 0,8 L/min após 3 min. O rato deve cair inconsciente durante os primeiros 2 minutos, e então a respiração deve cessar (geralmente em torno de 5 minutos, mas o fluxo pode ser mantido conforme necessário). Confirme a morte antes de prosseguir para o próximo passo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raspe o tórax, o abdômen e a parte de trás do rato com o cortador de cabelo e desinfete com 70% de etanol. A depilação reduz consideravelmente o número de artefatos devido à presença de cabelos em amostras para análise de imagem ou bioquímica.</li>
	<li>Fixe o mouse em uma bandeja de poliestireno, estendendo seus dentes e traseiros, bem como sua cabeça e cauda. Coloque-o sob o microscópio de microcirurgia.</li>
	<li>O uso de uma tesoura de padrão reto mayo estabelece o acesso cirúrgico com uma incisão cutânea que vai da região submandibular até o abdômen inferior e disseco subcutânea para expor a parede torácica e o peritônio.</li>
	<li>Usando tesoura microcirúrgica, corte os músculos peitoralis maiores e peitoral ao longo do sexto espaço intercostal em ambos os lados da parede torácica.</li>
	<li>Usando uma tesoura de padrão reto, corte o esterno ao longo das incisões anteriores e, em seguida, complete uma esterno cortando o esterno ao longo de seu eixo longo, em seguida, eleve e fixe ambos os lados da parede torácica para expor o complexo cardiopulmonar.</li>
	<li>Usando micro-fórceps de ponta redonda (ou micro-fórceps Dumont), extirpo o timo e o tecido adiposo circundante, retirando-os delicadamente de seus acessórios. Isso revelará as principais naves.</li>
	<li>Usando o cautery, cauterize a veia cava descendente e, usando uma tesoura de padrão reto, corte o esôfago.</li>
	<li>Usando micro-fórceps afiados, separe as veias braquiocefálicas e as braquiocefálicas, deixaram as artérias subcláusicas comuns e esquerda do tecido subjacente para facilitar a ligadura e a cauterização.</li>
	<li>Utilizando suporte de micropeça, micro-fórceps afiados e pontos de sutura 9-0 acima do surgimento do braquiocefálico, deixado carótida comum e artérias subclávias esquerdas.</li>
	<li>Cauterize as veias braquiocefálicas.</li>
	<li>Separe as glândulas salivares submandibulares ao longo da linha média para expor os músculos do pescoço e a traqueia. Separe os músculos para expor o ligamento cricothiroide. Usando micro-tesoura, abra uma entrada seccionando o ligamento.</li>
	<li>Introduza um cateter de 27 G na traqueia e empurre delicadamente até que a traqueia se esque no brônquio (ou seja, até que a resistência ao cateter seja atendida, depois retire 3 mm). Tenha cuidado para não interromper os brônquios. Usando uma sutura 6-0, coloque 3 pontos ao redor da traqueia para fixar o cateter.</li>
	<li>Seção o rato na altura da 12ª vértebra torácica. A aorta descendente corre anteriormente até a coluna vertebral e deve ser seccionada aqui junto com a coluna. Desmonte a metade inferior.</li>
	<li>Cateterize retrógradamente a aorta e empurre o cateterismo até atingir o arco aórtico. Com sutura 9-0, coloque 4 pontos ao redor da aorta, começando 5 mm abaixo da ponta do cateter.</li>
</ol>2. Descelularização
<ol><li>Conecte o mouse a um sistema de bomba usando tubos de silicone e conectores Luer. Perfuuse com água deionizada a 200 μL/min por 15 min. Mantenha essa taxa de fluxo durante a descelularização.</li>
	<li>Mude o agente de perfusão para 0,5% de desoxicolato de sódio (DOC) diluído em água deionizada e perfuuse durante a noite.</li>
	<li>Mude o agente de perfusão para sulfato de dodecyl de sódio de 0,1% de sódio (SDS) diluído em água desionizada e perfuuse por 8 horas.</li>
	<li>Perfume com água desionizada durante a noite para lavar SDS e DOC por 24 horas.</li>
	<li>Ressecize o coração e os pulmões descelularizados, seccionando seus acessórios ao tórax usando uma tesoura curvada e armazenar em um tubo criogênico estéril com água desionizada com penicilina-estreptomicina de 1% (v/v) e 0,3 μM de azida de sódio a 4 °C. Os andaimes ECM podem ser armazenados por pelo menos por pelo menos 12 semanas1. Se o andaime for usado para análise bioquímica (por exemplo, espectrometria de massa), estote o congelamento em nitrogênio líquido.</li>
</ol>3. Imunostaining
<ol><li>Planeje a imagem: determinar anticorpos primários (ou anticorpos) e a combinação de anticorpos secundários fluorescentes conjugados para combinar uns com os outros e para se encaixar nas linhas laser do microscópio de fluorescência.</li>
	<li>Bloqueie a amostra imergindo-a em um criobotube contendo 6% (v/v) soro de burro - 3% (w/v) albumina de soro bovino (BSA) durante a noite.</li>
	<li>Incubar com anticorpos primários (ou anticorpos) em 3% de soro de burro em PBS por 24 h.</li>
	<li>Lave 5 vezes por 1h cada vez em 0,05% entre 20 em PBS (PBST).</li>
	<li>Incubar a amostra com anticorpo secundário fluorescente conjugado (ou anticorpos) em 3% de soro de burro em PBS por 24 h.</li>
	<li>Lave 5 vezes por 1 hora em 0,05% (PBST). Aguarde 1h entre cada lavagem.</li>
	<li>Adicione água deionizada e armazene a 4 °C de distância da luz direta. Neste ponto, o andaime está pronto para a imagem.</li>
</ol>4. Imagem
<ol><li>Coloque a amostra em um prato com fundo de vidro e umidize-a com duas gotículas de solução de armazenamento (PBS ou água deionizada).</li>
	<li>Prepare o objetivo. Recomendamos o uso de um objetivo de imersão em água.</li>
	<li>Inspecione a amostra usando luz de fluorescência.</li>
	<li>Mude para controle de computador. Ligue lasers e ajuste a intensidade do laser, abertura do pinhole, detectores de comprimentos de onda, ganho, resolução e zoom. Defina o número e o tamanho do passo para z-stack e comece a aquisição. Recomendamos o uso de excitação a laser multifotônio para aumentar a penetração tecidual e minimizar a dispersão de luz, branqueamento e danos teciduais.</li>
</ol>5. Mancha de hematoxilina-eosina
<ol><li>Exciso 1 lobo pulmonar de um rato eutanizado.</li>
	<li>Coloque em um criomold de 10 mm x 10 mm x 5 mm e cubra-o com aproximadamente 500 μL de composto OCT.</li>
	<li>Congele em gelo seco (-70 °C) e mantenha a amostra a essa temperatura.</li>
	<li>Exciso um lobo pulmonar descelularizado de um rato processado de acordo com a etapa 2.5.</li>
	<li>Coloque em um criomold com a maior área de superfície para baixo e cubra-a com composto OCT conforme especificado na etapa 5.2.</li>
	<li>Congele em gelo seco (-70°C) e mantenha a amostra a essa temperatura até que seja necessário. A amostra pode ser armazenada por pelo menos 12 semanas.</li>
	<li>Seção blocos de tecido congelado a -20 °C em um criostat com 5 μm de espessura e coloque seções em lâminas de vidro adesivos e armazene a -80 °C.</li>
	<li>Leve os slides à temperatura ambiente até que o ar seque (aproximadamente 20 min).</li>
	<li>Logo mergulhe no PBS e fixe imergindo os slides em 4% de paraformaldeído em PBS por 15 minutos. Lave uma vez na PBS por 5 minutos, depois duas em água destilada por 5 minutos.</li>
	<li>Mergulhe na solução de hematoxilina de Mayer por 10 minutos. Este tempo pode ser otimizado de acordo com a origem do tecido e preparação de manchas.</li>
	<li>Lave em um frasco de Coplin sob água destilada por 10 minutos.</li>
	<li>Mergulhe na solução de eosin por 7 min. Este tempo pode ser otimizado de acordo com a origem do tecido e preparação de manchas.</li>
	<li>Queda de 50% de etanol para remover o excesso de Eosin e desidratar em pouco tempo em 70% de etanol, e em 96% e 100% etanol por 30 segundos. Mergulhe em xileno várias vezes.</li>
	<li>Aplique algumas gotas de meio de montagem DPX e coloque uma mancha de tampa de vidro.</li>
	<li>Deixe os slides secar durante a noite sob um capô químico.</li>
	<li>Digitalize slides em um scanner de slides.</li>
</ol>

<ol><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix%3A+not+just+pretty+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISDoT%3A+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li>
<li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process%3A+A+TOF-sims+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Técnicas de descelularização baseadas na agitação tecidual alteram a estrutura do ECM, tornando-as inadequadas para análise da estrutura do ECM4. A descelularização da perfusão, utilizando uma rota anatômica como a aorta da traqueia, permite chegar ao leito capilar, ou alvéolo terminal, e facilita a entrega de agentes descelularizantes em todo o órgão. O uso de detergentes zwitterionic, aniônicos e não iônicos para descelularizar tecidos é relatado4,5,6, no entanto, sulfato de dodecílio de sódio (...

O ECM é uma rede tridimensional feita de proteínas e glicanos que acomoda todas as células em um organismo multicelular, dando aos órgãos sua forma e regulando o comportamento celular ao longo da vida1. A partir da fertilização dos óvulos em diante, as células constroem e remodelam o ECM, e por sua vez são estritamente controladas por ele. O objetivo deste protocolo é abrir uma maneira de analisar e mapear o ECM do rato, já que os camundongos são o organismo modelo mais utilizado na fisiopatologia mamífera.
O desenvolvimento deste método foi impulsionado pela necessidade de caracterizar e isolar o ECM2 nativo associado à metástase. Como os tumores não possuem vascularização anatômica adequada e os camundongos são organismos relativamente pequenos, procedimentos microcirúrgicos foram projetados para cateterizar retrogrademente a aorta, isolando a circulação do vaso principal que leva a um tumor (por exemplo, as veias pulmonares), focando assim o fluxo de reagentes e permitindo a descelularização tumoral. Este método produz andaimes ECM com uma estrutura conservada2 que podem ser imunossuídas e imagens, permitindo o mapeamento da estrutura ECM em detalhes de submicron. Para realizar esse protocolo, é necessário adquirir habilidades cirúrgicas e microcirúrgicas (dissecção, microsutura e cateterismo) que possam representar uma potencial limitação ao seu uso. Para nosso conhecimento, este método representa o estado da arte para análise de imagem de estrutura ecm nativa2,3.

<table><tbody><tr><td>MICROSURGERY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 sutura, agulha de seção triangular (Vicryl)</td><td>Ethicon</td><td>6301124</td><td></td></tr><tr><td>9-0 micro-sutura (Safil)</td><td>B Braun</td><td>G1048611</td><td></td></tr><tr><td>Adson pinça</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Adson pinça com dentes</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Porta-microagulhas Castroviejo</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>nº 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>CO2 câmara de ventilação para eutanásia de camundongo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água deionizada (Milli-Q IQ 7000, sistema de água de laboratório ultrapuro)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja descartável de poliestireno (~30 &vezes; 50 cm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecção (Greenough, com pescoço de ganso de dois braços)</td><td>Leica</td><td>S6 D</td><td></td></tr><tr><td>Microespátula de ponta dupla</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>Micropinças Dumont (duas)</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Micropinça Dumont com 45&deg; pontas (duas)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Máquinas de cortar cabelo</td><td>Oster</td><td>76998-320-051</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulha Halsey (com mandíbulas de carboneto de tungstênio)</td><td>Fine Science Tools</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Cateter intravenoso de calibre 24 (Insyte)</td><td>BD</td><td>381512</td><td></td></tr><tr><td>Cateter intravenoso de calibre 26 (Terumo)</td><td>Surflo-W</td><td>SR+DM2619WX</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Mayo (corte duro, reto)</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14110-15</td><td></td></tr><tr><td>Microfórceps com pontas aneladas (duas)</td><td>Aesculap</td><td>FM571R</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de micro-mola (Vannas, curvada)</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>15001-08</td><td></td></tr><tr><td>Minicutter</td><td>KLS Martin</td><td>80-008-03-04</td><td></td></tr><tr><td>Molt Periostotome</td><td>Aesculap</td><td>D0543R</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas (calibre 27; Microlance)</td><td>BD</td><td>21018</td><td></td></tr><tr><td>Toalha de papel (estéril) ou guardanapo cirúrgico&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura serrilhada (CeramaCut, reta)</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Espátula (Freer-Yasargil)</td><td>Seringas Aesculap</td><td>OL166R</td><td></td></tr><tr><td>(1 mL; Seringas</td> <td>de 3021001</td><td></td> <td>Plastipak)BD</td></tr><tr><td>(10 mL; Plastipak)</td> <td>BD</td><td>3021110</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de tendão (Walton)</td> <td>Ferramentas de ciências finas</td><td>14077-09</td><td></td></tr> <tr><td>< forte > IMUNOCOLORAÇÃO < / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Alexa Fluor 488 burro anti-cobaia IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 burro anti-coelho IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumina bovina fração V, grau padrão, liofilizado)&nbsp;</td><td>Serva</td><td>11930.03</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal de colágeno IV (RRID: AB_2276457)&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>AB756P</td><td>Hospedeiro:</td></tr><tr><td>coelho PBS (pH 7,4, 10&vezes;, Gibco)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td>Anfitrião: anticorpo</td></tr><tr><td>policlonal de periostina de cabra (um gentil presente de Manuel Koch. RRID:AB2801621)</td><td></td><td></td><td>Hospedeiro: porquinho-da-índia</td></tr><tr><td>Bisturi descartável com lâmina nº 11 (pcs. 10)</td><td>VWR</td><td>233-5364)</td><td></td></tr><tr><td>Soro (soro de burro normal)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><<tr><td>strong>IMAGING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Detectores (detector híbrido (Leica, modelo HyD S) e tubos fotomultiplicadores (PMTs; )&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Fonte de luz fluorescente&nbsp;</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Microscópio (microscópio multifóton invertido)&nbsp;</td><td>Leica</td><td>SP5-X MP</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Objetiva (azul lambda, 20 vezes;, abertura numérica de 0,70 (NA) IMM UV)&nbsp;</td><td>Leica</td><td>HCX PL APO</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Duas fotos Ti&ndash; laser de safira (Spectra-physics, modelo Mai Tai DeepSee)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Laser de luz branca (WLL)&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>DESCELULARIZAÇÃO</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol (álcool absoluto 99,9%); o álcool absoluto deve ser ajustado para 70% (vol/vol) usando água deionizada&nbsp;</td><td>Ameixa</td><td>1680766</td><td></td></tr><tr><td>Água deionizada (Milli-Q IQ 7000, sistema de água de laboratório ultrapuro)&nbsp;</td><td>Conexões</td> masculinas de Luer <td>para tubulação Merck ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>(1/8 polegada)</td><td>World Precision Instruments</td><td>13158-100</td><td></td></tr><tr><td>PBS (pH 7.4, 10&vezes;, Gibco)&nbsp;</td>Bomba peristáltica <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>(com 12 canais)</td> <td>Ole Dich</td><td>110AC(R)20G75</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicone (com 2 mm de diâmetro interno e 4 mm de diâmetro externo)</td><td>Ole Dich</td><td>31399</td><td></td></tr><tr><td>Azida de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08591-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de Sódio (DOC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato</td> de <td>Sódio Sigma-Aldrich</td><td>L3771-500G</td><td></td></tr><tr><td>H& E COLORAÇÃO</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>15434389</td><td></td></tr><tr><td>96% Etanol</td><td>Ameixa</td><td>201446-5L</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Ameixa</td><td>201152-1L</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas (24x50mm; 1000 pcs)</td><td>Hounisen</td><td>422.245</td><td></td></tr><tr><td>Criomoldes Intermediários (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DPX meio de montagem</td><td>Hounisen</td><td>1001.0025</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y solução alcoólica 0.5%</td><td>Sigma</td><td>1024390500</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de micrótomo de penas de aço inoxidável,C35 (50 pcs)</td><td>Pfm medical</td><td>207500003</td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td>6319483</tr><tr><td>Mayers hematoxilina</td><td>Sigma</td><td>MHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>OCT composto</td><td>VWR</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Scanner de slides (Nanozoomer)</td> <td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>534056-4L</td><td></td></tr></tbody></table>

descelularização do complexo cardiopulmonar murine

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

Apresentamos aqui um protocolo de descelularização para coração e pulmões de rato. Produz andaimes estruturais de ECM que podem ser usados para analisar topologia e composição de ECM. Baseia-se em um procedimento microcirúrgico projetado para cateterizar a traqueia e a aorta de um rato eutanizado para perfundir o coração e os pulmões com agentes descelularizantes. O complexo cardiopulmonar descelularizado pode, posteriormente, ser imunossuperado para revelar a localização de proteínas estruturais de ECM. Todo o procedimento pode ser concluído em 4 dias.
Os andaimes ECM resultantes deste protocolo estão livres de distorções dimensionais. A ausência de células permite o exame estrutural das estruturas de ECM até a resolução de submicron em 3D. Este protocolo pode ser aplicado a tecidos saudáveis e doentes de camundongos com até 4 semanas de idade, incluindo modelos de camundongos de fibrose e câncer, abrindo caminho para determinar a remodelação do ECM associada à doença cardiopulmonar.

Descelularização cardiopulmonar Após a conclusão do protocolo com sucesso, o coração e os pulmões, bem como o tecido anexo, como o arco aórtico, estarão livres de células. A descelularização pode ser validada pela coloração de hematoxilina-eosina (Figura 1) dos andaimes ECM mostrando a remoção dos núcleos comparando com o tecido nativo. Estes andaimes retêm as dimensões de órgãos frescos e sua estrutura ECM insolúvel está <sup class="xref"...

Este protocolo visa descelularizar o coração e os pulmões dos ratos. Os andaimes de matriz extracelular resultante (ECM) podem ser imunossuados e imagens para mapear a localização e topologia de seus componentes.

Descelularização do Complexo Cardiopulmonar Murine

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

Este protocolo é a porta de entrada para a matriz extracelular. É a complexidade e sua estrutura até a escala de sub-micron. Assim, a principal vantagem deste método é que ele possibilita a obtenção de uma matriz extracelular que mantenha sua integridade estrutural, abrindo assim o caminho para a análise bioquímica e anatômica.Demonstrando o procedimento serão, Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten e Maria Rafaeva, atualmente em meu laboratório e Chris Madsen e que estava em meu laboratório e continuou o trabalho na Universidade de Lund. Comece raspando o tórax, abdômen e parte de trás do rato eutanizado com um cortador de cabelo. Desinfetar a área com 70% de etanol.Em seguida, fixe o mouse em uma bandeja de poliestireno, estendendo seus quatro membros traseiros finais, bem como sua cabeça e cauda. Coloque-o sob o microscópio de microcirurgia. Usando uma tesoura de padrão reto mayo, faça uma incisão cutânea que vai da região sub mandibular até o abdômen inferior e disseque subcutânea para expor a parede torácica e o peritônio.Em seguida, use uma tesoura microcirúrgica para cortar os músculos peitoralis maiores e peitoral ao longo do sexto espaço intercostal em ambos os lados da parede torácica. Corte o esterno ao longo das incisões anteriores com uma tesoura de padrão reto. Em seguida, complete uma esternotomia cortando o esterno ao longo de seu longo eixo.Elevar e fixar, ambos os lados da parede torácica para expor o complexo cardiopulmonar. Use micro fórceps redondos para extirpor o timo e o tecido adiposo circundante, retirando-os delicadamente de seus acessórios. E corte o esôfago com micro tesoura.Separe as veias braquiocelicas e a artéria braquiocefálica com micro fórceps afiados. Em seguida, separe as artérias subcláusicas comuns e esquerdas esquerdas do tecido subjacente para facilitar a ligadura e a cauterização. Use um suporte de microagulha e micro fórceps afiados e uma sutura de nove oh para colocar pontos acima do surgimento do braquiocefálico esquerdo comum e artérias subclávias esquerdas, cauterizar as veias braquiocefálicas.Usando micro tesoura, abra uma entrada seccionando o ligamento. Introduza um cateter de calibre 27 na traqueia e empurre delicadamente até que a traqueia se esvai nos brônquios, tomando cuidado para não interromper os brônquios. Usando uma sutura de seis O, coloque três pontos ao redor da traqueia para fixar o cateter.Seção o rato na altura da 12ª vértebra torácica, a aorta descendente corre anteriormente para a coluna vertebral e deve ser seccionada aqui junto com a coluna vertebral. Cateterize retrógradamente a Aorta e empurre o cateterismo até atingir o arco aórtico. Usando uma sutura, coloque quatro pontos ao redor da Aorta, começando cinco milímetros abaixo da ponta do cateter.Conecte o mouse a um sistema de bomba usando tubos de silicone e conectores inferiores. Perfum com água desionizada a 200 microliters por minuto durante 15 minutos. Em seguida, mude o agente de perfusão para 0,5% DOC, diluído em água deionizada e perfuuse durante a noite.No dia seguinte, mude o agente de perfusão para 0,1%SDS diluído em água deionizada, e perfuuse por oito horas. Em seguida, perfuse com água deionizada por 24 horas para lavar o SDS e DOC. Ressectar o coração e pulmões descelularizados, seccionando seus anexos ao tórax.Armazene o tecido em um tubo criogênico estéril em água deionizada com estreptomicina de penicilina de 1% e 0,3 azida de sódio micromolar a quatro graus Celsius. Para realizar a coloração imuno, bloqueie a amostra incubando-a em um tubo criogênico contendo 6% de soro de burro e 3% de BSA durante a noite. Em seguida, incubar com anticorpo primário em 3% de soro de burro na PBS por 24 horas.Após a incubação lave a amostra cinco vezes em PBST durante uma hora por lavagem. Incubar a amostra com anticorpo secundário conjugado fluorescente em soro de burro de 3% em PBS por 24 horas. Em seguida, repita as lavagens em PBST.Adicione a água ionizada e armazene a amostra a quatro graus Celsius longe da luz direta. Para imaginar a amostra, coloque-a em um prato de fundo de vidro e umidifice-a com duas gotículas de solução de armazenamento. Defina o objetivo e inspecione a amostra usando luz de fluorescência.Mude para o controle do computador, ligue lasers e ajuste a intensidade do laser, abertura do pinhole, detectores de comprimento de onda, ganho, resolução e zoom. Defina o número e o tamanho do passo para a pilha Z e comece a aquisição. Extirbe um lobo pulmonar de um rato eutanizado e coloque-o em um molde criogeno de 10 por 10 por cinco milímetros.Cubra-o com aproximadamente 500 milhas de microliters de composto OCT e congele-o em gelo seco. Mantenha a amostra a essa temperatura. Extirpo um lobo pulmonar descelularizado de um rato processado, coloque-o em um molde criogeno com a maior área de superfície para baixo e cubra-o com composto OCT.Congele a amostra em gelo seco e mantenha-a a essa temperatura até que seja necessária. A amostra pode ser armazenada por pelo menos 12 semanas. Use um criostat para seção de blocos de tecido congelados em cinco seções de micrômetros a menos 20 graus Celsius.E coloque as seções em lâminas de vidro adesivo. Transfira os slides para a temperatura ambiente até que o ar seque. Mergulhe brevemente os slides em PBS, seguido de 4% de paraformaldeído em PBS por 15 minutos.Lave uma vez na PBS, depois duas vezes em água destilada por cinco minutos por lavagem. Mergulhe os slides na solução de hematoxilina de Myer por 10 minutos. Em seguida, lave os slides em um frasco de Copeland sob água destilada por 10 minutos e mergulhe na solução de eosina por sete minutos.Mergulhe em xileno várias vezes. Aplique algumas gotas de meio de montagem DPX e coloque um deslizamento de tampa de vidro. Deixe os slides secarem durante a noite sob um capô químico e depois escaneie-os em um scanner de slides.Depois de completar com sucesso o protocolo, o coração e os pulmões e o tecido NX estarão livres de células. A descelularização pode ser validada pela coloração de eosina hematoxilina dos andaimes ECM. Os andaimes retêm as dimensões de órgãos frescos e sua estrutura ECM insoável está intacta.Os andaimes ECM apresentaram aumento da permeabilidade e penetrabilidade da luz. O uso deste protocolo com um estágio de microscópio motorizado permite imagens tridimensionais de azulejos de amostras de montagem inteiras em resolução de sub-micron. É essencial evitar o fluxo em direção aos órgãos de interesse para alcançar a completa descelurização uniforme.A dissecação microcirúrgica e a ligadura dos vasos devem ser eficazes. E, ao mesmo tempo, respeite os tecidos alvo para manter a estrutura nativa do VCM. Após este procedimento, os andaimes serão enriquecidos para proteínas estruturais de ECM e podem ser usados para espectrometria de massa ou engenharia de tecidos.Esta técnica abre caminho para o mapeamento de alta resolução da matriz extracelular.

decellularization-of-the-murine-cardiopulmonary-complex

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo demonstra um método de produção de matriz extracelular descelularizada ou andaimes ECM aplicando perfusão anterógrada de detergentes através da vasculatura. Os scaffolds estruturais da ECM podem então ser usados para analisar a remodelação da ECM associada à doença cardiopulmonar.

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Um método para rápida e completamente remover componentes celulares a partir de um coração porcino intacta através da perfusão retrógrada é descrito. Este método produz um sítio específico cardíaco matriz extracelular andaime que tem o potencial para uso em várias aplicações clínicas.

Procedimento para decelularização do Coração Suínos por perfusão coronariana retrógrada

A descelularização de órgãos inteiros produz andaimes biológicos naturais que podem ser usados para medicina regenerativa. A descrição de um modelo de regeneração pulmonar de primatas não humanos em que pulmões inteiros são descelularizados e depois semeados com células-tronco adultas e células endoteliais em um biorreator que facilita a circulação vascular e a ventilação em meio líquido é apresentada.

Descelularização e recelularização pulmonar de primatas não humanos usando um biorreator especializado de órgãos grandes

Este protocolo descreve um método passo a passo para o isolamento reprodutível e cultura de longo prazo de cardiomiócitos de camundongos adultos com alto rendimento, pureza e viabilidade.

Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

Nestes estudos, que fornecem metodologia para novos, neonatal, andaimes cardíacas murinas para uso em estudos de regeneração.

Neonatal Cardiac Scaffolds: Matrizes novas para Estudos Regenerativa

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Decellularization comparável de explantes de tecido cardíaco Fetal e adulto como plataformas 3D-como para estudos de Vitro

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Classicamente, o endocárdio do primordium da válvula embrionária de camundongo foi analisado usando cortes transversais, coronais ou sagitais. Nossa nova abordagem para imagens bidimensionais en face do endocárdio em regiões valvulogênicas permite a polaridade planar e a análise de rearranjo celular do endocárdio durante o desenvolvimento valvar.

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