Name: Pegada de proteína radical de hidroxíl sem laser para realizar análises estruturais de proteínas de ordem superior (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Aprenda a técnica de pegada de proteína radical de hidroxíl sem laser para análise estrutural de proteínas usando fonte de luz de plasma e dosimetria radical em linha. Este método melhora a reprodutibilidade e acelera pesquisas em bioquímica.

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Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (R43GM125420 e R44GM125420).

1. Instalação do tubo capilar
<ol><li>Usando uma pedra de corte de sílica, corte 250 μm de diâmetro interno (ID) capilar de sílica de diâmetro para 27 polegadas. Verifique as extremidades capilares para um corte limpo e reto.</li>
	<li>Crie duas janelas com aproximadamente 15 mm de comprimento, queimando o revestimento de poliimida. A partir da "extremidade inferior" faça a primeira janela de fotolise a 90 mm de distância da "extremidade inferior" e a segunda janela dosímetro a 225 mm da "extremidade inferior". NOTA: Uma vez que o revestimento é queimado, o capilar é muito frágil.</li>
	<li>Desaparafusar a porca e a ferrule no porto 5 e inserir a "extremidade inferior" do capilar logo após a extremidade cônica do ferrule(Figura 1A).</li>
	<li>No módulo fotolise, remova a tampa da célula fotolise puxando-a diretamente para fora e, em seguida, remova a máscara metálica montada magneticamente que manterá o capilar no lugar. ATENÇÃO: Dentro da tampa da célula fotolise há um espelho curvo, não deixe nada tocar no espelho.</li>
	<li>No módulo dosímetro, abra a célula dosímetro empurrando a aba à esquerda e gire a célula dosímetro aberta para a direita. Remova os clipes magneticamente montados que manterão o capilar no lugar.</li>
	<li>Coloque o capilar no canal ranhurado na base da célula fotolise. Centralizar a janela capilar com a janela da célula de fotolise. Enquanto segura o capilar em posição com uma mão, adicione a máscara magnética para segurar o capilar no lugar. Coloque o boné de fotolise de volta na posição.</li>
	<li>Coloque o capilar no canal ranhurado na base da célula dosímetro. Centralizar a segunda janela capilar na pequena abertura no centro da base celular dosímetro. Enquanto segura o capilar em posição com uma mão, coloque os dois clipes magnéticos em posição para manter o capilar no lugar. Feche a célula dosímetro até que ela clique fechada.</li>
	<li>Insira o capilar através da porca amassada em cima do elevador capilar do coletor do produto(Figura 1B). Estenda o capilar até um pouco acima da parte inferior do frasco. NOTA: É importante que o capilar chegue à parte inferior do frasco para garantir que o capilar esteja submerso na solução de sátula durante a execução de um experimento.</li>
</ol>2. Instalando um loop de injeção
<ol><li>Use tubos de teflon com diâmetro externo de 1/16" e diâmetro interno de 0,015" (381 μm). Siga a equação 1 para calcular o comprimento da tubulação necessária para o volume desejado usando a equação 1. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61861/61861equ01.jpg"> Onde L é o comprimento da tubulação em milímetros, V é o volume desejado em microliters e d é o diâmetro interno do tubo em milímetros. Para um volume de injeção de 25 μL e um diâmetro interno de 381 μm, o comprimento do tubo precisa ser de aproximadamente 219,3 mm. NOTA: Para volumes inferiores a 20 μL, utilize tubos PTFE com diâmetro interno de 0,01".</li>
	<li>Corte a tubulação de Teflon ao comprimento necessário usando um cortador de tubo. Verifique as extremidades do tubo para um corte limpo e reto.</li>
	<li>Insira uma extremidade do novo laço de injeção através de uma das porcas e coloque uma nova ferrule na extremidade do tubo. Segure a ferrula e a porca no lugar e insira o tubo na porta 3 da válvula de injeção até que ela se desnúde na válvula. Segure o tubo firmemente e aperte bem o dedo mindinho. Com uma chave inglesa, aperte ainda mais a volta da porca 1/4. Remova e inspecione o conjunto. NOTA: Se a ferrula não estiver fixada na posição, reinstale e aperte 1/8 mais. Repita com a outra extremidade do loop.</li>
	<li>Uma vez que ambas as extremidades tenham uma porca e ferrule fixa, enrosque vagamente uma extremidade para a porta 3 e a outra extremidade para a porta 6 (Figura 1C). Uma vez em posição aperte ambos os lados para o dedo apertado, em seguida, 1/4 vire o dedo apertado com uma chave inglesa.</li>
</ol>3. Inicialize o sistema de fotolise
<ol><li>Ativar os módulos de fotolise na seguinte ordem: (1) Módulo Fluidics (2) Módulo de Fotolise (3) Módulo de Dosimetria (4) Coletor de Produto e, por último (5), o computador do sistema e iniciar o software de controle NOTA: Deixe o Módulo Dosímetro pelo menos meia hora para aquecer a partir de um início frio.</li>
	<li>Submergir totalmente a partir da posição "Válvula" na bomba de seringa(Figura 1D) em 10 mL de tampão. Coloque a tubulação da posição "Resíduos"(Figura 1D) e tubos da porta 2 na porta de seringa(Figura 1C)até um recipiente vazio para coletar resíduos. NOTA: Use o tampão em que sua proteína será suspensa. Um buffer recomendado é 10 mM NaPO4.</li>
	<li>No carrossel coletor de produtos, coloque tubos de microcentrifusagem de 1,5 mL na posição marcada H e 6.</li>
	<li>Se usar 250 μm ID capilar, defina a taxa de fluxo de carga para 500 μL/min, a taxa de fluxo de processamento para 7,5 μL/min e a taxa de fluxo de resíduos para 500 μL/min.</li>
	<li>Calcule o atraso do flash, o tempo do produto e o tempo de perda de tempo para usar o Modo semiautomático usando a equação 2. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61861/61861equ02.jpg"> Onde t é o tempo em minutos, s é a distância capilar em milímetros, d é o diâmetro interno do capilar em milímetros, e f é a taxa de fluxo em μL/min.<ol>
<li>Para o atraso do flash, a distância é da "extremidade inferior" do capilar para a primeira janela, que deve ser de aproximadamente 90 mm. Usando capilar de 250 μm iD e uma taxa de fluxo de processamento de 7,5 μL/min, a amostra chegará à janela fotolise em cerca de 35 segundos. Permita que dois flashes a 1 Hz ocorram antes da chegada das amostras, por isso defina o flash de atraso para 33 segundos.</li>
		<li>Para o tempo do produto, digite a quantidade de tempo injetado que a solução levará para fluir da válvula de injeção até o final do capilar. Para um capilar de 27" de comprimento de 250 μm ID, defina o tempo do produto para 4,5 minutos.</li>
		<li>Para o tempo de perda, insira a quantidade de tempo que o volume total de solução injetada levará para ser coletado. Neste momento, o coletor de produtos passará da posição do produto para o frasco de resíduos. Para um volume de injeção de 25 μL e uma vazão de 7,5 μL/min, ajuste o tempo de perda para 7,8 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enxágüe o laço de injeção cinco vezes injetando 25 μL de água de grau HPLC na porta de injeção com a válvula de injeção definida na posição de carga.</li>
	<li>Gire manualmente a válvula de injeção para 'injetar posição' para lavar o resto do sistema. Selecione Processo (Fora) no software de controle para começar a fluir água. Enquanto flui, levante o elevador capilar do coletor de produtos selecionando-o sob o coletor de produtos para que você possa ver a extremidade do capilar. Flua água através do capilar até que uma gota se forme. NOTA: Se uma gota não se formar, verifique se há vazamentos na válvula injetor. Se houver um vazamento, solte a porca, recira o capilar e reretighten.</li>
</ol>4. Determine o rendimento de ▪OH real para testar efeitos radicais de limpeza do buffer.
<ol><li>No Software de Controle, inicie o fluxo selecionando Processo (Out). Na aba configurações, ajuste a tensão de flash para 0 V. Na guia Controle Manual na seção de dados dosímetros, selecione Dados de Início + AutoZero.</li>
	<li>Selecione a posição para o frasco de produto (H) e o frasco de resíduos (6).</li>
	<li>Selecione Pronto,vire manualmente a válvula de injeção para baixo para a posição de carga e injete 25 μL de 1 mM de Adenina com 100 mM H2O2 na porta de injeção. Uma vez injetado, gire manualmente a válvula de injeção para a posição de injeção. NOTA: Isso aciona automaticamente o sistema para iniciar o fluxo, ligar a fonte de plasma e adquirir os dados de dosimetria.</li>
	<li>Aumente a tensão navegando até a guia de configurações e alterando a tensão de flash. Repetir as etapas 4.2 e 4.3 usando 500 V, 750 V, 1000 V e 1250 V. Realize a leitura de absorvância de adenina em cada tensão em triplicados.</li>
	<li>Selecione a guia cálculos para determinar a absorção média de cada amostra. Primeiro, clique em Selecionar, depois selecione manualmente o início e o fim da absorção de pico. No espaço disponível, escreva em uma descrição da amostra. Repita para todos os dados adquiridos. NOTA: As bolhas podem se formar causando um pico na leitura dosímetro. Ao selecionar dados para determinar a absorção média, omite áreas com bolhas.</li>
	<li>Copie e cole dados no Excel para calcular a variação média da absorção de adenina para cada tensão, determinando assim o rendimento▪ OH efetivo.</li>
	<li>Repetição de passos 4.1-4.6 se várias condições de amostra (buffer/aditivos diferentes) estiverem sendo usadas para normalizar o rendimento de▪ DES eficaz para cada condição.</li>
</ol>5. Modificação da proteína para detectar alterações na estrutura de ordem superior.
<ol><li>Misture adenina de 4 mM com 20 μM de proteína em uma proporção de um para um para fazer uma solução contendo adenina de 2 mM e 10 μM de proteína.</li>
	<li>Faça a solução de saciar usando catalase de 0,3 mg/mL para quebrar o excesso de peróxido de hidrogênio e 35 mM em meio a methionina para saciar quaisquer radicais restantes. Aliquot 25 μL de solução de saciar em um microtubo de 200 μL para que um volume igual de sacieda e o produto rotulado seja misturado.</li>
	<li>Diluir H2O2 a 200 mM e manter no gelo.</li>
	<li>No Software de Controle na guia configurações, inicie a tensão flash em 0 V para determinar qualquer oxidação de fundo.</li>
	<li>Na guia de controle manual, selecione Start Data + AutoZero, seguido de Process (Out),em seguida, Pronto, e finalmente vire a válvula de injeção para baixo para a posição de carga.</li>
	<li>Coloque uma solução de saciar na posição 1 no carrossel de coleta de produtos. No Software de Controle do Sistema altere o frasco do produto para 1.</li>
	<li>Imediatamente antes da injeção, misture 12,5 μL da mistura de adenina e proteína com 12,5 μL de H2O2 para fazer uma concentração final de 1 mM de Adenina, 5 μM de proteína e 100 mM H2O2. Pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar, gire rapidamente para baixo e injete 25 μL usando a porta de injeção dentro de 10 segundos após a mistura.</li>
	<li>Mude a válvula de injeção para a posição de injeção e espere enquanto a amostra está sendo processada.</li>
	<li>Reincidente aquisição com 500 V, 750 V, 1000 V e 1250 V. Execute cada medição de tensão em triplicado.</li>
	<li>Calcule a absorvância média conforme descrito na etapa 4.5. Copie e cole todos os dados para o Excel.</li>
</ol>6. Desligue o sistema
<ol><li>Depois de todas as amostras terem sido coletadas, limpe a porta da seringa e o laço amostral, colocando a válvula de injeção na posição de carga e injete 25 μL de água HPLC cinco vezes.</li>
	<li>Gire a válvula de injeção até a posição de injeção para lavar o resto do sistema com água HPLC.</li>
	<li>Pare o fluxo, feche o software de controle do sistema e desligue os módulos começando com o coletor de produto, módulo dosímetro, módulo de fotolise e, finalmente, o módulo fluido.</li>
</ol>7. Preparação amostral e espectrometria de massa cromatografia líquida
<ol><li>Desnaturar a proteína incubando amostras a 80 °C por 20 min na presença de 50 mM Tris e 1 mM CaCl2. Esfrie amostras à temperatura ambiente e adicione 1:20 trypsin à proteína. Digerir a proteína durante a noite a 37 °C com mistura de amostras. Na manhã seguinte, termine a digestão de trippsina aquecendo amostras a 95 °C por 10 minutos.</li>
	<li>Detecte peptídeos usando um sistema LC-MS/MS de alta resolução conectado a um sistema UPLC.</li>
	<li>Carregue a amostra primeiro na coluna trap (300 μm ID X 5 mm 100 Å pore size, 5 μm tamanho de partícula) e lave a 5,0 μL/mL por 3 min com água contendo 2% de solvente B (acetonitrila e ácido fórmico de 0,1%).</li>
	<li>Separe os peptídeos em uma nanocolumn C18 (0,75 mm x 150 mm, tamanho de partícula de 2 μm, 100 Å tamanho de poros) a uma taxa de fluxo de 300 nL/min com um gradiente entre solvente A (água contendo 0,1% de ácido fórmico) e solvente B. O gradiente para eluição de peptídeo consiste em um aumento linear de 2 a 35% B sobre 22 min, rampado para 95% B sobre 5 min e mantido por 3 min para lavar a coluna, e depois voltou para 2% B sobre 3 min e segurou por 9 min para reelegenciar a coluna.</li>
	<li>Adquira os dados no modo íon positivo. Coloque a tensão do spray em 2400 V, e a temperatura do tubo de transferência de íons para 300 °C.</li>
	<li>Adquira as varreduras completas de MS de 250-2000 m/z seguidas de oito varreduras subsequentes de MS/MS dependentes de dados nos oito íons peptídeos mais abundantes. Use dissociação induzida por colisão a 35% de energia normalizada para fragmentar os peptídeos.</li>
	<li>Identifique todos os peptídeos não modificados detectados a partir da análise de MS/MS usando um software de análise de proteína disponível contra o arquivo FASTA necessário contendo a sequência proteica e a enzima proteolítica relevante.</li>
	<li>Pesquise e quantifique peptídeos modificados usando um Software de Processamento de Dados HRPF. A extensão da oxidação para cada peptídeo identificado é calculada dividindo a área de pico cromatográfica somada de um peptídeo modificado pela área total de pico cromatográfico daquele peptídeo modificado e não modificado usando a equação 3. P = [I(singly oxidado) X 1 + I (duplamente oxidado) X 2 + I(triply oxidado) X 3 + .../[Iunoxidized + I(singly oxidado)+ I(duplamente oxidado) + I(triply oxidado) ...] onde P denota o número médio de eventos de oxidação por molécula de peptídeo, e eu represento a área de pico do peptídeo nãooxidado (Iunoxidizado) e o peptídeo com n eventos de oxidação.</li>
</ol>8. Para um estudo diferencial, repita as etapas 5-7 na segunda condição.
NOTA: Para confirmar a reprodutibilidade, recomenda-se duas réplicas biológicas, além de triplicados técnicos para cada condição.

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A E.E.C., J.S.S., e S.R.W. divulgam um interesse financeiro significativo na GenNext Technologies, Inc., uma empresa em estágio inicial que busca comercializar tecnologias para análise de estrutura de proteínas de alta ordem. Os dados representativos fornecidos foram revisados por S.K.M., que não tem conflito financeiro de interesses.

Existem várias etapas críticas para garantir a rotulagem adequada de proteínas durante qualquer experimento hrpf. Primeiro, uma taxa de fluxo apropriada e a taxa de flash de origem são selecionadas para garantir que cada bolus da amostra seja irradiado uma vez. Isso garante que a proteína seja exposta a um único bolus de recém-formado ▪OH. Uma vez que uma proteína é oxidada, a estrutura proteica de ordem mais alta pode ser alterada. Para ter certeza de que a estrutura proteica nativa é sondada, cada molécula d...

A conformação proteica e a estrutura de ordem superior associada (HOS) são os principais determinantes da função biológica adequada e do comportamento aberrante1. O mesmo se aplica aos biofarmacêuticos, cuja estrutura e atividade funcional dependem de vários aspectos de sua produção e ambiente. A mudança biofarmacêutica no HOS tem sido associada a reações adversas de medicamentos (ADR) atribuídas à farmacologia indesejável e à resposta imunológica do paciente2,3. O aparecimento de ADRs alertou a indústria biofarmacêutica para o papel crítico que o HOS proteico desempenha na segurança e eficácia da bioterapêutica, e eles estabeleceram a necessidade de novas e melhoradas análises hos4.
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) é uma técnica promissora para acompanhar a mudança no HOS proteico. O HRPF envolve a rotulagem irreversível do exterior de uma proteína com ▪OH seguido de análise de espectrometria de massa (MS) para identificar a superfície acessível solvente da proteína5,6,7. O HRPF tem sido usado com sucesso para detectar defeitos na proteína HOS e sua função8,9, caracterizar o HOS de anticorpos monoclonais (mAb)10,11,12,13, determinar a vinculação Kd de um ligante14, e muito mais15,16,17,18,19. Um método comum para gerar o ▪OH para HRPF é a Oxidação Fotoquímica Rápida de Proteínas (FPOP), que emprega lasers UV rápidos e de alta energia para produzir ▪OH a partir da fotolise de H2O2. Em sua maioria, o FPOP usa lasers excimer caros que empregam gás perigoso (KrF) que exigem salvaguardas substanciais para evitar lesões respiratórias e oculares20. Para evitar riscos de inalação, outros usaram lasers de alumínio de neodímio quadruplicado (Nd:YAG)lasers 21, que elimina o uso de gás tóxico, mas ainda são caros, exigem uma experiência operacional significativa e exigem extensos controles de luz desviadas para proteger os usuários contra lesões oculares.
Embora informações amplas possam ser obtidas por meio do HRPF, a ampla adoção na biopharma não foi atendida. Duas barreiras para a adoção limitada do HRPF incluem: 1) o uso de lasers perigosos e caros que exigem precauções de segurança substanciais20; e 2) a irreprodutibilidade do HRPF causada pela limpeza de fundo de ▪OH que limitam estudos comparativos22. Para suplantar o uso de laser, uma unidade de fotolise flash de plasma de alta velocidade e alta energia foi desenvolvida para realizar o FPOP com segurança de forma fácil. Para melhorar a irreprodutividade dos experimentos do HRPF, a dosimetria radical em tempo real é implementada.
A prática do HRPF tem sido limitada pela irreprodutividade atribuída à limpeza de fundo de ▪OH22. Embora ▪OH sejam excelentes sondas de topografia proteica, elas também reagem com muitos constituintes encontrados nas preparações, tornando necessário medir a concentração efetiva de radicais disponíveis para oxidar uma proteína alvo. Variações na preparação de tampão, concentração de peróxido de hidrogênio, propriedades de ligante ou fotolise podem resultar em diferenças de oxidação entre o controle e grupos experimentais que criam ambiguidade em estudos diferenciais de HOS. A adição de dosimetria radical em tempo real permite o ajuste do efeito ▪carga OH e, portanto, aumenta a confiança e a reprodutibilidade durante um experimento de HRPF. O uso da dosimetria radical no FPOP foi descrito em outros lugares23,24,25, e é ainda discutido em detalhes em uma publicação recente26. Aqui, descrevemos o uso de um novo sistema de fotolise flash e dosimetria em tempo real para rotular apo-mioglobina equina (aMb), comparando níveis de oxidação de peptídeos em um experimento FPOP ao obtido ao usar um laser excimer.

<table><tbody><tr><td>Tubos de Centrífuga Cônicos de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>qualquer marca é suficiente</td></tr><tr><td>50 &micro; L SGE Seringas à Prova de Gás</td><td>Fisher Scientific</td><td>SG-00723</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 &micro; m)</td> <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico (v / v), LC / MS Grau</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS120-500</td><td></td></tr><tr><td>Apomioglobina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>022625501</td><td></td></tr><tr><td>Limpadores de Tarefas Delicadas</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>qualquer peróxido de hidrogênio a 30% é suficiente</td></tr><tr><td>Amida de metionina</td><td>Chem-Impex</td><td>03109</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002436</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Espectrômetro de Massa</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid</td><td>outros instrumentos de alta resolução (por exemplo, Q exactive Orbitrap ou Orbitrap Fusion) podem ser usados</td></tr><tr><td>Perfure a Tripsina Protease, MS Grade</td><td>Thermo Scientific</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32"</td><td>Molex</td><td>1068680064</td><td>qualquer cortador de tubos capilares é suficiente</td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water com 0,1% de ácido fórmico (v / v), LC / MS Grau</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS118-500</td><td></td></tr><tr><td>Água, LC / MS Grau</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>

pegada de proteína radical de hidroxíl sem laser para realizar análises estruturais de proteínas de ordem superior

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) é uma técnica emergente e promissora de análise estrutural de ordem superior que fornece informações sobre mudanças na estrutura proteica, interações proteína-proteína ou interações proteína-ligand. O HRPF utiliza radicais hidroxil(▪OH) para rotular irreversivelmente a superfície acessível de solvente de uma proteína. A complexidade inerente, o custo e a natureza perigosa do desempenho do HRPF limitaram substancialmente a adoção ampla na biopharma. Esses fatores incluem: 1) o uso de lasers complicados, perigosos e caros que exigem precauções substanciais de segurança; e 2) a irreprodutibilidade do HRPF causada pela limpeza de fundo de ▪OH que limitam estudos comparativos. Esta publicação fornece um protocolo para o funcionamento de um sistema HRPF sem laser. Este sistema HRPF sem laser utiliza uma tecnologia de oxidação de flash de fonte de luz de plasma de alta energia e alta pressão com dosimetria radical em linha. A fonte de luz plasmática é mais segura, fácil de usar e mais eficiente na geração de radicais hidroxílicos do que os sistemas HRPF baseados em laser, e o dosímetro radical em linha aumenta a reprodutibilidade dos estudos. Combinado, o sistema HRPF sem laser aborda e supera as deficiências e limitações mencionadas das técnicas baseadas em laser.

A fonte de plasma de alta pressão juntamente com a dosimetria em tempo real permite um melhor controle do▪ o rendimento de OH para observar mudanças na estrutura proteica de alta ordem com mais precisão. A adição de adenina permite um dosímetro radical eficaz em tempo real. Após a oxidação, a adenina perde a absorvância UV a 265 nm(Figura 2A). A mudança na absorção de adenina está diretamente relacionada à concentração de radicais disponíveis para o HRPF, fornecendo assim um meio ...

Este protocolo apresenta um método para usar a dosimetria radical inline e uma fonte de luz plasmática para realizar a pegada de proteína de oxidação flash. Este método substitui o perigoso laser UV para simplificar e melhorar a reprodutibilidade da oxidação fotoquímica rápida de estudos proteicos.

Pegada de proteína radical de hidroxíl sem laser para realizar análises estruturais de proteínas de ordem superior

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

A pegada de proteína radical de hidroxíl sem laser facilita muito a identificação de locais de interação proteica e regiões de mudanças confirmacionais, acelerando a pesquisa em estudos de agregação, estrutura e estabilidade de proteínas. Com a dosimetria radical inline, os usuários podem ajustar a carga radical de hidroxíl eficaz em tempo real, e com a dosimetria radical em tempo real, você pode economizar tempo experimental e amostra preciosa enquanto melhora a reprodutibilidade de rotulagem. Para começar, corte uma capilar de sílica de 250 micrômetros de diâmetro interno até 27 polegadas com uma pedra de fissura de sílica, verificando as extremidades do capilar para um corte limpo e reto.Crie duas janelas de aproximadamente 15 milímetros de comprimento. Da extremidade inferior do capilar, queime o revestimento de poliimida 90 milímetros para criar a janela de fotolise e 225 milímetros para a janela dosímetro. Insira a extremidade inferior do capilar logo após a extremidade cônica de uma porca e ferrule.Adicione o capilar à porta cinco, apertando um pouco além do dedo apertado com uma chave inglesa. Remova a tampa celular fotolise do módulo fotolise puxando-a diretamente para fora, em seguida, remova a máscara metálica montada magneticamente, que manterá o capilar no lugar. Abra a célula dosímetro empurrando a aba à esquerda e gire a célula dosímetro aberta para a direita.Remova os clipes magneticamente montados que manterão o capilar no lugar. Em seguida, coloque o capilar no canal ranhurado na base da célula fotolise e centralize a janela capilar com a janela da célula fotolíase. Mantenha o capilar em posição e adicione a máscara magnética.Coloque o boné de fotolise de volta na posição. Coloque o capilar no canal ranhurado na base da célula dosímetro, e centralize a segunda janela capilar na pequena abertura no centro da célula dosímetro. Enquanto segura o capilar em posição com uma mão, coloque os dois clipes magnéticos em posição para manter o capilar no lugar.Feche a célula dosímetro até que ela clique fechada. Por fim, insira o capilar através do botão amassado sobre o elevador capilar do coletor do produto, estendendo o capilar até um pouco acima da parte inferior do frasco. Corte o comprimento desejado da tubulação Teflon usando um cortador e verifique as extremidades para um corte reto limpo.Insira uma extremidade do novo laço de injeção através de uma das porcas, e coloque uma nova ferrule na extremidade do tubo. Segure a porca e a ferrula no lugar enquanto insere o tubo na porta seis da válvula de injeção até que ele se desnúde. Aperte a porca com uma chave inglesa e confirme que a porca e a ferrula estão no lugar.Uma vez que ambas as extremidades tenham uma porca e ferrule fixa, enrosque vagamente uma extremidade para a porta três e a outra extremidade para a porta seis. Uma vez em posição, aperte ambos os lados para o dedo apertado, em seguida, um quarto vire o dedo apertado com uma chave inglesa. Ligue o sistema HRPF sem laser iniciando o módulo fluido, seguido do módulo de fotolise, módulo dosímetro, coletor de produtos e computador do sistema.Inicie o software do sistema. Submergir totalmente a tubulação em 10 mililitros de tampão da posição da válvula na bomba de seringa. Direcione a tubulação da posição de resíduo e a tubulação da porta dois na porta da seringa para um recipiente vazio para coletar resíduos.Coloque tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro na posição marcada HN6 no carrossel coletor de produtos. Enxágüe o laço de injeção cinco vezes injetando 25 microliters de água de grau HPLC com a válvula definida na posição de carga. Gire manualmente a válvula de injeção para lavar o resto do sistema.Selecione Processo no software de controle para começar a fluir água até que uma gota se forme. Faça uma solução contendo duas adenina milimães e 10 proteínas micromolar. Em seguida, faça uma solução de saciar usando 0,3 miligramas por catalase mililitro e 35 milimolars de methianina amida.Aliquot 25 microliters de solução de saciar em um micro tubo de 200 microliteres. Diluir peróxido de hidrogênio para 200 mililitros, mantendo-o no gelo. Inicie a tensão flash a zero volts no software de controle.Este controle de volts zero determinará qualquer oxidação de fundo na proteína de interesse. Selecione Iniciar dados AutoZero, seguido por Process then Ready. Por fim, vire a válvula de injeção para a posição de carga.Coloque a solução de saciar na posição um no carrossel coletor de produtos e, em seguida, altere o frasco do produto para um no software de controle do sistema. Imediatamente antes da injeção, misture 12,5 microliters da mistura de adenina e proteína com 12,5 microliters de peróxido de hidrogênio. Pipeta a mistura para cima e para baixo para misturar, em seguida, rapidamente gire-a para baixo.Injete 25 microliters desta solução usando a porta de injeção dentro de 10 segundos após a mistura. Mude a válvula de injeção para a posição de injeção e espere enquanto a amostra está sendo processada. Apareçam a tensão de flash para 750 volts no software de controle e repita as etapas de rotulagem.Em seguida, registo a absorvância de cada amostra. Primeiro, clique em Selecionar e selecione manualmente o início e o fim do pico de absorção. No espaço disponível, escreva em uma descrição da amostra.Repita isso para todos os dados adquiridos. Copie e cole os dados em uma planilha para calcular a variação média da absorvância de adenina para cada tensão. Depois de todas as amostras terem sido coletadas, limpe a porta da seringa e o laço amostral, colocando a válvula de injeção na posição de carga e injete cinco vezes microliters de água HPLC.Gire a válvula de injeção até a posição de injeção para lavar o resto do sistema com água HPLC. Uma vez lavado, pare o fluxo, saia do software de controle do sistema e desligue os módulos, começando pelo coletor de produtos, módulo dosímetro, módulo de fotolise e, finalmente, o módulo fluido. Após a oxidação, a adenina utilizada para a dosimetria diminui na absorção uv a 265 nanômetros.O Buffer 2 contém um carniceiro radical, que diminui a mudança na absorção de adenina em comparação com o Buffer 1. A apomyoglobina foi modificada na presença de peróxido de hidrogênio e adenina em quatro tensões crescentes de lâmpadas de plasma. Foram detectados seis peptídeos, com aumento linear da oxidação em relação à mudança da absorção de adenina em 265 nanômetros.Estes seis peptídeos oxidados são rotulados em uma estrutura cristalina de mioglobina. A extensão da oxidação detectada a partir da lâmpada de plasma de alta pressão é muito maior do que o método baseado em laser. Esse aumento decorre do amplo espectro de emissão UV da lâmpada de plasma de alta pressão.Ao produzir um amplo espectro UV, a lâmpada plasmática de alta pressão se sobrepõe melhor ao domínio de absorção de peróxido de hidrogênio, resultando em uma produção mais eficiente de radicais hidroxil através da fotolise do peróxido de hidrogênio, em comparação com o Kr F Excimer Laser e Nd YAG Laser. A lâmpada de plasma de alta pressão aumenta significativamente a produção de radicais hidroxil além do que é normalmente observado usando um Laser Kr F Excimer. O uso de peróxido de 100 milimônios pode causar altos níveis de oxidação de fundo.Se o sistema proteico é suscetível à oxidação induzida por peróxido, diminua a concentração para até 10 mililitros. O rótulo irreversível do HRPF permite o manuseio de amostras a jusante, incluindo digestões longas de protease, você pode adicionar em conjunto etiqueta de massa para multiplexação, e realizar cromatografia 2D, todas melhorando a detecção de peptídeos e informações estruturais concoordenadas.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo descreve como quantificar o Mg (II) dependente da formação de RNA estrutura terciária através de dois métodos de pegada radical hidroxila.

Monitoramento de mudanças na estrutura Equilibrium RNA por &quot;peroxidativo&quot; e &quot;oxidativo&quot; Footprinting Radical Hidroxila

Medição de massa exata representa um passo importante durante a investigação de proteínas. De matriz assistida por laser de dessorção / ionização (MALDI) Espectrometria de massa (MS) pode ser utilizado para tal determinação e a sua principal vantagem é a tolerância para os sais, detergentes e contaminantes. Aqui, ilustramos uma abordagem acessível para a análise de proteínas maiores do que 100 kDa, por MALDI-MS.

Matrix-assisted laser dessorção / ionização Time of Flight (MALDI-TOF) espectrometria de massa Análise de proteínas intactas maior que 100 kDa

Conformação da proteína e dinâmicas são a chave para a compreensão da relação entre estrutura e função de proteínas. Troca de hidrogênio acoplada a espectrometria de massa de alta resolução é um método versátil para estudar a dinâmica de conformação das proteínas, bem como a caracterização da proteína-ligante e interações proteína-proteína, incluindo interfaces de contato e efeitos alostéricos.

Analisando Dynamics proteína utilizando hidrogênio câmbio Espectrometria de Massa

A arquitetura de complexos de proteínas é essencial para a sua função. Combinar várias técnicas de espectrometria de massa provou poderosa para estudar seu assembly. Nós fornecemos protocolos para cross-linking química e espectrometria de massa nativa e mostrar como essas técnicas complementares ajudam a elucidar a arquitetura de assemblies multi o subunit da proteína.

Combinando reticulação química e espectrometria de massa de complexos de proteínas intactas para estudar a arquitetura de montagens de proteínas com multi- subunidades

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a homogeneidade de rotulagem para cada espécie de proteína em uma amostra de proteína complexa a nível da molécula.

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

Um protocolo versátil de cryoslicing BN-MS usando um micrótomo é apresentado para o perfilamento complexome de alta resolução.

Perfilamento Complexome de alta resolução por Cryoslicing BN-MS Analysis

In vivo a oxidação fotoquímica rápida de proteínas (IV-FPOP) é uma técnica de pegada de proteína radical hidroxil que permite o mapeamento da estrutura proteica em seu ambiente nativo. Este protocolo descreve a montagem e a configuração do sistema de fluxo microfluido IV-FPOP.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting para o Estudo de Interações Proteicas em Caenorhabditis elegans

Aqui, caracterizamos a estrutura proteica e os locais de interação em células vivas usando uma técnica de pegada proteica denominada oxidação fotoquímica rápida de proteínas (IC-FPOP).

Caracterização de proteínas celulares com oxidação fotoquímica rápida de proteínas

A oxidação fotoquímica rápida das proteínas é uma técnica emergente para a caracterização estrutural das proteínas. Diferentes aditivos e ligantes de solventes têm variadas propriedades de limpeza radical hidroxyl. Para comparar a estrutura proteica em diferentes condições, a compensação em tempo real dos radicais hidroxis gerados na reação é necessária para normalizar as condições de reação.

Permitindo compensação em tempo real em oxidações fotoquímicas rápidas de proteínas para a determinação de mudanças de topografia de proteínas

Os procedimentos experimentais para a realização de rotulagem covalente à base de diethylpirocarbonato com detecção espectrométrica em massa são descritos. O dietilpirocarbonato é simplesmente misturado com o complexo de proteínas ou proteínas de interesse, levando à modificação de resíduos de aminoácidos acessíveis solventes. Os resíduos modificados podem ser identificados após a digestão proteolítica e a análise da cromatografia líquida/espectrometria de massa.

Rotulagem covalente com dietilpirocarbonato para estudar estrutura de alta ordem de proteína por espectrometria de massa

Uma nova plataforma estática é usada para caracterizar a estrutura proteica e locais de interação no ambiente celular nativo utilizando uma técnica de pegada de proteína chamada oxidação fotoquímica rápida em células de proteínas (IC-FPOP).

Incubadora de plataformas com estágio XY móvel: uma nova plataforma para implementar oxidação fotoquímica rápida em células de proteínas

Aprenda a técnica de pegada de proteína radical de hidroxíl sem laser para análise estrutural de proteínas usando fonte de luz de plasma e dosimetria radical em linha. Este método melhora a reprodutibilidade e acelera pesquisas em bioquímica.

Pegada de proteína radical de hidroxíl sem laser para realizar análises estruturais de proteínas de ordem superior

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