Name: Cocultura de Neurônios de Gânglio Axotomizado de Rato Retinal com Glia Ensheathing Olfactory, como um Modelo In Vitro de Regeneração Axonal Adulta (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprenda a avaliar a capacidade neuroregenerativa da glia envoltória olfatória em neurônios de gânglio retinal axotomizados de rato adulto. Este modelo in vitro quantitativo permite estudar interações neuronais e potencial terapêutico em lesões do sistema nervoso.

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Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo projeto SAF2017-82736-C2-1-R do Ministerio de Ciencia e Innovación para o MTM-F e pela Fundación Universidad Francisco de Vitória ao JS.

NOTA: A experimentação animal foi aprovada pelos comitês nacionais e institucionais de bioética.
1. ihOEG (Ts12 e Ts14) cultura
NOTA: Este procedimento é feito em condições estéreis em um armário de biossegurança da cultura tecidual.
<ol><li>Prepare o meio de cultura OEG ME10 de 50 mL conforme previsto na Tabela 1.</li>
	<li>Prepare 5 mL de DMEM/F12-FBS, conforme fornecido na Tabela 1, em tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Aqueça ambas as mídias a 37 °C em um banho de água limpa, por 15 minutos.</li>
	<li>Descongele os frascos de células Ts12 e Ts14 a 37 °C em um banho de água limpa.</li>
	<li>Resuspend e adicione células ao meio de cultura DMEM/F12-FBS preparado na etapa 2.</li>
	<li>Centrífuga por 5 min a 200 x g.</li>
	<li>Aspire o supernatante.</li>
	<li>Adicione 500 μL de me10 médio e resuspense a pelota.</li>
	<li>Prepare um prato de cultura celular p60 com 3 mL de ME10 e adicione a suspensão celular, dropwise.</li>
	<li>Mova-se para distribuir as células uniformemente através da placa.</li>
	<li>Células de cultura a 37 °C em 5% DE CO2. NOTA: Depois de atingir a confluência, pelo menos outra passagem deve ser feita para otimizar as células para a cocultura. 90% de confluência é necessária antes de semeá-las nas tampas para cocultura. Um p-60 confluente tem um número celular médio de 7 x 105 para Ts14 e 2,5 x 106 para linhas celulares Ts12. As linhas de celular Ts12 e Ts14 devem ser passagem a cada 2-3 dias.</li>
</ol>2. Preparação do ihOEG (Ts12 e Ts14) para o ensaio
NOTA: Esta etapa deve ser feita 24 horas antes da dissecção e cocultura da RGN.
<ol><li>Trate as tampas de 12 mm Ø com 10 μg/mL de poli-l-lisina (PLL) por 1 h. NOTA: Os deslizamentos podem ser deixados durante a noite na solução PLL.</li>
	<li>Lave as tampas com 1x de soro fisiológico tampão de fosfato (PBS), três vezes.</li>
	<li>Despete células Ts12 e Ts14 ihOEG do prato de cultura celular p60.<ol>
<li>Adicione 4 mL de meio de cultura DMEM/F12-FBS(Tabela 1) a um tubo cônico de 15 mL. Aqueça a 37 °C em um banho de água limpa.</li>
		<li>Remova o meio das placas e lave as células com 1 mL de 1x PBS-EDTA, uma vez.</li>
		<li>Adicione 1 mL de trypsin-EDTA às células OEG e incubar por 3-5 min a 37 °C, 5% CO2.
</li>
		<li>Colete células com uma pipeta p1000 e transfira-as para o meio preparado na etapa 3.1.</li>
		<li>Centrífuga por 5 min a 200 x g.</li>
		<li>Aspire o supernatante.</li>
		<li>Adicione 1 mL de média ME10 e resuspense a pelota.</li>
		<li>Conte o número da célula em um hemócito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Semente 80.000 células Ts14 ou 100.000 células Ts12/bem nas tampas em placas de 24 poços em 500 μL de me10 médio.</li>
	<li>Células de cultura a 37 °C em 5% de CO2, por 24 h.</li>
</ol>3. Dissecção do tecido retiniano
NOTA: Ratos Wistar machos de 2 meses de idade são usados como fonte RGN. Duas retinas (um rato) para 20 poços de um prato de célula de 24 poços. Material cirúrgico autoclave antes do uso. O kit de dissociação papain é comprado comercialmente(Tabela de Materiais). Siga as instruções do provedor para a reconstituição. Reconstituir D,L-2-amino-5-ácido fosfosfosfonovalerico (APV) em estoque de 5 mM e preparar as alíquotas.
<ol><li>No dia do ensaio, prepare a seguinte mídia.<ol>
<li>Prepare um prato de cultura celular p60 com 5 mL de EBSS frio (frasco 1 do kit de dissociação papain).</li>
		<li>Prepare um prato de cultura celular p60 com frasco reconstituído 2 (papain) do kit de dissociação papain mais 50 μL de APV.  Em seguida, adicione 250 μL de frasco desprointitulado 3 (DNase mais 5 μL de APV).</li>
		<li>Em uma mistura de tubo estéril de 2,7 mL de frasco 1 com 300 μL de frasco 4 (inibidor de protease albumina-ovomucoid). Adicione 150 μL de frasco 3 (DNase) mais 30 μL de APV.</li>
		<li>Prepare 20 mL de neurobasal-B27 médio (NB-B27) conforme previsto na Tabela 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sacrifique um rato por asfixia com CO2.</li>
	<li>Remova a cabeça por decapitação com guilhotina; colocá-lo em uma placa de Petri de 100 mm e pulverizar a cabeça com etanol 70% antes de colocá-lo em um capô de fluxo laminar.</li>
	<li>Corte os bigodes do rato com uma tesoura para que não interfiram com a manipulação dos olhos.</li>
	<li>Segure o nervo óptico com fórceps para puxar o globo ocular o suficiente para ser capaz de fazer uma incisão através do olho com um bisturi.</li>
	<li>Remova a lente e o humor vítreo e puxe a retina (tecido laranja), enquanto as camadas restantes do olho ficam dentro (incluindo a camada epitelial do pigmento).</li>
	<li>Coloque a retina no prato de cultura celular p60 preparado na etapa 3.1.1.</li>
	<li>Transfira a retina para o prato de cultura celular p60 preparado na etapa 3.1.2 e corte-a com o bisturi em pequenos pedaços de tamanho aproximado < 1 mm.</li>
	<li>Transfira para um tubo de plástico de 15 mL.</li>
	<li>Incubar o tecido por 30 minutos, em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2,com agitação a cada 10 minutos.</li>
	<li>Dissociar aglomerados de células por pipetting para cima e para baixo com uma pipeta Pasteur de vidro.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular a 200 x g por 5 min.</li>
	<li>Descarte o supernaente e inativar o papain, resuspenque a pelota celular na solução preparada na etapa 3.1.3. (1,5 mL para 2 olhos).</li>
	<li>Encolé-lo cuidadosamente em 5 mL de frasco reconstituído 4.</li>
	<li>Centrifugar a 200 x g por 5 min.</li>
	<li>Enquanto centrifuga, remova completamente o meio ME-10 da placa de célula de poço OEG 24 (previamente preparado na etapa 2) e substitua-o por 500 μL de meio NB-B27 por poço.</li>
	<li>Descarte o supernasce e resuspenque as células em 2 mL de meio NB-B27.</li>
	<li>Placa 100 μL de suspensão celular de retina, por poço da placa m24, em deslizamentos de monocamadas tratados com PLL ou OEG.</li>
	<li>Mantenha as culturas a 37 °C com 5% de CO2 para 96 h no meio NB-B27.</li>
</ol>4. Imunostaining
<ol><li>Após 96 h, fixar as células por 10 min adicionando o mesmo volume de 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x PBS ao meio de cultura (600 μL) (concentração final pfa 2%).</li>
	<li>Remova a mídia e o PFA da placa de 24-multiwell e adicione mais uma vez 500 μL de 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x PBS. Incubar por 10 minutos.</li>
	<li>Descarte o fixador e lave 3 vezes com 1x PBS por 5 minutos.</li>
	<li>Bloco com 0,1% Triton X-100/1% FBS em PBS (PBS-TS) por 30-40 min.</li>
	<li>Prepare os anticorpos primários no tampão PBS-TS da seguinte forma: Anticorpo monoclonal SMI31 (contra proteínas MAP1B e NF-H) (1:500). 514 (reconhece proteínas MAP2A e B) antiserum policlonal de coelho (1:400).</li>
	<li>Adicione anticorpos primários às coculturas e incubar durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>No dia seguinte, descarte os anticorpos e lave as tampas com 1x PBS, 3 vezes, por 5 minutos.</li>
	<li>Prepare os anticorpos secundários no buffer PBS-TS da seguinte forma: Para SMI-31, anti-mouse Alexa Fluor 488 (1:500). Para 514, anti-coelho Alexa-594 (1:500).</li>
	<li>Incubar células com os anticorpos secundários fluorescentes correspondentes por 1h, em RT, no escuro.</li>
	<li>Lave as tampas com 1x PBS, 3 vezes, por 5 min, no escuro.</li>
	<li>Por fim, monte as tampas com meio de montagem(Tabela de Materiais) e mantenha a 4 °C. NOTA: Sempre que necessário, pode ser realizada a coloração de núcleos fluorescentes com DAPI (4,6-diamidino-2-fenilôndole). Antes de montar, incubar as células por 10 minutos no escuro com DAPI (10 μg/mL em 1x PBS). Lave as tampas 3 vezes com 1x PBS e, finalmente, monte as tampas com o meio de montagem.</li>
</ol>5. Quantificação da regeneração axonal
NOTA: As amostras são quantificadas sob o objetivo de 40x de um microscópio de epifluorescência. Um mínimo de 30 fotos devem ser tiradas em campos aleatórios, com pelo menos 200 neurônios, a serem quantificadas para cada tratamento. Cada experimento deve ser repetido um mínimo de três vezes.
<ol><li>Quantifique a porcentagem de neurônios com axônio (neurite positivo SMI31) em relação à população total de RGNs (identificada com map2A/B 514 imunostaining positivo do corpo neuronal e dendritos).</li>
	<li>Quantifique o índice de regeneração axonal ou o comprimento axonal médio (μm/neurônio). Este parâmetro é definido como a soma dos comprimentos (em μm) de todos os axônios identificados, divididos pelo número total de neurônios contados, apresentando um axônio ou não. O comprimento axonal é determinado usando o neuronj plugin do software de imagem ImageJ (NIH-USA).</li>
	<li>Calcule a média, o desvio padrão e a significância estatística usando o software apropriado.</li>
</ol>

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<li>Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+rat+olfactory+nerve+ensheathing+cells+are+effective+promoters+of+adult+central+nervous+system+neurite+outgrowth+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture.</a> Glia. 25 (3), 256-269 (1999).</li>
<li>Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+olfactory+ensheathing+cell+signaling+mechanisms%3A+effects+on+their+support+for+neurite+regrowth+from+adult+CNS+neurons+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture.</a> Glia. 44 (3), 232-241 (2003).</li>
<li>Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differences+and+interactions+between+phenotypic+subpopulations+of+olfactory+ensheathing+cells+in+promoting+CNS+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration.</a> Glia. 50 (1), 12-20 (2005).</li>
<li>Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+olfactory+ensheathing+glia+promote+axonal+regeneration+of+rat+retinal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).</li>
<li>García-Escudero, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+olfactory+mucosa+cells+but+not+lung+or+skin+fibroblasts+mediate+axonal+regeneration+of+retinal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons.</a> Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).</li>
<li>Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+distinguish+phosphorylated+and+nonphosphorylated+forms+of+neurofilaments+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).</li>
<li>Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+a+site-specific+phosphorylation+of+the+microtubule-associated+protein+2+during+the+development+of+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons.</a> Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).</li>
<li>Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+cell+purification+and+determination+of+cell+purity%3A+crucial+aspects+of+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+for+spinal+cord+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair.</a> Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).</li>
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Os autores não têm nada a revelar.

O transplante de OEG em locais de lesão do CNS é considerado uma terapia promissora para lesão do CNS devido às suas propriedades pró-neuroregenerativas constitutivas7,8,9. No entanto, dependendo da fonte de tecido — mucosa olfativa (OM-OEG) versus lâmpada olfativa (OB-OEG)— ou a idade do doador, existe uma variação considerável nessa capacidade26,31,<sup clas...

Os neurônios do sistema nervoso central adulto (SNC) têm capacidade regenerativa limitada após lesão ou doença. Uma estratégia comum para promover a regeneração do SNC é o transplante, no local da lesão, de tipos celulares que induzem o crescimento axonal, como células-tronco, células schwann, astrócitos ou células ensheathing glia (OEG)1,2,3,4,5.
OEG deriva da crista neural6 e se localiza na mucosa olfativa e na lâmpada olfativa. No adulto, neurônios sensoriais olfativos morrem regularmente como resultado da exposição ambiental e são substituídos por neurônios recém-diferenciados. O OEG circunda e guia esses novos axônios olfativos para entrar na lâmpada olfativa e estabelecer novas sinapses com seus alvos no CNS7. Devido a esses atributos fisiológicos, o OEG tem sido utilizado em modelos de lesão de SNC, como lesão medular ou nervo óptico e suas propriedades neurorregenerativas e neuroprotetoras se tornamcomprovadas 8,9,10,11. Vários fatores foram identificados como responsáveis pelas características pró-regenerativas dessas células, incluindo a produção ou secreção de proteases de matriz extracelular ou secreção dos fatores de crescimento neurotrófico e axonal12,13,14.
Dadas as limitações técnicas para expandir as células primárias de OEG, estabelecemos e caracterizamos linhas clonais de OEG humano igênitas reversíveis (ihOEG), que fornecem um fornecimento ilimitado de OEG homogêneo. Estas células ihOEG derivam de culturas primárias, preparadas a partir de lâmpadas olfativas obtidas em autópsias. Eles foram imortalizados pela transdução da subunidade catalítica telomerase (TERT) e do oncogene Bmi-1 e modificados com o vírus SV40 grande antígeno T15,16,17,18. Duas dessas linhas celulares ihOEG são Ts14, que mantém a capacidade regenerativa das culturas originais e Ts12, uma linha regenerativa baixa que é usada como baixo controle de regeneração nesses experimentos18.
Para avaliar a capacidade de OEG para promover a regeneração axonal após lesão neural, vários modelos in vitro foram implementados. Nesses modelos, o OEG é aplicado a culturas de diferentes origens neuronais e formação de neurita e alongamento — em resposta à cocultura gliana — são avaliados. Exemplos dessas fontes neuronais são neurônios corticais neonatais de ratos19, feridas de arranhão realizadas em neurônios embrionários de ratos de tecido cortical20, explanações de retina de rato21,neurônios hipotalâmicos ou hipocampais22,23, neurônios gânglios de raiz dorsal de rato pós-natal24, neurônios do trato corticospinal do camundongo pós-natal25, neurônios NT2 humanos26, ou neurônios corticais cerebrais pós-natal em culturas de cicatriz de astrócito reativas27.
Nesses modelos, no entanto, o ensaio de regeneração conta com neurônios embrionários ou pós-natais, que têm uma plasticidade intrínseca que está ausente em neurônios adultos feridos. Para superar essa desvantagem, apresentamos um modelo de regeneração axonal adulta em coculturas de linhas de OEG com neurônios gânglios de retina adulta (RGNs), baseado no originalmente desenvolvido por Wigley et al.28,29,30,31 e modificados e usados pelo nosso grupo12,13,14,15,16,17,18,32,33. Resumidamente, o tecido retiniano é extraído de ratos adultos e digerido com papain. A suspensão das células de retina é então banhada em deslizamentos tratados com polilise ou em monocamadas Ts14 e Ts12. As culturas são mantidas por 96 h antes de serem fixadas e, em seguida, a imunofluorescência para proteínas axona (MAP1B e NF-H)34 e somatodendritic (MAP2A e B)35 marcadores são realizados. A regeneração axonal é quantificada como uma porcentagem de neurônios com axônio, em relação à população total de RGNs e o índice de regeneração axonal é calculado como o comprimento axonal médio por neurônio. Este protocolo não é apenas útil para avaliar o potencial neuroregenerativo do IhOEG, mas pode ser estendido a diferentes fontes de OEG ou outras células gliais.

<table><tbody><tr><td>anticorpo 514</td><td>Referência 34</td><td></td><td>Anti-soro policlonal de coelho, que reconhece MAP2A e B.</td></tr><tr><td>anticorpo SMI-31</td><td>BioLegend</td><td>801601</td><td>Anticorpo monoclonal contra as proteínas MAP1B e NF-H</td></tr><tr><td>anti-camundongo Alexa Fluor 488 anticorpo</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>anti-coelho Alexa Fluor 594 anticorpo</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>D,L-2-amino-5-ácido fosfonovalérico</td><td>Sigma</td><td>283967</td><td>Inibidor do receptor NMDA</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Núcleo coloração fluorescente</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td>Meio de cultura celular</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>11573397</td><td>Soro bovino fetal</td></tr><tr><td>FBS-Hyclone</td><td>Fisher Scientific</td><td>16291082</td><td>Soro bovino fetal</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Meio de montagem</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health (NIH-USA)</td><td></td><td>Software de imagem</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE17-605F</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Meio de cultura de células neuronais</td></tr><tr><td>Sistema de dissociação de papaína</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>Para uso em isolamento de células neurais</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Feito em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS-EDTA</td><td>Lonza</td><td>H3BE02-017F</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina / Anfotericina B</td><td>Lonza</td><td>17-745E</td><td>Extrato bacteriostático e bactericida</td></tr><tr><td>da hipófise</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td>Extrato de hipófise bovina</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina (PLL)</td> <td>Sigma</td><td>A-003-M</td><td></td></tr></tbody></table>

cocultura de neurônios de gânglio axotomizado de rato retinal com glia ensheathing olfactory, como um modelo in vitro de regeneração axonal adulta

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

As células de glia ensheathing olfativas (OEG) são localizadas desde a mucosa olfativa até e para a camada nervosa olfativa (ONL) da lâmpada olfativa. Ao longo da vida adulta, eles são fundamentais para o crescimento axonal de neurônios olfativos recém-gerados, da lamina propria ao ONL. Devido às suas propriedades pró-regenerativas, essas células têm sido usadas para promover a regeneração axonal em modelos de lesão medular ou nervo óptico.
Apresentamos um modelo in vitro para avaliar e medir a capacidade neurorregenerativa do OEG após lesão neural. Neste modelo, o OEG humano reversivelmente imortalizado (ihOEG) é cultivado como uma monocamada, as retinas são extraídas de ratos adultos e neurônios de gânglios retinais (RGN) são coculturados na monocamada OEG. Após 96 h, marcadores axonais e somatodendritic em RGNs são analisados por imunofluorescência e o número de RGNs com axônio e o comprimento/neurônio axonal médio são quantificados.
Este protocolo tem a vantagem sobre outros ensaios in vitro que dependem de neurônios embrionários ou pós-natais, que avaliam propriedades neuroregenerativas OEG no tecido adulto. Além disso, não é apenas útil para avaliar o potencial neuroregenera do ihOEG, mas pode ser estendido para diferentes fontes de OEG ou outras células gliais.

Neste protocolo, apresentamos um modelo in vitro para avaliar a capacidade neuroregenerativa de OEG após lesão neuronal. Como mostrado na Figura 1, a fonte OEG é uma linha de células clonal oeg humana imortalizada reversível -Ts14 e Ts12-, que deriva de culturas primárias, preparadas a partir de lâmpadas olfativas obtidas nas autópsias15,17,18. O tecido retiniano é extraído de ratos adultos, digerid...

Apresentamos um modelo in vitro para avaliar a capacidade neurorregenerativa de glia ensheathing glia (OEG), após lesão neural. Baseia-se em uma cocultura de neurônios gânglios de retina adulto axotomizados (RGN) em monocamadas OEG e estudo subsequente de regeneração axonal, analisando marcadores axonal e somatodendritic RGN.

Cocultura de Neurônios de Gânglio Axotomizado de Rato Retinal com Glia Ensheathing Olfactory, como um Modelo In Vitro de Regeneração Axonal Adulta

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

Nosso protocolo é um modelo simples e reprodutível para avaliar a capacidade de revestimento olfatório para promover a regeneração axonal adulta Esta é uma técnica quantitativa que permite a avaliação da capacidade regenerativa da glia de revestimento olfatório que também pode ser estendida a outros tipos de células gliais. Esta técnica é o primeiro passo para estudar o revestimento olfatório da glia como candidato à terapia celular em lesões do sistema nervoso antes da tradução para estudos in vivo ou clínicos. A demonstrar o procedimento estará Maria Portela, aluna de doutoramento do nosso laboratório.Para começar, prepare todas as mídias necessárias conforme descrito no manuscrito do texto. Depois de sacrificar o rato, coloque sua cabeça em uma placa de Petri de 100 mililitros e borrife-a com etanol 70% antes de colocá-la em uma capela de fluxo laminar. Corte os bigodes do rato com uma tesoura para que não interfiram na manipulação dos olhos.Segure o nervo óptico com uma pinça para puxar o globo ocular o suficiente para poder fazer uma incisão no olho com um bisturi. Remova o cristalino e o humor vítreo e retire a retina, mantendo as camadas restantes do olho dentro. Coloque a r

coculture-axotomized-rat-retinal-ganglion-neurons-with-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste protocolo, descrevemos um novo método para estudar a influência da heterogeneidade das células gliais no crescimento do axônio com...

Estudo Influência Heterogeneidade células gliais no crescimento Axon Usando um método de co-cultura New

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar os neurônios ganglionares da retina (RGNs) da retina de um rato e cocultivá-los com células da glia de revestimento olfativo (OEG). Este método permite estudar o potencial neuro-regenerativo dos OEGs após lesão neural.

Cocultura de neurônios ganglionares da retina com glia de revestimento olfativo

Este vídeo demonstra o modelo de cocultura de um explante de gânglio da raiz dorsal e células de Schwann. Em condições de cocultura, o ácido ascórbico promove a diferenciação das células de Schwann em formas mielinizantes. As células mielinizantes de Schwann envolvem os axônios várias vezes para criar uma bainha de mielina, que é essencial para a função nervosa.

Co-cultura de um explante de gânglio da raiz dorsal com células de Schwann para mielinização de neurônios

Fonte: Cheah, M., et al. Injeção do gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento da raiz dorsal como modelo para regeneração sensorial do axônio. J. Vis. Exp. (2017). Este vídeo demonstra um procedimento passo a passo para injetar uma suspensão viral nos gânglios da raiz dorsal (DRGs) e induzir uma lesão axonal controlada por meio de um esmagamento da raiz dorsal em um rato anestesiado. O protocolo envolve a exposição dos DRGs, a entrega de um vetor viral promotor de crescimento para...

Modelagem da regeneração sensorial do axônio em um rato usando injeção do gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento da raiz dorsal

Fonte: Portela-Lomba, M., et. al. Cocultura de neurônios ganglionares da retina de ratos axotomizados com glia de revestimento olfativo, como um modelo in vitro de regeneração axonal adulta. J. Vis. Exp. (2020). Este vídeo demonstra imagens e quantificação da regeneração axonal em neurônios ganglionares da retina (RGNs) de ratos axotomizados co-cultivados com células da glia olfativas humanas imortalizadas. Os RGNs são imunomarcados, com somas vermelhos e axônios verdes. As imagens foram...

Imagem e quantificação da regeneração axonal em neurônios ganglionares retinianos de ratos axotomizados

Células olfativas ensheathing (OECO) são células da crista neural que permitem o crescimento dos neurônios olfativos primários. Esta propriedade específica pode ser utilizado para transplantação celular. Apresentamos aqui um modelo de transplante celular baseado na utilização de OECs em um modelo de lesão do nervo laríngeo.

Transplante de células olfativas Ensheathing para avaliar a recuperação funcional após a lesão do nervo periférico

Modelos de cultura celular proporcionar um controle detalhado sobre as condições ambientais e, assim, proporcionar uma plataforma poderosa para elucidar vários aspectos da biologia celular neuronal. Nós descrevemos um método rápido, barato e confiável para isolar, dissociar e cultura neurônios sensoriais a partir de embriões de galinha. Os detalhes da preparação substratos e imunocitoquímica também são fornecidos.

Isolamento e Cultura de Dissociated neurônios sensoriais de Chick Embriões

Este protocolo apresenta o uso de uma injeção de gânglio da raiz dorsal (DRG) com um vetor viral e uma lesão concomitante por esmagamento da raiz dorsal em um rato adulto como modelo para estudar a regeneração sensorial do axônio. Este modelo é adequado para investigar o uso da terapia gênica para promover a regeneração sensorial do axônio.

Dorsal Root Injection gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento como um modelo para Sensorial Axon Regeneração

No sistema de cocultura dos gânglios da raiz dorsal e células de Schwann, a mielinização do sistema nervoso periférico pode ser estudada. Este modelo oferece oportunidades experimentais para observar e quantificar a mielinização periférica e estudar os efeitos de compostos de interesse sobre a bainha de mielina.

Mielinização in vitro de axônios periféricos em cocultura de explantes de gânglios dorsais de rato e células de Schwann

Aprenda a avaliar a capacidade neuroregenerativa da glia envoltória olfatória em neurônios de gânglio retinal axotomizados de rato adulto. Este modelo in vitro quantitativo permite estudar interações neuronais e potencial terapêutico em lesões do sistema nervoso.

Cocultura de Neurônios de Gânglio Axotomizado de Rato Retinal com Glia Ensheathing Olfactory, como um Modelo In Vitro de Regeneração Axonal Adulta (Vídeo) | JoVE Journal

Cocultura de Neurônios de Gânglio Axotomizado de Rato Retinal com Glia Ensheathing Olfactory, como um Modelo In Vitro de Regeneração Axonal Adulta

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